High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Summary

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

Abstract

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de ^1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos ^3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de ^4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir.

O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia ^6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS).

Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl ⁺⁾ fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto ^7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K ⁺ de poro para o composto aparentado ⁺ K ⁺ Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl ⁺ corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl ⁺ através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl ^+: BTC, FluoZin-2, e FluxOR ^7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl ^+. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível ^7,8 e continuaram a fazê-lo ^9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl ⁺ facilmente permeia a maioria dos canais de K ^+, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K ⁺ channel.

Protocol

1. A geração de linhas celulares estáveis ​​policlonais

1. O estabelecimento de uma linha de células de alta qualidade estável expressando o canal Kir de interesse é um primeiro passo importante para o desenvolvimento de um ensaio de rastreio de alto rendimento robusto. Constitutivo K ⁺ superexpressão do canal pode conduzir a activação de vias de morte celular, degeneração linha estável de células e perda de desempenho do ensaio. Para evitar estes problemas potenciais e proporcionar um controlo conveniente para o desenvolvimento interno do ensaio (ver abaixo), um sistema de expressão induzível por tetraciclina é recomendado ^8.
2. ....

Results

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl ⁺ fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base utilizados para .......

Discussion

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F _0. Isto é vulgarmente referido como o "índice estático" e simbolizado "F / F ^_0". Nos casos em que F ₀ é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desuniformidades em ilum.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetraciclina-vector de expressão indutível
T-rex-células HEK293	Invitrogen	R71007	Tetraciclina induzível por linha celular
Lipofectamine Reagente LTX / Plus	Invitrogen	15338100	Reagente de transfecção
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Meios de cultura de células
DMEM	Invitrogen	11965	Meios de cultura de células
Higromicina B	Invitrogen	10687-010	Meios de cultura de células
Blasticidina S	Invitrogen	R210-01	Meios de cultura de células
Penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15140	Meios de cultura de células
HBSS-bivalente livre	Mediatech	21022CV	Lavagem de células
Tripsina 0,25%	Mediatech	25053CI	Dissociação celular
Tetraciclina-HCl	Sigma	T9823	Reagente indução
FBS dialisado	ATLANTA Biologicals	S12650	Meios seletivos
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Corante fluorescente
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Corante de carga
HBSS	Invitrogen	14175	Tampão de ensaio
HEPES	Invitrogen	15630	Tampão de ensaio
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl + estímulo tampão
MgSO4	Sigma	M2643	Tl + estímulo tampão
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + estímulo tampão
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl + estímulo tampão
Sulfato de tálio	Aldrich	204625	Tl + estímulo tampão
HEPES	Sigma	H4034	Tl + estímulo tampão
DMSO	Sigma	D4540	Solvente
Oito canais pipetador eletrônico	Biohit	E300	Chapeamento de celular em 384 -placas de poços
BD PureCoat amina revestidos 384 poços	BD Biosciences	356719	Microplacas de ensaio
Eco qualificados 384-Bem polipropileno microplaca (384PP)	Labcyte	P-05525	Fonte microplacas compostos
384-poços de microplacas de polipropileno	Greiner Bio-One	781280
Dispensador de reagente Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
ELx405 lavadora	BioTek	ELx405HT	Lavagem de células automatizado
Echo manipulador líquido	Labcyte	Labcyte Eco 550
Bravo plataforma automatizado de manuseamento de líquidos	Agilent Technologies	Modelo padrão
Hamamatsu 6000 FDSS	Hamamatsu		Cinética de imagem placa leitor