Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Resumo

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Resumo

Embora estudos clínicos têm demonstrado que as vacinas DC antígeno-carregados são seguros e promissora terapia para tumores ^1, sua eficácia clínica ainda não foi estabelecida. O método descrito abaixo, preparadas de acordo com as Boas Processo de Fabricação (GMP), é uma otimização do método de preparação ex vivo mais comum para a geração de um grande número de DCs para estudos clínicos ^2.

Nosso método utiliza o TLR sintético 3 agonista Carboxymethylcellulose ácido poli-L-lisina Polyinosinic-Polycytidylic (Poly-ICLC) para estimular os DCs. O nosso estudo anterior estabeleceu que a poli-ICLC é o estímulo da maturação individual mais potente para DCs humanas, tal como avaliado por uma sobre-regulação de CD83 e CD86, a indução da interleucina-12 (IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), o interferão-gama induzido proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e os interferões tipo I (IFN), e interleucina mínima 10 (IL-10) de produção. DCs são diferenciados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC congelados), obtidos por leucaferese. As PBMC são isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll e congelado em alíquotas. No dia 1, as CMSPs são descongelados e semeados em frascos de cultura de tecido para seleccionar os monócitos que aderiram à superfície plástica após 1-2 horas de incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido. Após a incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes foram cultivadas durante 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e de granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) para se diferenciarem para DCs imaturas. No dia 6, DCs imaturas são pulsadas com a proteína hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), que serve como um controlo para a qualidade da vacina e pode aumentar-se a imunogenicidade da vacina contra a ^3. As DCs são estimuladas a amadurecer, carregado com antígenos peptídeos, e incubadas durante a noite. No dia 7, as células são lavadas, e congelado em alíquotas de 1 ml contendo4-20 x 10 ⁶ células, utilizando um congelador de taxa controlada. Testes de liberação de lote para os lotes de DCs é realizada e deve atender a especificações mínimas, antes de serem injetadas em pacientes.

Protocolo

1. O isolamento e a criopreservação de PBMCs ⁴

1. Assepticamente espiga de uma das portas de acesso na bolsa leucaferese utilizando um conjunto de transferência de plasma. Usando uma seringa de 60 ml, a transferência da leucaferese obtidos de pacientes em um frasco de 500 ml estéril.
2. Ajustar o volume da leucaferese para 2x o seu volume original usando RPMI temperatura ambiente. Misture bem.
3. Misture delicadamente a garrafa de Ficoll-Paque PLUS. Adicionar 12 ml de Ficoll-Paque Plus em tubo de 50 ml estéril.
4. Suavemente camada de 30 ml do produto de leucaferese diluído a cada tubo de 50 ml estéril contendo Ficoll. Ter cuid....

Resultados

Entre 10 - 20% a partir de PBMCs diferenciarem em DCs no final do período de cultura. DCs maduras são CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + e CCR7 + (Figura 1). Eles expressam altos níveis de moléculas MHC classe II, as moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e eu e. Poli-ICLC também induziu níveis baixos de PDL-1, em comparação com outros agonistas de TLR ^14. Além disso, estas DCs segregam grandes quantidades de poli-IC-maturados de IL-12 (Figura 2 e ^15,16) e induzem a p.......

Discussão

Fase I e II de ensaios clínicos de DCs derivadas de monócitos têm mostrado que induzem respostas imunitárias em pacientes, no entanto o sucesso clínico tem sido limitada ^1. Isto pode ser em parte devido à falta de consenso sobre a forma de gerar os DCs óptimas para a utilização de imunoterapia tumoral. Embora haja várias maneiras de gerar DCs clínico grau, estes métodos variam em termos do uso de citocinas utilizadas para diferenciar os monócitos, os estímulos utilizados para induzir a maturação, e os métodos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio RPMI-1640 com L-glutamina	BioWhittaker	12-702F
1M HEPES tamponado com solução salina	BioWhittaker	17-737E
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	BioWhittaker	17-516F
Albumina humana, solução a 25% USP	Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-03
Soro AB humano	Valley Biomedical	HP1022
Solução salina estéril USP	Hospira
CryoMACS DMSO	Miltenyi Biotec	170-076-303
Leukine GM-CSF, 0,5 mg / ml	Berlex	A02266
MACS GMP IL-4	Miltenyi Biotec	170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg / ml	Oncovir	NA
VACMUNE KLH	Biosyn
225 cm² EasyFlasks	Nalgene Nunc	159934
Falcon Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Becton Dickinson	353046
Frascos CryoTube de 1,8 ml	Nalgene Nunc	377267
Freezer de taxa controlada	Thermo	CryoMed