Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Resumo

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Resumo

No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação ^1-4, direção de dominância, ^5-7 ocular ^8,9 e ⁹ disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário ^10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado ^12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais ¹³ ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais ^6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.

Protocolo

1. Preparação cirúrgico

1. Induzir a anestesia e continuamente monitorar a freqüência cardíaca, acabam de CO ₂ das marés, EEG, e temperatura. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram baseados naqueles que anteriormente publicado ^9,15.
2. Expor a superfície dorsal do crânio através do corte na pele com uma lâmina de bisturi. Dissecar os tecidos conjuntivos que recobrem o osso usando uma cureta Brudon. Limpe o osso através de aplicadores de algodão e gaze de algodão ponta. Aplicar a cera óssea (quando necessário) ao crânio, para parar o sangramento ocasional através de pequenas veias emissário.
3. Anexar uma placa de titânio ou de aço inoxidável para a cabeça do crânio (sobre a região de interesse, onde a craniotomia será executada) usando cimento dental misturada com tinta preta (ver Materiais). Uma abertura rectangular no centro da placa frontal proporciona acesso para a craniotomia e imagiologia óptica. Anexar uma câmara metálica no topo da placa frontal. Esta câmara serve como um reservatório de fluido para geração de imagens com a lente objectiva de imersão em água.
4. Fixe a placa de cabeça para um estágio xy usando postes de metal.
5. Diluir uma grande área do osso dentro da abertura rectangular da headplate usando uma broca de dentista. A área a ser diluído deve estender-se para além dos limites da craniotomia planeada. A cabeça dura não roedora mamíferos devem ser diluídos, se imagens de alta resolução estão a ser adquiridos a partir do neocortex, porque no local da craniotomia, a espessura do osso vai ditar a espessura da lamela de agarose entre a superfície e neocortical (ver abaixo) .
6. Perfurar um 2 x 2 esboço mm quadrados no osso para a craniotomia. Enxaguar a câmara periodicamente com fresco fluido cerebrospinal artificial (ACSF), para remover fragmentos ósseos e minimizar a dissipação de calor ao córtex subjacente. Aplique cera de osso, conforme necessário, para parar o sangramento ocasional.
7. Lift do retalho ósseo com pinça # 3.
8. Remover todos, mas a camada inferior de duração usando uma pinça fina (# 5CO) e tesoura primavera Vannas. A dura-máter em mamíferos não roedora é espesso e opaco, mas pode ser removido em camadas distintas. A hemorragia é rara, mas pode ser interrompido com Gelfoam e qualquer resíduo de sangue deve ser cuidadosamente removido da camada restante de dura usando uma pinça e enxaguamento com ACSF. A camada final de dura é transparente e vasos Pial deve ser claramente visível através dele. Deixando esta camada final de dura intacta durante o exame sinal intrínseco irá aumentar a taxa de sucesso de carregamento a granel de indicadores de cálcio fluorescentes para a fase posterior de imagens de dois fótons do experimento (ver discussão).
9. Aplique uma gota de agarose morna 2% (dissolvido em ACSF) e coloque imediatamente uma lamela sobre a craniotomia. Verifique a craniotomia para assegurar que as pulsações respiratórias e cardiovasculares são mínimos, utilizando um microscópio de dissecção cirúrgica ou as oculares do dois-fóton em microscópio de campo claro modo.

2. Intrínseca sinal óptico de imagem

1. Adicionar gel de espuma embebidas com ACSF em torno do exterior da lamela para evitar a secagem de agarose durante o exame do sinal intrínseco.
2. Anexar o intrínseco sinal de imagem da câmara CCD para a porta de montagem C padrão em cima do microscópio de dois fotões (Figura 1). Coloque a fonte de luz de iluminação sobre a mesa de ar perto do palco xy (Figura 1A). Posição e manter as guias de luz sobre a craniotomia e headplate / câmara (Figura 1B). Retrair o dicróico primário e do espelho inferior da porta C-montagem de modo que a luz reflectida vermelho necessário para sinais intrínsecos irá passar directamente a partir da craniotomia para a câmara CCD (Figura 1C-D). Usando o objectivo ar 4x (0,13 NA, 17 mm DI), um campo de 2 x 2 mm de exibição está disponível para a imagem do sinal intrínseco.
3. Inserir um filtro de calor na light caminho para evitar que a partir de córtex de aquecimento. Use um filtro que passa luz verde (546 nm centro λ) e gravar uma imagem de referência digital dos vasos sanguíneos superficiais corticais.
4. Mover o foco para z 500 mm abaixo da superfície cortical. Usar um filtro vermelho (630 nm centro λ) para iluminar o córtex para medir sinais intrínsecos. Posicionar as guias de luz de tal forma que a superfície cortical é uniformemente iluminado. Proteger a craniotomia da luz produzida pelo mostrador estímulo visual. Apresentar uma seqüência de estímulos visuais e gravar imagens de dados de refletância. Para gerar um mapa de orientação dentro de 10 min, coletar dados correspondentes a quatro repetições de uma sequência de oito estímulos (4 orientações e duas indicações para cada orientação).
5. Analisar os dados de sinal intrínsecas para gerar um mapa de orientação falsa cor. Selecione regiões-alvo em potencial para dois fótons de rotulagem de neurônios, por exemplo, as singularidades de orientação pinwheel - pontos no mapa ondetodas as orientações preferidas convergem (Figura 2A). Sobrepor a orientação do mapa e a imagem da vasculatura superfície cortical (Figura 2B-C). Use o esquema de domínios funcionais e localização de embarcações de grande superfície para selecionar um alvo, evitando locais com grandes vasos sanguíneos e arteríolas ^15.

3. Carregando em massa de Indicadores de cálcio fluorescentes

1. Prepara-se uma solução de 20% de Pluronic / DMSO, adicionando 1 g de Pluronic em 5 ul de DMSO. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos para dissolver completamente o Pluronic. Deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Adicionar 4 ul da mistura de Pluronic / DMSO para um frasco de 50 ug do indicador de cálcio fluorescente verde Oregon 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Em seguida, adicionar 1 ml de um corante vermelho (Alexa Fluor 594, 2 mM de solução stock) e 35 uL de solução de pipeta (ver Materiais) para uma concentração final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicate a solução para ½ h emum banho de água gelada e em seguida, centrifuga com um filtro de 0,45 um para remover as impurezas.
2. Puxar uma pipeta de conicidade de comprimento com um diâmetro exterior da ponta de 2,0-2,5 | im. Carregar 5 uL da mistura de corantes para a pipeta.
3. Remover a camada final de dura-máter para facilitar a inserção de uma pipeta e obter a melhor qualidade de imagens de dois fotões.
4. Determinar a localização exacta da superfície cortical que a pipeta tem de ser colocado de modo a atingir o seu alvo na camada cortical 2/3. O nosso alvo predeterminado cortical é uma singularidade pinwheel na orientação do mapa (Figura 2). A pipeta tem de ser conduzido para o córtex no ângulo de 30 º para passar entre a parede da câmara e do objectivo. Assim, para identificar a região de destino 200 um abaixo da superfície cortical, a posição de entrada da pipeta na superfície cortical será de aproximadamente 350 um lateralmente à posição do alvo (figura 3-B).
5. Mover a fase xy (em que o animal e o pmicromanipulador ipette são colocados) para centrar a posição de entrada da superfície cortical no âmbito do objectivo (Figura 3C). Utilize uma objectiva de 20x ou 40x, com uma distância de trabalho (DT) de pelo menos 3 mm (ver Materiais) para garantir que a pipeta irá entrar facilmente no córtex sem tocar o objectivo ou o osso ao longo da parede da craniotomia. Uma vez que a posição de entrada está centrado no âmbito do objectivo, aumentar a posição Z do objectivo de 2 mm (Figura 3D). Com a luz verde epi-fluorescência ligada a visualizar o corante vermelho Alexa na pipeta, use o eixo diagonal do micromanipulador para mover a pipeta até a sua ponta é centrado (concentrado e), sob a objectiva directamente acima da superfície cortical entrada ( Figura 3E).
6. Baixar a pipeta na vertical (ao longo do eixo z), até que a pipeta atinge a superfície cortical (Figura 3F), enquanto continuamente visualizar a ponta da pipeta com a oculars do microscópio. Usando brilhante-campo de iluminação, os vasos sanguíneos superficiais corticais e demais membranas das meninges (pia e aracnóide) são facilmente visíveis como a pipeta se aproxima da superfície cortical. Se a pipeta não atinge a posição de entrada desejado, aumentar a pipeta e recalibrar alvo com base nos pontos de referência vasculares na superfície cortical.
7. Retire o objetivo, pavio líquido cefalorraquidiano excesso da craniotomia e secar o osso adjacente usando lanças sem fiapos de absorção. Aplicar uma gota de quente de agarose a 3% (dissolvido em ACSF) para estabilizar o córtex que é visível através da craniotomia (Figura 3G). Em animais não roedores, agarose a 3% é necessário para amortecer pulsações para uma implantação bem sucedida de corantes fluorescentes pelos neurónios. Para imagiologia sinal óptico intrínseco somente 2% de agarose é necessária porque a combinação de agarose a 2% e a lamela fornece a estabilidade necessária. Aqui, não lamela é usado para o passo de corante de carregamento de modo agarose 3%necessário. Após a agarose solidificou, insira uma objetiva de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e re-encher a câmara com ACSF.
8. Mudar de campo brilhante para dois fótons de visualização e localizar a ponta da pipeta. Usando o eixo diagonal do micromanipulador, mover a pipeta até a sua ponta atinge a profundidade desejada, no córtex (Figura 3H). Puffs pressão ocasionais de ejeção da mistura de corante (a psi poucos, cada pulso de 0,1 seg) irá ajudar a evitar a ponta da pipeta de entupimento. Porque OGB-01:00 só se torna visível após entrar nas células, o corante vermelho Alexa é crítica para a visualização da ponta da pipeta dentro do córtex.
9. Antes de tentar carregar neurônios na camada cortical 2/3 com a dose completa do corante, re-centrar o objectivo da superfície cortical para confirmar a profundidade da ponta da pipeta e garantir que a ponta está no local de destino com base na disposição de vasos sanguíneos superficiais. Se a pipeta está na camada de 2/3, puffs pequenas da mistura de corantes deve iluminar oespaço extracelular e revelar um conjunto denso de corpos celulares circulares como sombras escuras.
10. Para carregar os corpos celulares neuronais em uma esfera de córtex 300-600 um de diâmetro, injectar a mistura de corantes para o espaço extracelular com 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Os impulsos de pressão não deve ser tão forte que o tecido se move. Após a injeção é completo, espere alguns minutos, retire a pipeta e objetiva. Aguarde 1 hora para permitir que a OGB-01:00 para ser totalmente absorvido pelas neurônios.
11. Remover a agarose utilizada para a carga de corante e lavar a câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de agarose de 2-3% na superfície e rapidamente colocar uma lamela sobre a craniotomia. Porque os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, evitar uma exposição excessiva do córtex a brilhante-campo ou epi-fluorescente luz. Insira um alto NA (1,0) 20x objetivo no suporte objetivo e re-centro a região cortical rotulado sob o objetivo utilizar o estágio xy. Proteger a craniotomia de extraneous fontes de luz, por exemplo, exibição de estímulo visual, usando várias camadas de material de apagão.

4. De uma única célula de electroporação de corantes fluorescentes

1. Para estudar a morfologia dendrítica, preparar uma solução de 100 uM de Alexa Fluor 594 (diluição 1:20 em ACSF de 2 mM estoque Alexa Fluor 594). Para imagiologia funcional de um sal de OGB dendrites podem ser utilizados ^16,17.
2. Puxar uma pipeta de cone longo com um bico de 1 fim e carregar 5 ul de corante para a pipeta. Todos os outros passos de direccionamento um domínio funcional é idêntico ao método de carregamento a granel (Figuras 1-3). Para posicionar a ponta da pipeta adjacente a uma membrana neuronal de células do corpo, monitorizar o aumento da impedância do eléctrodo e aplicar pressão baforadas de corante para iluminar o espaço extracelular e ver corpos celulares como sombras durante dois fótons de imagem.
3. Quando a ponta da pipeta é adjacente a uma membrana de célula neuronal corpo, use o 800A Axoporator aplicarPulsos 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). O preenchimento imediato do neurônio com corante é facilmente visualizado com dois fótons de microscopia. Remova a pipeta e recolher imagens de alta resolução de dendrites e axónios in vivo.

Resultados

Para ilustrar a precisão dos nossos métodos de marcação de corantes, que alvo menor do domínio de qualquer micro-mapa funcional conhecida no neocórtex não roedor. Esparsamente pontuado em todo o mapa de orientação do córtex visual primário são singularidades. Estes ocorrem nos pontos em que todas as orientações preferidas convergem de tal modo que, em mapas de cor falsas da orientação preferida, as regiões de todo o olhar como singularidade "pinwheels" (Figura 2A-B). Um cata-vento por craniotomia é sele...

Discussão

Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma experiência vis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
			1. Suporte de vida / experiência prep
Isoflurano	Vet Webster	NDC 57319-474-05
Vaporizador isoflurano	Midmark	VIP 3000
Comentários cobertor de aquecimento regulado	Harvard Apparatus	50-7079F
Monitor de ECG	Digicare Biomédica	LifeWindow Lite
Amplificador de EEG	Sistemas AM	1800
Monitor EEG	Hewlett Packard	78304A
Ao final da expiração de CO 2 do monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Otimizar a ventilação
Rebarbas brocas de perfuração de metal duro para osso	Henry Schein	fina (0,5 ponta mm) e grossa (1,25 dica mm)
Cimento para headplate / câmara	Dentsply	675571, 675572
Pó preto tinta têmpera	Sargent Arte Inc.	22-7185	Adicionar para cimentar a melhorar a luz blindagem e reduzir os reflexos
Agarose - Tipo III-A	Sigma	A9793	Para minimizar pulsações durante sinal intrínseco e dois fótons de imagem
Lamela: 5 ou 8 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura	Precisão mundo emtrumentos	502040, 502041	Para minimizar pulsações durante o exame, a lamela pode ser cortado, conforme necessário
Curetas Brudon	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Limpeza da superfície do crânio
Cera de osso	Ethicon	W31G	Rapidamente parar de sangrar
Algodão aplicador derrubado	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Superfície do osso limpo e seco
Dumont # 5CO Fórceps	Belas Science Tools	11295-20	Agarre camadas individuais de duração ou pia
Vannas Primavera Tesoura	Belas Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	Para parar a hemorragia na dura
Lanças de absorção	Belas Science Tools	18105-01	Absorção ultra-rápida e sem fiapos da CSF
Material de apagão	Thorlabs	BK5	Escudo craniotomia
			2. Tingir preparação / injecção
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Verde Oregon 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	Indicador de cálcio
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrífugas filtro (tamanho de poro 0,45 um)	Millipore	UFC30HV00	Para remover as impurezas, antes da injecção
Pipeta de vidro extrator	Sutter Instruments	P97
Vidro borosilicato filamentado capilar (1,5 mm de diâmetro externo)	Instrumentos de Precisão mundo	1B150F-4	Pipeta de ejeção Dye
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	Para o carregamento de tinta no pipeta
Micromanipulador	Sutter Instruments	MP-285	Para posicionar pipeta
Controlador de pressão de pulso	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	Para a injecção de pressão do corante
Uma única célula electroporador	Molecular Devices	Axoporator 800A	Para a electroporação do corante
			3. Intrínseca imaging
Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD)	Olimpo	UPLFLN4X
Intrínseca hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	Software VDAQ é usado para geração de imagens episódica
Câmera CCD	Adimec	Adimec-1000
Fonte de alimentação da fonte luminosa	KEPCO	ATE 15-15M
Fonte de luz	Optical Imaging Inc.	HAL 100	A intensidade da luz na superfície cortical é de 3-5 mW
Filtro verde (para a imagem vascular)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (banda de 30 nm)	Para imagem de referência da vasculatura superfície
Red filtro (por sinal intrínseco)	Óptico Imaging Inc.	λ = 630 nm (banda de 30 nm)	Para a coleta de sinais intrínsecos
Calor filtro	Optical Imaging Inc.	KG-1
			4. Dois fótons de plataforma / imagem
Microscópio de dois fotões e software	Prairie Technologies		Veja Shen et al. 2.012 para o caminho de luz, filtros e potência do laser
Ti: Safira a laser	Spectra Physics-	Mai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 milímetros WD)	Olimpo	UMPLFLN20X	0,5 NA objectivo é apenas usado para alinhar pipeta sobre a craniotomia (não para duas imagens de fotões)
20x (1,0 NA; 2,0 milímetros WD)	Olimpo	XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 milímetros WD)	Olimpo	LUMPLFLN40X/IR
Mesa de ar	Newport	ST-200	Isola preparação de vibrações externas
fase xy	Máquina de Mike Co. (Attleboro, MA)		Sujeito experimental e micromanipulador Sutter colocado no palco xy
			Receitas Líquido cefalorraquidiano artificial NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 Adição da solução de 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4