Artigo de método

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

DOI:

10.3791/4282

⸱

23 de abril de 2013

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

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Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Resumo

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Os sensores electroquímicos são amplamente usados ​​para a medição rápida e precisa da glucose sanguínea e pode ser adaptado para a detecção de uma ampla variedade de analitos. Sensores eletroquímicos operam por transdução de um evento de reconhecimento biológico em um sinal elétrico útil. A transdução do sinal ocorre por acoplamento a actividade de uma enzima de redox a um eléctrodo amperométrico. Especificidade do sensor ou é uma característica inerente da enzima, oxidase de glucose, no caso de um sensor de glicose, ou um produto de ligação entre a enzima e um anticorpo ou sonda.

Aqui, descrevemos um método de ensaio sensor eletroquímico para detectar diretamente e identificar bactérias. Em todos os casos, as sondas aqui descritas são oligonucleótidos de ADN. Este método é baseado na hibridização sanduíche de captura e detector sondas com alvo ribossomal RNA (rRNA). A sonda de captura é ancorada à superfície do sensor, enquanto que a sonda é ligada ao detector de horseradish peroxidase (HRP). Quando um substrato, tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) é adicionada a um eléctrodo com complexos de captura-alvo de detectores ligados à sua superfície, o substrato é oxidado por HRP e reduzido pelo eléctrodo de trabalho. Este ciclo redox resultados em vaivém de elétrons pelo substrato do eletrodo para HRP, produzindo o fluxo de corrente no eletrodo.

Introdução

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Usando rRNA como uma molécula alvo para a detecção e identificação de bactérias tem um número de vantagens. A abundância de rRNA em células bacterianas estabelece um limite de sensibilidade tão baixo como 250 bactérias por mililitro, sem a necessidade de amplificação de um alvo. RRNA bacteriano contém seqüências específicas de espécies únicas que são acessíveis a hibridização com sondas de DNA. Consequentemente, uma série de sensores electroquímicos podem ser usadas para identificar as bactérias desconhecidos, em que cada sensor é funcionalizada com uma sonda de captura específica da espécie diferente. Sensores de controlo positivo deve ser incluído para um alvo oligonucleotídeo sintético que "pontes" a captura e sondas de detecção para criar um sinal de calibração interno.

Os sensores electroquímicos têm uma ampla gama de aplicações de pesquisa básica e translacional. Por exemplo, o ensaio aqui descrito foi usado para medir com precisão o efeito da E. coli em fase de crescimento RRNA e números de cópias pré-rRNA, que é de grande interesse para pesquisadores interessados ​​em fisiologia bacteriana 2. A sensibilidade do ensaio sensor electroquímico é determinado pela relação sinal-ruído. Uma variedade de métodos de amplificação de sinal e de redução do ruído ter sido explorado. Descobrimos que a melhoria da química da superfície do sensor é essencial para reduzir a ligação não específica da sonda detectora e / ou enzima HRP. Em particular, numa monocamada mista de alkanedithiols e mercaptohexanol foi encontrada para reduzir o fundo, cobrindo a superfície do eléctrodo de forma mais completa, mantendo a acessibilidade da sonda de captura para a hibridação alvo 3. Estes tratamentos químicos de superfície, são particularmente importantes para os ensaios em amostras biológicas complexas.

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Protocolo

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1. Funcionalização de sensores eletroquímicos

  1. Prepare a sonda de captura tiolada a uma concentração de 0,05 mM em 300 mM de 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 1 mM e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 min . A incubação da sonda de captura tiolado com HDT garante que o grupo tiol na sonda de captura é reduzido, o que resulta em resultados mais consistentes.
  2. Aplicar uma corrente de azoto a 16 de chip sensor array nua ouro (s) durante 5 segundos para remover a humidade e / ou partículas.
  3. Aplicar 6 ul da mistura de sondas de captura de HDT-tiolado para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores da cortina de sensores e armazenar o chip sensor (es) numa placa de Petri cobertas a 4 ° C durante a noite. Sondas de captura tiolados ligar diretamente para o eletrodo de ouro nu eo HDT age para evitar excesso de embalagem das sondas de captura e mantê-los em uma conformação estendida que promove a hibridação com o alvo.
  4. Oapós o dia, lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
  5. Aplicar 6 ul de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 50 min. Esta e todas as incubações subsequentes chips sensores são realizados numa caixa de Petri coberta, à temperatura ambiente. MCH actua como um agente de bloqueio, preenchendo todas as lacunas onde a sonda de captura tiolada ou HDT não está presente na superfície do eléctrodo.

2. Preparação da Amostra

  1. Transferir 1 ml de uma cultura bacteriana em fase logarítmica de crescimento (DO600 ≈ 0,1) a um tubo de microcentrifugação e centrifugar a 16000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante da cultura. A pelete bacteriana podem ser processados ​​imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso posterior.
  2. Ressuspender cuidadosamente o sedimento bacteriano em 10 ul de NaOH 1 M aplicando a ponta da pipeta para o bottom do tubo de microcentrífuga e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar a suspensão à temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Neutralizar o lisado bacteriano por adição de 50 ul de 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,25 mM de uma sonda detectora de fluoresceína modificado. Incubar o lisado neutralizado durante 10 min à temperatura ambiente. Detector de sondas Fluoresceína modificados hibridam com as moléculas-alvo rRNA bacteriano.

3. Sensor eletroquímico Assay

  1. Lavar o MCH a partir do chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
  2. Aplicar 4 ul de ligado bacteriano neutralizada para o eléctrodo de trabalho de cada um dos sensores 14 e incubar durante 15 min. Complexos sonda-alvo detector de hibridizar imobilizadas sondas de captura tiolados.
  3. Aplicar 4 pi de 1 nM de extrapolação oligonucleótido em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 2,5% de BSA e 0,25 μ M fluoresceína modificado sonda detectora de dois sensores de controlo positivo (utilizados para a normalização do sinal) e incubar durante 15 min.
  4. Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
  5. Aplicar 4 ul de 0,5 U / mL de anti-fluoresceína-HRP em 1 M de tampão fosfato, pH 7,2, contendo 0,5% de caseína para o eléctrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incubar durante 15 min. O anti-fluoresceína-HRP liga-se às sondas imobilizadas detector fluoresceína modificados.
  6. Lavar o chip sensor com H2O desionizada durante 2-3 segundos e seco sob uma corrente de azoto durante 5 seg.
  7. Aplicar uma camada bem adesivo na superfície do chip sensor e montagem de carga para o chip sensor. Pipetar 50 ml de substrato TMB em todos os 16 sensores e feche a montagem chip sensor.
  8. Obter amperometria e medidas de voltametria cíclica para todos os 16 sensores usando o Helios Leitor Chip. Corrente amperométrica é proporcional à taxa de TMB redução na superfície do sensor (veja a Figura 1).

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Resultados

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Descreve-se um doseamento electroquímico que é estruturado de forma semelhante a uma sanduíche de ELISA. Como mostrado na Figura 1, a hibridação de ARN alvo ribossomal (ARNr), com as sondas de captura e detector é desenvolvido por uma reacção redox catalisada por HRP conjugado com fragmentos de anticorpo anti-fluoresceína que se ligam à extremidade 3 'de fluoresceína de ligação na sonda do detector. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química da superfície do eléctrodo de ouro. Desco...

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Discussão

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O ensaio sensor electroquímico aqui descritos permite uma rápida detecção de alvos de ácido nucleico. Sensibilidade e especificidade dependerá em parte da energia livre de hibridização sonda-alvo, o que por sua vez depende do comprimento e do teor de GC de captura e as sondas de detecção. Normalmente, efectuar os passos de hibridação à temperatura ambiente (~ 20 ° C), 5, 6. No entanto, os passos de hibridação (3.2 e 3.3) também pode ser realizada a temperaturas elevadas num forno de hibridação se o chip é col...

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Divulgações

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Todos os autores são inventores em patentes relevantes com os métodos descritos. Uma dessas patentes foi licenciada para Qvella Corporation. BMC e DAH tem participação acionária na Qvella Corporation. VG é o Presidente da GeneFluidics, que é a fabricante do chip matriz de sensores eletroquímicos, montagem de chip e leitor de chip descrito neste artigo.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelo Acordo de Cooperação Award AI075565 (a DAH) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e pelo Fundo de Wendy e Ken Ruby for Excellence in Pediatric Urology Research. BMC é a Judith e Robert Winston cadeira de Urologia Pediátrica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
6-mercapto-1-hexanol (MCH)Sigma451088Armazenar à temperatura ambiente
1,6-hexanedithiol (HDT)SigmaH-12005Armazenar à temperatura ambiente
Sondas de captura tioladaOperonN/AArmazenar a 100 μ M em 0,1x TE a -20 &graus; C
Sondas detectoras modificadas com fluoresceínaOperonN/AArmazenar a 100 μ M em 0,1x TE a -20 &graus; C
Ponte OligonucleotídeoOperonN/AArmazenar a 100 μ M em 0,1x TE a -20 &graus; C
Anti-Fluoresceína-HRP, fragmentos de FabRoche11 426 346 910Armazenar em 4 ° C
Helios Chip ReaderGeneFluidicsGFR-2009
Sensor Chip MountGeneFluidicsGFR-003
Adesivo de filme bemGeneFluidicsEnviado com chips de sensor
Chips de matriz de 16 sensores de ouro nu GeneFluidicsSC1000-16X-BArmazenar em 100% N2 à temperatura ambiente
Albumina de soro bovinoSigmaA7906Loja em 4 ° Tampão
de fosfato C 1M, pH 7,2 0,35M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, ajustado para pH 7,2
Bloqueador de caseína em PBS Pierce37528Diluir com um volume igual de tampão de fosfato 1M, pH 7,2, armazene a 4 graus; C
Tabela 1. Reagentes e Equipamentos.

Referências

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