Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Resumo

Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade Ex vivo Cultivadas glândulas embrionárias de camundongos submandibulares (SMGs) utilizando transferência de gene viral é descrito. Este método tira vantagem da capacidade inata de SMG epitélio e mesênquima para recombinar-se espontaneamente, após a separação e a infecção de rudimentos epiteliais com vectores adenovirais.

Resumo

Ramificação morfogénese ocorre durante o desenvolvimento de muitos órgãos, e a glândula submandibular embrionário de rato (GSM) é um modelo clássico para o estudo da ramificação morfogénese. No desenvolvimento de SMG, este processo envolve passos iterativos de broto epitelial e formação de condutas, para finalmente dar origem a uma rede complexa ramificada de ácinos e ductos, que servem para produzir e modificar / transportar a saliva, respectivamente, para dentro da cavidade oral ^{1 - 3.} A membrana basal epitelial associada e aspectos do compartimento mesenquimal, incluindo as células do mesênquima, factores de crescimento e da matriz extracelular, produzida por estas células, são essenciais para o mecanismo de ramificação, embora como os eventos celulares e moleculares são coordenadas permanece pouco compreendido ⁴ . O estudo dos mecanismos moleculares condução avanços morfogênese epiteliais nossa compreensão de mecanismos de desenvolvimento e fornece insights sobre Regener possívelAtive abordagens da medicina. Estes estudos têm sido dificultados pela falta de métodos eficazes de manipulação genética do epitélio salivar. Atualmente, a transdução adenoviral representa o método mais eficaz para os células epiteliais nas glândulas adultos in vivo ^5. No entanto, em explantes de embriões, mesênquima densa e a membrana basal que envolve as células epiteliais viral impede o acesso às células epiteliais. Se o mesênquima é removida, o epitélio pode ser transfectado utilizando adenovírus, e rudimentos epiteliais pode retomar a morfogénese ramificação na presença de Matrigel ou laminina-111 ^6,7. Mesênquima livre de crescimento epitelial rudimento também requer suplementação adicional com factores de crescimento solúveis e não totalmente recapitular morfogénese de ramificação tal como ocorre nas glândulas intactas ^8. Aqui descrevemos uma técnica que facilita a transdução adenoviral de células epiteliais e cultura do e transfectadaspithelium com mesênquima associado. Após microdissecção dos SMGs embrionárias, a remoção do mesênquima e infecção viral do epitélio com um adenovírus contendo GFP, vamos mostrar que o epitélio espontaneamente recombina com mesênquima não infectado, recapitulando estrutura intacta SMG glandular ea ramificação morfogênese. A população de células geneticamente modificadas epitelial pode ser facilmente controlada por meio de métodos padrão de microscopia de fluorescência, se fluorescentemente marcado com construções adenovirais são utilizados. O método de recombinação tecido aqui descrito é actualmente o método mais eficaz e acessível para a transfecção de células epiteliais com um vector do tipo selvagem ou mutante no interior uma estrutura de tecido complexo 3D que não requer a geração de animais transgénicos.

Protocolo

O protocolo contém quatro etapas principais, conforme representado na Figura 1. Todos os passos são descritos em pormenor. Construção do adenovírus e purificação viral deve ser realizada antes da colheita de órgãos para utilização na transdução genética das dissecados rudimentos epiteliais. Todos os padrões de precauções BSL-2 de segurança devem ser seguidas quando se trabalha com adenovírus.

1. Embrionárias de camundongos glândula submandibular colheita (SMG) e Microdissecção

1. Euthanize timed-fêmeas grávidas de ratinhos (estirpe CD-1 outbred ou ICR) usando CO ₂ narcose, seguido por deslocação cervica....

Resultados

O fluxo dos principais passos experimentais é apresentada na Figura 1. Um exemplo de um SMG intacto, um rudimento isolado epitelial, e sua mesênquima correspondente são mostrados na Figura 2. As imagens de campo claro de SMGs recombinadas, que continuam a sofrer de ramificação morfogénese quando cultivadas ex vivo para os tempos indicados, são mostrados na Figura 3. Glândulas recombinados cultivadas durante 48 horas expressando GFP epitelial são mostrados na

Discussão

O ex vivo técnica de recombinação epitelial-mesenquimal foi publicado em glândulas salivares submandibulares em 1981 ^16. Neste protocolo, expandir-se no método original, utilizando infecção adenoviral para manipular a expressão de genes das células epiteliais, no contexto de uma glândula recombinada. Mostra-se que a percentagem de células epiteliais infectadas com o adenovirus, enquanto que a percentagem de células que estão infectadas depende das propriedades do promotor viral, titulação viral e pur.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM / Ham 's F12 Medium sem vermelho de fenol	Life Technologies	21041-025
Penicilina e estreptomicina	Life Technologies	15070-163	Estoque 10X
Dispase	Life Technologies	17105-041	Congelar em alíquotas de utilização única de 20C-
BSA	Sigma	A2934-100G	V fração, endotoxina baixo
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Deveria ser título elevado (1x10 10 pfu / ml). Vírus CsCl purificados são mais eficazes do que os vírus purificado coluna neste ensaio.
Paraformaldeído 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluída a 2% em PBS com 5% de sacarose (w / v)
1X tampão de fosfato salino (PBS)	Life Technologies	70011-044	Preparado a partir estoque 10X
Solução Salina Equilibrada de Hank	Life Technologies	14175095	sem cálcio, magnésio não, não Vermelho de Fenol
Transferrina	Sigma	T8158	25 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media. Congelar de uso único alíquotas a-20C
Ácido L-ascórbico (Vitamina C)	Sigma	A4403	75 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media.Freeze de uso único alíquotas a-20C
			Tabela 1. Lista dos reagentes necessários para a SMG protocolo recombinação.
10 centímetros pratos de plástico estéreis	Corning	430167	Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados.
Estereomicroscópio estéreo com base de luz transmitida	Nikon	SMZ645	Qualquer estéreo microscópio de dissecção podem ser utilizadas, que tem uma base de luz transmitida.
35 placas de cultura de tecidos milímetros	Falcão	353001	Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados.
50 mm de diâmetro pratos micropoços	MatTek Corporação	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch filtros de membrana	Whatman	110405	13 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,1 milímetros
Widefield microscópio de fluorescência	Carl Zeiss, EUA	Axio Observer Z1	Qualquer microscópio de fluorescência (de pé, inverted ou estéreo microscópio de dissecção) pode ser utilizado para monitorizar a expressão da GFP em baixa ampliação com uma câmara anexa digital.
Microscópio confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	Microscopia confocal é necessário ver estruturas celulares detalhados. Qualquer microscópio confocal pode ser usado.
Timed-fêmeas grávidas de ratinhos, tensão CD-1 ou ICR	Charles River Labs		Os embriões são colhidos no dia 13 (dia da descoberta com tampão designado como dia 0).
Lâmina de bisturi n º 11	Belas Science Tools	10011-00
Cabo de bisturi n º 3	Belas Science Tools	10003-12
Dumont n º 5 fórceps liga de inox, 0.05mm X 0,02 milímetros	Belas Science Tools	11252-20	Ideal para a colheita de embriões glândulas
Dumont n º 5 fórceps liga dumostar, 0.05mm X 0,01 milímetros	Belas Science Tools	11295-20	Pontas finas são necessárias para a remoção do epitélio mesênquima. Agulhas de tungsténio também podem ser usados.
			Equipamento Tabela 2. Usado em SMG protocolo recombinação.