Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Dimitrios N. Vatakis; Gregory C. Bristol; Sohn G. Kim; Bernard Levin; Wei Liu; Caius G. Radu; Scott G. Kitchen; Jerome A. Zack

doi:10.3791/4181

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Artigo de método

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

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DOI:

10.3791/4181

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18 de dezembro de 2012

Dimitrios N. Vatakis¹^,²^,³ , Gregory C. Bristol¹^,² , Sohn G. Kim¹^,² , Bernard Levin¹^,² , Wei Liu⁴ , Caius G. Radu⁴ , Scott G. Kitchen¹^,²^,³ , Jerome A. Zack¹^,²^,⁵

¹Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²UCLA AIDS Institute, ³Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, ⁴Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁵Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

Neste artigo

Resumo

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Resumo

Modelos de pequenos animais, como ratos têm sido amplamente utilizados para estudar a doença humana e ao desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. Apesar da riqueza de informação obtida a partir destes estudos, as características únicas de imunidade do rato, assim como a especificidade de espécie de doenças virais, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), levou ao desenvolvimento de modelos de ratinhos humanizados. Os modelos anteriores envolveram a utilização de C. B 17 scid / scid ratos e o transplante de timo fetal humano e de fígado fetal denominados tua / liv (SCID-hu) ^{1, 2} ou a transferência adoptiva de leucócitos do sangue periférico humano (huPBL-IDCG ) ^3. Ambos os modelos foram utilizados principalmente para o estudo da infecção por HIV.

Uma das limitações principais de ambos os modelos foi a falta de reconstituição estável de células imunitárias na periferia para torná-los um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a doença de HIV. Para este fim, o zumbido BLTmodelo do rato anized foi desenvolvido. BLT significa medula óssea / fígado / timo. Neste modelo, de 6 a 8 semanas de idade NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratinhos imunocomprometidos receber o implante tua / liv como no modelo de ratinho SCID-hu apenas a ser seguido por um segundo transplante de células-tronco hematopoiéticas humanas ^4. A vantagem deste sistema é a reconstituição completa do sistema imune humano na periferia. Este modelo foi utilizado para estudar a infecção por HIV e de latência ^5-8.

Nós geramos uma versão modificada do modelo em que usamos geneticamente modificados células-tronco hematopoiéticas (HHSC) para construir o implante teu / liv seguido de injeção de transduzidas autólogo HHSC ^{7, 9.} Esta abordagem resulta na geração de linhagens geneticamente modificados. Mais importante ainda, adaptou-se este sistema para examinar o potencial de gerar funcionais As células T citotóxicas (CTL) que expressam um receptor de melanoma de células T específico. Usando esse modelo, pudemos avaliar a funcionalidade do nosso CTL transgênico vivo utilizando tomografia por emissão de tomografia (PET) para determinar a regressão do tumor (9).

O objetivo deste protocolo é o de descrever o processo de gerar esses camundongos transgênicos e avaliação de eficácia in vivo utilizando imagens de PET ao vivo. Como uma nota, uma vez que usamos tecidos humanos e vetores lentivirais, nossas instalações estão em conformidade com as diretrizes do CDC NIH para o Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +). Além disso, os ratos do NSG são severamente imunocomprometidos, assim, a sua habitação e manutenção devem estar de acordo com os mais elevados padrões de saúde ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocolo

A. Geração de ratos BLT

A geração de ratinhos BLT é dividido em três (3) partes: (1) de processamento de tecido fetal e preparação de CD34 humano de células-tronco hematopoiéticas, (2) transplante de tecido humano, e (3) transplantação secundária. Para todos os protocolos, fornecemos Tabela 1 com os dados de reagente.

1. Processamento de tecidos e Isolamento de CD34 Células-Tronco Hematopoéticas

Tecido fetal ou tecido fresco enviado durante a noite em gelo a partir de vários órgãos de aquisição de órgãos pode ser usado. Muitas vezes o tecido fetal não é estéril, como ev....