É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem
Neste artigo
Resumo
Resumo
No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação 1-4, direção de dominância, 5-7 ocular 8,9 e 9 disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário 10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado 12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais 13 ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais 6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.
Protocolo
1. Preparação cirúrgico
- Induzir a anestesia e continuamente monitorar a freqüência cardíaca, acabam de CO 2 das marés, EEG, e temperatura. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram baseados naqueles que anteriormente publicado 9,15.
- Expor a superfície dorsal do crânio através do corte na pele com uma lâmina de bisturi. Dissecar os tecidos conjuntivos que recobrem o osso usando uma cureta Brudon. Limpe o osso através de aplicadores de algodão e gaze de algodão ponta. Aplicar a cera óssea (quando necessário) ao crânio, para parar o sa....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para ilustrar a precisão dos nossos métodos de marcação de corantes, que alvo menor do domínio de qualquer micro-mapa funcional conhecida no neocórtex não roedor. Esparsamente pontuado em todo o mapa de orientação do córtex visual primário são singularidades. Estes ocorrem nos pontos em que todas as orientações preferidas convergem de tal modo que, em mapas de cor falsas da orientação preferida, as regiões de todo o olhar como singularidade "pinwheels" (Figura 2A-B). Um cata-vento por cranioto.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma experiência vis.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações do National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e financiamento das Fundações Dana & Whitehall para PK Agradecemos também Mateus Petrella para a assistência com procedimentos cirúrgicos; Graça Dion para rastrear os dendritos mostrados na Figura 5A e Pratik Chhatbar para comentários sobre o manuscrito.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nome do reagente / Material | Companhia | Número de Catálogo | Comentários | |||||
| 1. Suporte de vida / experiência prep | ||||||||
| Isoflurano | Vet Webster | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Vaporizador isoflurano | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| Comentários cobertor de aquecimento regulado | Harvard Apparatus | 50-7079F | ||||||
| Monitor de ECG | Digicare Biomédica | LifeWindow Lite | ||||||
| Amplificador de EEG | Sistemas AM | 1800 | ||||||
| Monitor EEG | Hewlett Packard | 78304A | ||||||
| Ao final da expiração de CO 2 do monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Otimizar a ventilação | |||||
| Rebarbas brocas de perfuração de metal duro para osso | Henry Schein | fina (0,5 ponta mm) e grossa (1,25 dica mm) | ||||||
| Cimento para headplate / câmara | Dentsply | 675571, 675572 | ||||||
| Pó preto tinta têmpera | Sargent Arte Inc. | 22-7185 | Adicionar para cimentar a melhorar a luz blindagem e reduzir os reflexos | |||||
| Agarose - Tipo III-A | Sigma | A9793 | Para minimizar pulsações durante sinal intrínseco e dois fótons de imagem | |||||
| Lamela: 5 ou 8 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura | Precisão mundo emtrumentos | 502040, 502041 | Para minimizar pulsações durante o exame, a lamela pode ser cortado, conforme necessário | |||||
| Curetas Brudon | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Limpeza da superfície do crânio | |||||
| Cera de osso | Ethicon | W31G | Rapidamente parar de sangrar | |||||
| Algodão aplicador derrubado | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Superfície do osso limpo e seco | |||||
| Dumont # 5CO Fórceps | Belas Science Tools | 11295-20 | Agarre camadas individuais de duração ou pia | |||||
| Vannas Primavera Tesoura | Belas Science Tools | 15000-03 | Cut dura | |||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | Para parar a hemorragia na dura | |||||
| Lanças de absorção | Belas Science Tools | 18105-01 | Absorção ultra-rápida e sem fiapos da CSF | |||||
| Material de apagão | Thorlabs | BK5 | Escudo craniotomia | |||||
| 2. Tingir preparação / injecção | ||||||||
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Sigma | D2650 | ||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | ||||||
| Verde Oregon 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | Indicador de cálcio | |||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | ||||||
| Centrífugas filtro (tamanho de poro 0,45 um) | Millipore | UFC30HV00 | Para remover as impurezas, antes da injecção | |||||
| Pipeta de vidro extrator | Sutter Instruments | P97 | ||||||
| Vidro borosilicato filamentado capilar (1,5 mm de diâmetro externo) | Instrumentos de Precisão mundo | 1B150F-4 | Pipeta de ejeção Dye | |||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | Para o carregamento de tinta no pipeta | |||||
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MP-285 | Para posicionar pipeta | |||||
| Controlador de pressão de pulso | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | Para a injecção de pressão do corante | |||||
| Uma única célula electroporador | Molecular Devices | Axoporator 800A | Para a electroporação do corante | |||||
| 3. Intrínseca imaging | ||||||||
| Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) | Olimpo | UPLFLN4X | ||||||
| Intrínseca hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | Software VDAQ é usado para geração de imagens episódica | |||||
| Câmera CCD | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| Fonte de alimentação da fonte luminosa | KEPCO | ATE 15-15M | ||||||
| Fonte de luz | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | A intensidade da luz na superfície cortical é de 3-5 mW | |||||
| Filtro verde (para a imagem vascular) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (banda de 30 nm) | Para imagem de referência da vasculatura superfície | |||||
| Red filtro (por sinal intrínseco) | Óptico Imaging Inc. | λ = 630 nm (banda de 30 nm) | Para a coleta de sinais intrínsecos | |||||
| Calor filtro | Optical Imaging Inc. | KG-1 | ||||||
| 4. Dois fótons de plataforma / imagem | ||||||||
| Microscópio de dois fotões e software | Prairie Technologies | Veja Shen et al. 2.012 para o caminho de luz, filtros e potência do laser | ||||||
| Ti: Safira a laser | Spectra Physics- | Mai Tai XF | ||||||
| 20x (0,5 NA; 3,5 milímetros WD) | Olimpo | UMPLFLN20X | 0,5 NA objectivo é apenas usado para alinhar pipeta sobre a craniotomia (não para duas imagens de fotões) | |||||
| 20x (1,0 NA; 2,0 milímetros WD) | Olimpo | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40x (0,8 NA; 3,3 milímetros WD) | Olimpo | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| Mesa de ar | Newport | ST-200 | Isola preparação de vibrações externas | |||||
| fase xy | Máquina de Mike Co. (Attleboro, MA) | Sujeito experimental e micromanipulador Sutter colocado no palco xy | ||||||
|
Referências
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
