Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.
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Artigo de método
Modelo rato ortotópico de câncer colorretal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O modelo tradicional tumor subcutâneo é menos do que ideal para estudar o câncer colorretal. Modelos de ratos ortotópico de câncer colorretal, que apresentam células cancerosas em crescimento em sua localização natural, replicar a doença humana com alta fidelidade. Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer este modelo. Ambas as técnicas são semelhantes, e requer anestesia mouse e laparotomia para exposição do ceco. Uma técnica envolve a injeção de uma suspensão de células do câncer colorretal na parede cecal. As células cancerosas são primeiramente cultivadas na cultura, colhidas quando confluentes e preparado como uma suspensão única célula. Um volume pequeno de células é injetado lentamente para evitar fugas. A outra técnica envolve o transplante de uma peça de tumor subcutâneo para o ceco. Um rato com um tumor colorretal previamente estabelecidos subcutânea é eutanásia eo tumor é removido utilizando técnica estéril. A peça de tumor é dividido em pequenos pedaços para transplante para outro mouse. Antes do transplante, a parede cecal é levemente danificada para facilitar a infiltração de células tumorais. O tempo para o desenvolvimento de tumores primários e metástases hepáticas irá variar dependendo da técnica, linha celular, e as espécies de mouse usado. Este modelo do rato ortotópico é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.
Protocolo
I. Preparação celular
- Células de câncer colorretal são cultivadas em cultura e colhidos quando confluentes.
- A suspensão única célula é preparada em tampão fosfato salina e mantidos em gelo.
II. Preparação do tumor
- Um rato com um tumor colorretal previamente estabelecidos subcutânea é eutanasiado.
- O tumor subcutâneo é removido usando técnica estéril e dividido em pedaços 2-3 milímetros
- As peças tumor são mantidos em tampão fosfato salino no gelo.
III. Preparação do mouse
Nota: Em nosso laboratório usamos isoflurano inalado para anestesiar o rato, alternativamente, pode-se usar anestésicos injetáveis para alcançar o mesmo efeito
- A profundidade da anestesia é avaliada através de pinch dedo do pé. Não deve haver reflexo retirar com pitada dedo do pé.
- Antibióticos pode ser dada neste momento.
- O rato anestesiado, que anteriormente era raspada, está posicionada corretamente.
- O abdômen é preparado com uma solução de betadine.
- Do abdômen e do sítio cirúrgico é coberto de forma estéril.
IV. Laparotomia
- Um nick pequeno é feito na pele
- A musculatura da parede abdominal é agarrado e levantado
- A cavidade abdominal é inserido e uma única lâmina da tesoura é usada para empurrar o conteúdo intra-abdominal de distância
- A incisão é estendida a 2-3 cm
V. exposição do ceco
- O ceco com sua bolsa terminando cego é identificado e exteriorizado
- O ceco é isolado do resto do mouse usando um pré-corte de gaze estéril,
- Salina morna é usada para manter a umidade do ceco
VI. Injeção de células para a parede do ceco
- A G 27 ou mais fina agulha é usada para injetar um volume de 50 mL de células na parede cecal
- A agulha é removida
- O local da injeção é inspecionado para garantir que não haja vazamento
- O ceco é retornado para a cavidade abdominal
VII. Transplante de Tumor sobre o Ceco
Nota: Além de injetar células na parede cecal, uma abordagem alternativa é o transplante tumor para o ceco
- Uma figura de oito ponto é colocado no ceco com 6-0 ou 7-0 sutura tamanho
- A parede cecal é levemente danificados
- Então, o pedaço do tumor é posicionado
- O ponto é amarrado
- O ceco é retornado para a cavidade abdominal
VIII. Rato fechamento da parede abdominal e recuperação
- A parede abdominal do rato é fechado com três pontos interrompidos com 3-0 ou 4-0 sutura tamanho
- Alternativamente, pode-se usar um ponto simples execução
- Pós-operatório de analgésicos e um bolus de fluido pode ser dada neste momento
- O mouse é permitida a recuperação anestésica.
Nota: Com anestésicos inalatórios isso normalmente leva 30 segundos
IX. Resultados - tumor primário e metástase hepática
Tumor primário - mostrado in situ (A) e com evidência de neovascularização (B); na coloração H & E, os tumores são localmente invasivos (C)
As metástases no fígado - mostrado ex vivo (D)
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Discussão
Embora os modelos de tumor subcutâneo do rato são fáceis de estabelecer e monitorar, é claro que este modelo não pode replicar o site original anatômica do câncer colorretal. Devido à diferença de microambiente, células de câncer colorretal crescer sob a pele têm sido mostrados para mudar seu fenótipo e quase sempre falham ao progresso e metástases 1,2. Na verdade, a resposta do tumor à terapia pode variar drasticamente, dependendo se as células cancerosas são implantados em uma gravidez ectópica (subcutânea) versus localização o...
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Agradecimentos
Departamento de Cirurgia da Universidade da Califórnia, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meios e componentes de cultura celular | variarão conforme a linhagem celular utilizada | ||
| Solução salina tamponada com fosfato | BioWhittaker | 17-512F | também vendida por diversos outros fornecedores |
| Tubos cónicos de 15 mL, polipropileno | Corning | 430790 | |
| Placas de 6 poços com tampa | BD Biosciences | 353046 | |
| Pinça de íris, reta, com pontas serrilhadas | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | é recomendável ter um par desses instrumentos |
| Tesoura de dissecação de íris, reta, afiada | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Porta-agulha (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Porta-agulha (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | os instrumentos devem ser autoclavados periodicamente, mas também podem ser esterilizados por imersão em Cidex |
| Fio cirúrgico 6-0 ou 7-0 | para ceco; cortesia do Departamento de Cirurgia, UCSF | ||
| Fio cirúrgico 3-0 ou 4-0 | para parede abdominal; cortesia do Departamento de Cirurgia, UCSF | ||
| Máquina de anestesia / Isoflurano | J.A. Baulch and Associates | 3206 | também vendida por diversos outros fornecedores |
| Almofada térmica descartável, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Fita laranja, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | para imobilizar o camundongo anestesiado |
| Pro-Cord/Cortador sem fio | Oster Professional Products | 78997-010 | para depilar o pêlo do camundongo |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | pode também ser adquirido em qualquer loja de material médico |
| Gaze 2 x 2, 3 camadas | Johnson & Johnson | 7635 | pode também ser adquirido em qualquer loja de material médico |
| Campo estéril, barreira, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | pode também ser adquirido em qualquer loja de material médico |
| Aplicadores com ponta de algodão, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | pode também ser adquirido em qualquer loja de material médico |
| Seringa, 10 cc, ponta Luer lock | BD Biosciences | 309604 | |
| Seringa, 1 cc, tuberculina, ponta lisa | BD Biosciences | 309602 | |
| Agulha 27 1/2 G | BD Biosciences | 305109 | |
| Agulha 30 G | BD Biosciences | 305106 |
Referências
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
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Reimpressões e permissões
