Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

Resumo

CRISPR / Cas sistemas mediato imunidade adaptativa em Bacteria e Archaea. Muitas proteínas Cas são propostos para agir como endoribonucleases actuam sobre precursores crRNA de comprimento variável. Aqui, ilustramos três abordagens diferentes para gerar pré-crRNA substratos para a análise bioquímica da actividade de endonuclease Cas.

Resumo

A interação do vírus e seus hospedeiros procarióticos moldaram a evolução da vida de bactérias e Archaea. Procariotos desenvolveram várias estratégias para evitar ataques virais que incluem a modificação restrição, infecção abortiva e CRISPR / Cas sistemas. Estes sistemas adaptativos imunes encontrados em muitas bactérias e mais Archaea consistem em c Abrilhantado r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) e um número de sequências de C RISPR como associada (Cas) genes (Fig. 1) ^1-3. Conjuntos diferentes de proteínas Cas e repete definir pelo menos três grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas ^4. As proteínas e universais CAS1 CAS2 são propostas a serem envolvidas na absorção do DNA viral quegerará um elemento espaçador entre duas repetições na extremidade 5 'de um cluster CRISPR estendendo ^5. O conjunto inteiro é transcrito em um precursor crRNA contendo todos espaçador e sequências de repetição e é posteriormente processado por uma enzima da família Cas6 diversificada em crRNAs menores ^6-8. Estes consistem crRNAs da sequência flanqueada por um espaçador 5 'terminal (8 nucleótidos) e um 3' terminal de tag derivada da sequência de repetição ^9. A infecção repetida do vírus pode agora ser bloqueada como o crRNA novo será dirigido por um complexo de proteína Cas (Cascade) para o ADN virai e identifica-o como tal através da complementaridade de base ^10. Finalmente, para CRISPR / Cas tipo 1 sistemas, o CAS3 nuclease vai destruir o invasor detectado ADN ^11,12.

Esses processos definem CRISPR / Cas como um sistema imune adaptativo de procariotas e aberto um campo de pesquisa fascinante para o estudo das proteínas envolvidas Cas.A função de muitas proteínas Cas ainda é evasivo e as causas da aparente diversidade dos sistemas CRISPR / Cas continuam a ser iluminado. Atividades potenciais da maioria das proteínas Cas foram previstos através de análises detalhadas computacionais. A maior fracção de proteínas Cas ou são mostrados ou propostas para funcionar como endonucleases ^4.

Aqui, apresentamos métodos para gerar crRNAs e precursor-CRNAs para o estudo da endoribonucleases Cas. Os ensaios de endonucleases diferentes requerem sequências de repetição ou curtas que podem ser directamente sintetizados como oligonucleótidos de ARN ou sequências mais crRNA e pré-crRNA que são geradas in vitro por meio de polimerase de ARN de T7 a transcrição run-off. Esta metodologia permite a incorporação de nucleótidos radioactivos para a produção de substratos de endonuclease internamente marcadas e da criação de crRNAs sintéticos ou mutante. Cas6 actividade endonuclease é utilizado para pré-crRNAs amadurecer em crRNAs com 5'-hidroxilo e um 2 ', 3'-terminais cíclicos fosfato.

Protocolo

1. Geração de tempo pré-crRNA substratos via PCR

1. Iniciadores de PCR projeto de segmentação das regiões espaçadoras de um cluster CRISPR. Adicionar a polimerase de ARN T7 (T7RNAP) sequência promotora (5 '-taatacgactcactata-3') para o iniciador directo e sítios de restrição para a clonagem do produto de PCR em um vetor de ambos os iniciadores (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19, fig. 2A) .
   Nota: O T7RNAP requer um resíduo de guanidina para a iniciação da transcrição adequada.
2. Amplificar a seqüência de pré-crRNA de interesse do DNA genômico por PCR.
3. Separar os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose e gel de extrair a banda desejada. Digerir o produto de PCR com as enzimas de restrição para criar extremidades coesivas (por exemplo, BamHI e HindIII, fig. 2A). Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR para eliminar a clivagem subprodutos.
4. Defina-se uma reacção de ligação que contém ADN-ligase de T4, tampão de ligase T4 DNA euma relação molar de 3:1 do produto de PCR clivado e o vector linear desfosforilada pUC com as correspondentes extremidades coesivas. Incubar a mistura a 16 ° C durante a noite. Transformar a mistura de ligação em células competentes de Escherichia coli DH5a por protocolos padrão e utilizar rastreio azul branco para identificar a ligação bem sucedida.
5. Isolar os plasmídeos de colónias brancas, utilizando um kit de preparação de plasmídeo. Identificar os clones positivos por sequenciação de plasmídeo. Alternativamente, colónia PCR pode ser utilizado para o rastreio.

2. Geração de intermediário pré-crRNA substratos através de emparelhamento de oligonucleótidos de DNA

1. Projetar para a frente e para trás oligonucleotídeos com o desejado CRISPR sequência de repetição / espaçador. Os oligonucleótidos contêm a sequência de um promotor T7 RNAP assim como sítios de restrição terminais (por exemplo, BamHI e HindIII para pUC19). Encerrar os oligonucleótidos de forma a assegurar que as extremidades pegajosas após recozimento (ver fig. 2B ).
2. 5'-fosforilam nmol 1 de cada oligonucleótido numa reacção separada 20 uL contendo 5 uL de quinase de polinucleótidos de T4 (PNK), 2 uL de tampão PNK 10x T4, 2 ul de ATP (10 mM). Incubar cada amostra durante 1 hora a 37 ° C.
3. Hibridizar os dois oligonucleótidos fosforilados. Combinar 1 ul da mistura de oligo fosforilado para a frente (a partir de 2.2.), 1 ul da mistura inverso fosforilado oligo (a partir de 2.2.), 1 ul de tampão de T4 ADN ligase 10x numa reacção de 10 jil. Incubar as amostras durante 5 min a 95 ° C num bloco de aquecimento ou em água a ferver, desligar a fonte de calor e deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente (~ 2-3 horas).
   Nota: Neste passo crítico, o processo de arrefecimento lento favorece a hibridação dos dois oligonucleótidos em comparação com a formação de estruturas dentro de cada um único oligonucleótido.
4. Ligadura 4 ul da mistura de hibridação, 1 ul de digerido e desfosforilado vector pUC (0,1 ug /ul) com ligase de ADN de T4, tampão de ligase T4 de ADN 10x e 10 mM de ATP em uma mistura de ligação 20 ul. Incubar a amostra a 16 ° C durante a noite.
5. Transforme os plasmídeos ligados em células de Escherichia coli competentes DH5ct por protocolos padrão e utilizar triagem branco azul. Isolar os plasmídeos e identificar os clones positivos por digestão (para a tela para inserções com o tamanho desejado) e sequenciação de plasmídeo subsequentes.

3. Geração de curto Cas substratos RNA via síntese de oligonucleótidos RNA personalizado

Projeto de curto Cas RNA substratos (por exemplo, seqüências de repetição simples, fig. 2C) e utilizar personalizados RNA instalações de síntese de oligonucleotídeos.

Nota: A inclusão de um desoxirribonucleótido a uma posição definida de um oligonucleótido de ARN (Fig. 2C), pode ser utilizado para identificar o local de clivagem de ARN.

4. In vitro T7 transcrição de ARN-polimerase

1. Isolar os plasmídeos com o constructo concebido (a partir de 1.9. Ou 2.7.) Utilizando um kit de purificação de maxiprep de plasmídeo.
2. Linearizar o plasmídeo com a enzima de restrição que cliva a jusante do fragmento clonado (por exemplo, Hind III). Assegurar uma digestão completa.
   Nota: Se um 3 divergente definido 'terminus do transcrito de RNA é desejada, o constructo concebido deve conter um sítio de restrição adicional específico para "run-off" da transcrição a montante da sequência HindIII.
3. Purifica-se o plasmídeo linearizado por fenol: clorofórmio (1:1) e precipitação com etanol. Recuperar os ácidos nucleicos por ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril.
4. Configurar uma in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição que contém 40 mM de Hepes / KOH (pH 8), 22 mM _MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM de espermidina, 4 mM de cada nucleósido-trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml de digeridoplasmídeo e 0,1 mg / ml de T7 RNAP em água tratada com DEPC. Incubar 3 horas a 37 ° C.
5. Analisar as transcrições de RNA obtidos sobre um gel de poliacrilamida desnaturante ureia 8 M 12% (Fig. 3A). Os transcritos de RNA pode ser purificado através de aniões Mono Q cromatografia de troca ¹³ e recuperado por precipitação com etanol das fracções de RNA e de ressuspensão do sedimento em água tratada com DEPC estéril. No futuro, a armazenar o RNA a -80 ° C.

5. Cas6 ensaio endonuclease

1. Configurar uma 20 pi in vitro T7 RNAP correr mistura de transcrição (ver 4.4), que contém uma quantidade reduzida de 2 mM ATP e é complementado com 2,5 ul ^α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifica-se os produtos da reacção por meio de extracção a partir de um gel desnaturante de ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar as bandas por autorradiograf ia.
2. Produzir e purificar as proteínas recombinantes desejados Cas. Neste exemplo, CAS6 de Clostridium thermocellum foi purificado por meio de calor de precipitação e cromatografia de Ni-NTA.
3. Defina-se uma reacção de digestão com endonucleases (por exemplo, para Clostridium thermocellum Cas6, a mistura reaccional contém 20 mM de Hepes (KOH pH 8), 250 mM de KCl, 2 mM _de MgCl2, 1 mM DTT, 12000 cpm de substrato de ARN e 1 uM de enzima e incubou-se a 37 ° C durante 30 min).
4. Carregar 5 uL da mistura de reacção (+ 10 ul de tampão de carregamento de RNA contendo 95% de formamida) em ureia 8 M em gel de poliacrilamida a 12%. Visualizar os produtos de clivagem, após eletroforese através de autorradiografia.

6. Resultados representativos

Um exemplo de substratos de RNA para análise de actividade de endonuclease Cas é mostrado na Figura 3A. Uma parte alíquota de 5 ul de uma pi 100 analítico in vitro da reacção de transcrição foram carregados. Por favor note que a eficiência da produção de RNA varia entre diferentes construções. Alguns fatores tchapéu foram observados para influenciar a quantidade de RNA obtidos são (i) a sequência que se segue imediatamente a G 1 necessária para a iniciação da transcrição, (ii) a possibilidade de formação de estruturas de RNA durante a transcrição e (iii) a escolha do local de restrição para a geração da posição de clivagem segundo turno.

A investigação da actividade de endonuclease RNA requer tanto recombinante altamente purificada Cas proteínas (Fig. 3B) e controlos negativos apropriados. Idealmente, esta amostra de controlo negativo difere tão pouco quanto possível a partir da reacção investigada endonuclease Cas. Isto pode ser alcançado através da incubação do RNA com o tampão de reacção e lisado de células sem expressão Cas (e seguindo o procedimento de purificação idêntico). Um controle negativo ideal é a adição de um desoxirribonucleótido no local de clivagem proposto. Na Figura 3C, a clivagem de uma sequência de repetição 5 'terminal marcado é mostrado por Clostridium thermocellum Cas6. Em condições idênticas, esta repetição não é um substrato mais quando é introduzido um desoxirribonucleótido na posição -9. Este método também fornece informações sobre o local de clivagem. Finalmente, um longo internamente marcada pré-crRNA é clivada por Cas6 e dois fragmentos de clivagem são observados.

Figura 1. Visão esquemática CRISPR / Cas atividade. A síntese segue a inserção de uma sequência de ADN viral (protospacer) para o cluster CRISPR (de adaptação), a transcrição e processamento da matriz CRISPR em crRNAs pequenas por uma endonuclease Cas6, a absorção de crRNAs no complexo da cascata e a interferência de um repetido ataque viral, baseada na complementaridade entre crRNA e protospacer. Motivos Protospacer adjacentes (PAM) seqüências protospacer marca virais.

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Figura 2. Geração de RNA substratos para Cas proteínas. O esquema mostra o fluxo de trabalho para a geração de (A) de comprimento pré-crRNA substratos, (B) intermédia pré-crRNA substratos e (C) de curto Cas RNA substratos para a produção de pré-crRNA. Seqüências de exemplo são apresentados para a matriz CRISPR de Clostridium thermocellum. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Cas6 a digestão com endonucleases. A.) em gel de poliacrilamida de toluidina azul manchado de um oligonucleótido de ARN de design personalizado (250 pmol) e dois transcritos de RNA in vitro (5 ul de uma reacção de 100 uL típico). B.) SDS-PAGE em gel de uma preparação Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum depois calorprecipitação a 50 ° C durante 1 hora e cromatografia de Ni-NTA. C.) A detecção da actividade Cas6 endonucleolítica para 5 'terminal de sequências de repetição rotulados e pré-crRNA transcritos in vitro. A introdução de um dNTP na posição -9 abole Cas6 clivagem do substrato por um curto RNA Cas (S, fig. 2C). A 5 'terminal 8 tag nt é também gerada para crRNA maturação de longa pré-crRNA substratos (L, fig. 2A). As bandas foram separados num 8 M ureia em gel de poliacrilamida desnaturante a 12% e visualizados por autorradiografia.

Discussão

Os métodos apresentados permitem a geração de substratos Cas endonucleases de gamas de tamanhos diferentes e com diferentes liberdade no desenho sequência. A abordagem mais simples e direta para a geração de substratos de oligonucleótidos sintéticos de ARN está limitada a designs de ARN curtos devido ao aumento dos custos e as limitações técnicas na criação de oligómeros mais longos de RNA. Enquanto a síntese de RNA de sucesso tem sido relatado para oligómeros não modificados de RNA de nucleótidos ao longo do comprimento de 100, o máximo prático e económico para a síntese de RNA personalizado está abaixo de 40 nucleótidos. No entanto, qualquer dada sequência pode ser sintetizado e a introdução orientada dos nucleótidos modificados (por exemplo, desoxirribonucleótidos) pode ser utilizada para analisar locais de clivagem em detalhe. Mais longos de pré-CRNAs deve ser gerada através de transcrição in vitro.

O recozimento de oligonucleótidos que contêm um promotor de ARN-polimerase de T7 permite a produção de comprimento intermédio pré-CRRNComo. O comprimento máximo de rotina e economicamente oligonucleótidos de ADN sintetizadas está apenas acima de 150 nucleótidos e representa o máximo de síntese pré-crRNAs através deste método. A montagem dos vários pares de oligonucleótidos de ADN hibridados que formam extremidades coesivas com o outro pode estender este comprimento máximo mas necessita desafios crescentes na clonagem do construto. A principal vantagem deste método é a capacidade para gerar pré-crRNA construções (e, portanto, Cas endonuclease substratos) com qualquer sequência desejada. Isto permite que o teste de modelos crRNA sintéticos.

Finalmente, os pré-crRNAs maiores podem ser obtidos a partir de PCR amplificados de elementos genómicos CRISPR inteiras ou fracções dos mesmos. Alterações ao modelo in vitro de transcrição do plasmídeo pode ser introduzido, através de mutagénese dirigida para a produção de pré-crRNA variantes. Estas construções podem ser usadas para analisar o padrão de clivagem endonucleolítica mundial dentro de um inteiropré-crRNA.

O trabalho pioneiro para a produção de ARN não modificado através de T7 RNA polimerase de transcrição in vitro foi baseada em RNAs de transferência ¹⁴ e do vírus do mosaico brome RNA ^15. O consenso do promotor T7 RNA polimerase consiste de um domínio de reconhecimento (-17 a -5) e um domínio de iniciação (-4 através +6) com o início da transcrição em um guanosina essencial um ^16. Posições jusante de um pode ser variada o que permite a transcrição de quase qualquer sequência de ARN desejado. Os métodos apresentados para a geração de modelos in vitro run-off de transcrição permitir a síntese in vitro de completos pré-crRNAs que correspondem regiões genômicas CRISPR ou sintéticos pré-crRNA variantes. As transcrições são gerados com um presente trifosfato 5'-terminal, a menos que a reacção de transcrição é iniciada com GMP para se obter 5 'monofosfato de terminais ^14. Esses terminais são necessários se as transcrições devem ser rotuladoscom polinucleótido-quinase de T4 e ^γ-[32 P]-ATP. A actividade de clivagem de Cas6 e Cas6 enzimas semelhantes gera crRNA que contêm 5'-hidroxilo e um grupo 2 ', 3'-terminais cíclicos fosfato. Estes RNAs podem então ser analisados ​​para o reconhecimento pelo complexo de cascata.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Antártida Fosfatase	NEB	M0289L
Transcrição in vitro de grau Ultrapure Trisfosfatos Nucleotide	Jena Bioscience	NU-1010 - NU-1013
Cromatografia líquida, ktapurifier 100	GE Healthcare
Os oligonucleótidos de DNA	MWG Operon
Oligonucleotídeos de RNA	MWG Operon
Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Rotação Miniprep Kit	QIAGEN	27106
Kit Plasmid Maxi	QIAGEN	12163
BamHI	NEB	R0136L
HindIII	NEB	R0104L
Ligase de ADN de T4	NEB	M0202S
Quinase de polinucleótido T4	Ambion	AM2310
T7 RNA polimerase	própria preparação
Mix Solução desoxinucleotídeo	NEB	N0447L
Mini-PROTEAN Sistema de Electroforese Tetra	Bio-Rad	165-8001
Scanner Tempestade 840	GE Healthcare	163723
Armazenamento Phosphorscreen	Molecular Dynamics	63-0034-81
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	NEB	M0530L	usar o tampão GC
Azul de Toluidina	Sigma	T3260
pUC19	NEB	N3041S
γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP	Hartmann Analítica	SRP-401, SRP-307