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Summary

Um meio não-invasivo para avaliar o sucesso do transplante de mioblastos é descrito. O método leva vantagem de um gene de fusão unificada repórter composto de genes cuja expressão pode ser trabalhada com diferentes modalidades de imagem. Aqui, fazemos uso de um<em> Flutuações</em> Seqüência do gene repórter para atingir as células através de imagem de bioluminescência.

Abstract

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética grave neuromuscular que afeta 1 em cada 3.500 meninos, e é caracterizada por degeneração muscular progressiva ^{1, 2.} Em pacientes, a capacidade das células satélites do músculo residentes (SCs) para regenerar miofibras danificadas torna-se cada vez menos eficaz ^4. Assim, o transplante de células progenitoras musculares (PPM) / mioblastos de indivíduos saudáveis ​​é uma abordagem terapêutica promissora para DMD. Um grande limitação para a utilização da terapia de células-tronco, contudo, é uma falta de tecnologias de imagem fiáveis ​​para acompanhamento a longo prazo das células implantadas, e para avaliar a sua eficácia. Aqui, nós descrevemos um método não invasivo, a abordagem em tempo real, para avaliar o sucesso do transplante de mioblastos. Este método tira vantagem de um gene repórter unificado de fusão composta de genes (a luciferase do pirilampo [flutuações], proteína fluorescente vermelha monomérica [MRFP] e SR39 timidina-quinase [sr39tk]) Expre cujossion pode ser trabalhada com diferentes modalidades de imagem ^{9, 10.} Uma variedade de métodos de imagem, incluindo tomografia por emissão de pósitrons (PET), emissão de fóton único tomografia computadorizada (SPECT), ressonância magnética (MRI), de imagem óptica, e alta freqüência 3D ultra-som já estão disponíveis, cada um com suas vantagens e limitações ^11. Bioluminescência de imagem (BLI) estudos, por exemplo, têm a vantagem de ser de custo relativamente baixo e de alto rendimento. É por este motivo que, no presente estudo, que fazem uso da luciferase do pirilampo sequência do gene (flutuações) repórter contido dentro do gene de fusão e de imagem de bioluminescência (BLI) para a localização de curto prazo de mioblastos C2C12 viáveis ​​após a implantação num ratinho modelo de DMD (distrofia muscular no cromossomo X [mdx] mouse) ^12-14. Importante, BLI nos fornece um meio para analisar a cinética de PPM rotulados pós-implantação, e vai ser útil para rastrear células repetidamente sobre tIME e migração seguinte. Nossa abordagem de gene repórter ainda nos permite mesclar várias modalidades de imagem em um único sujeito vivo, dada a natureza tomográficos, resolução espacial fina e capacidade de escalar até animais maiores e os seres humanos ^10,11, PET irá formar a base do trabalho futuro que sugerem podem facilitar a tradução rápida dos métodos desenvolvidos nas células a modelos pré-clínicos e para aplicações clínicas.

Protocol

1. Manutenção e propagação de mioblastos C2C12 Placa mioblastos C2C12 em um frasco de 75 cm 2, e manter as células em soro Modificado por Dulbecco de alta glucose de Eagle (DMEM-HG), suplementado com soro bovino fetal (FBS) a uma concentração final de 10%. Não permitir que as células se tornam confluentes, a qualquer momento, pois isso irá esgotar a população mioblásticas. Meio deverá ser trocado a cada outro dia Nota:. Meio sempre quente a 37 ° C num banho de água antes da sua utilização. Quando mioblastos tornar cerca de 80% confluentes, as células de passagem para um novo frasco. Aspirar o meio de cultura. Lavar as células com 4-5 ml de Solução de Sal Equilibrada de Hanks (HBSS), para remover todos os vestígios de meio de cultura, que contém inibidor de tripsina de soro. Resumidamente lavar a camada de células com 2-3 ml de 0,25% (w / v) de solução de tripsina-EDTA para dissociar os mioblastos aderentes provenientes do frasco. Aspirar tripsina e balão lugar em estufa a 37 ° C durante 5 min. Durante esta incubaçãoção, preparar um novo frasco com 9 ml de HG-DMEM/10% FBS. Após tripsinização, adicionam-se 10 ml de meio completo para células e tempos de pipeta 4-5 para garantir a recolha de todas as células no meio. Adicionar 1 ml de suspensão de células para o balão de novo e incubar em 5% de CO2 a 37 ° C. 2. A transfecção celular C2C12 Uma vez que as células atingiram 50% de confluência, transfectar de acordo com as instruções do fabricante a partir de Invitrogen. Resumidamente, combinar 90 ul de reagente Lipofectamine 2000 com 4,5 ml de meio OPTI-MEM. Em outro tubo, combinar 36 ug trifusion CMV-DNA do gene repórter com 4,5 ml OPTI-MEM. Flick cada tubo para combinar e esperar 5 min. Combinar o conteúdo de ambos os tubos, misturar gentilmente e incubar à temperatura ambiente durante exactamente 30 minutos Nota:. Um segundo frasco deve também ser configurado para células não transfectadas que apenas recebem Lipofectamine e OPTI-MEM para servir como um controlo negativo. Remover meio de células C2C12 e adicionar 15,5ml de fresco HG-DMEM/10 FBS%. Adicionar meio de transfecção para levar o volume total a 20 ml. Permitir que as células durante a noite para transfectar pelo menos durante 20 horas a 37 ° C. No dia seguinte, aspirar meio de transfecção e juntar 10 ml HG-DMEM/10% de FBS. Ver células em um microscópio invertido fluorescente. Capture o campo claro e vermelho imagens de fluorescência (usando um cubo TRITC filtro; MRFP ex / em: 584/607 nm). Contar o número de células que expressam RFP visualizados sob fluorescência dividido pelo número total de células vistas sob campo brilhante para múltiplos campos de visão para gerar a eficiência da transfecção. 3. Avaliação da sobrevivência celular Ensaio / MTT Um dia antes da transfecção, placa de 1×10 5 células C2C12 em cada poço de uma placa de 24 poços. As células devem ser plaqueadas em 500 uL volumes de HG-DMEM/10% de FBS. No dia seguinte, os mioblastos transfectam durante a noite, como descrito anteriormente. Siga as sugestões do fabricante para transfecção Reagenvolumes de t para uma placa de 24 poços. Incubar de um conjunto de poços com Lipofectamine apenas (sem ADN) como um controlo. Ver células sob fluorescência para assegurar que a transfecção apropriada ocorreu. Remover meio de transfecção e mioblastos incubar com 5 mg / ml tiazolil azul de tetrazólio (MTT) em HG-DMEM/10% de FBS. Adicionar D-luciferina a oito dos poços transfectadas, e incubar a 37 ° C durante quatro horas. Remover meio de poços. Solubilizar os cristais de formazan azuis, adicionando 180 ul de isopropanol a cada poço. Agitar a 37 ° C durante 15 min. Evitando qualquer precipitado solução pipeta, em uma placa de 96 poços e ler a absorvância a 575 nm. 4. Preparação de Mioblastos para transplante Remover meio, lavar mioblastos com HBSS, e Tripsinizar as células como descrito em 1.1. Re-suspender as células em 4 ml de meio completo. Usando um hemocitómetro, contagem de células para gerar volumes contendo 10 6 mioblastos. Pipeta volume em microtubos estéreis 1,5 ml. Com uma eficiência de transfecção de ~ 10%, estes valores indicam que 100.000 células que expressam luciferase são detectáveis ​​no scanner ExploreOptix GE após o transplante. Atingir um volume final de injecção de 15 uL, contendo 10 6 células C2C12. Se necessário, centrifugar microtubos em 2000 rpm durante um minuto. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Re-suspender as células em 15 ul de HG-DMEM sem FBS. 5. O implante de células Anestesiar rato com isoflurano a 2% / 2% O 2. Arrancar pêlos da região dorsal do membro posterior. Manter a anestesia com 1,5% de isoflurano / O 2 a 2%. Assegurar mioblastos C2C12 são bem suspensa. Com o mouse em uma posição de bruços, estender o membro posterior e usar uma seringa de insulina para injetar células diretamente na cabeça lateral do músculo gastrocnêmio em um ângulo de 30 °. Injectar mioblastos transfectados na pata traseira direita e int mioblastos não transfectadoso O membro (esquerda) contralateral traseira. Realizar uma varredura bioluminescência base: Rapidamente transferir mouse para estágio no scanner óptico, colocando o mouse em uma posição de bruços. Ligue a linha de anestésico. Para garantir o mouse permanece anestesiado, uma segunda pessoa deve estar presente para ligar a linha de anestésico, enquanto os outros lugares o animal no scanner. Suavemente estender o membro traseiro para que a área de injecção é visível. Membros de fitas traseiras no lugar com um adesivo suave como fita médica. Fechar a câmara e garantir que a luz não pode aceder ao interior do scanner, como isto irá aumentar o sinal de fundo detectado. O scanner deve ser definido como parâmetros incluídos nas instruções do fabricante para obter imagem de bioluminescência. Especificamente, garantir "não laser" é selecionado. Desenhe uma região de interesse (ROI) em torno da área depenados e varredura início. 6. Injecção de Substrato Fluc, D-luciferina, em rato Mdx <ol> Enquanto o rato é anestesiado por via intraperitoneal injectar 150 mg / kg de substrato de luciferase do pirilampo, D-luciferina (de um a 40 mg / ml de solução concentrada, constituída de acordo com as instruções do fabricante). Recuperar mouse e permitir um período de 15 minutos antes de preparar a captação do rato para a próxima verificação. 7. BLI para Target Luc expressam PPM Após Implante em ratos de DMD Após o período de absorção, anestesiar rato de novo, como se descreveu em 5.1. Transferir o mouse de volta para o leitor óptico e executar outra verificação bioluminescência da mesma maneira como a verificação do fundo. Embora um período de 20 min a absorção deve fornecer a intensidade máxima do sinal, uma verificação subsequente pode ser realizada. Após a conclusão da aquisição da imagem, sacrificar o mouse de acordo com as diretrizes definidas pelo Comitê de Ética Institucional animal e do Canadian Council on Animal Care (CCAC). Isolar muscular dos membros posteriores e local imediatamente in formalina a 10% para corrigir para emblocamento parafina. Realização da coloração imuno-histoquímica para luciferase para confirmar a injeção intramuscular de mioblastos.

Representative Results

Aquando de 50-60% de confluência, mioblastos C2C12 foram transitoriamente transfectadas com o referido gene repórter construção de fusão composta de luciferase de pirilampo [flutuações], monomérica da proteína fluorescente vermelha [MRFP] e SR39 timidina quinase [sr39tk] (Figura 1A). A eficiência de transfecção foi calculado por meio de microscopia de fluorescência (Figura 1B, C), fazendo uso da sequência MRFP na nossa construção repó…

Discussion

Neste estudo, descrevemos uma rápida e fiável molecular imaging, a abordagem de gene repórter de mioblastos não invasiva alvo / PPM após o transplante. Embora este estudo demonstra a localização de curto prazo de PPM transplantados via bioluminescense imaging (BLI), o modo pelo qual as células são alvejados podem, de facto, ser facilmente aplicado a uma avaliação longitudinal do enxerto de células, através da implantação de células que expressam estavelmente o gene repórter. P…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
C2C12 myoblasts	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Life Technologies	12800-017
fetal bovine serum	Life Technologies	12483020
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-72
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma Aldrich	H6648
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Nikon Eclipse TE2000-5	Nikon Instruments Inc.
Xenolight D-luciferin	PerkinElmer	122796	40 mg/ml in PBS