Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Summary

De duas fases aquosas sistemas foram usados ​​para as populações em simultâneo múltiplos padrões de células. Este método fácil e rápido para a padronização de células tira vantagem da separação de fases de soluções aquosas de dextrano e polietileno glicol e a tensão interfacial que existe entre as duas soluções poliméricas.

Abstract

Padronização de tecnologias de células que são rápido, fácil de usar e acessível será necessário para o futuro desenvolvimento de ensaios de alto rendimento, plataformas de celulares para o estudo de interações célula-célula e sistemas de engenharia de tecidos. Este protocolo detalhado descreve um método para a geração de co-culturas de células utilizando soluções biocompatíveis de dextrano (DEX) e polietileno glicol (PEG), que separada da fase quando combinado acima das concentrações de limiar. As células podem ser estampados em uma variedade de configurações que usam este método. Patterning exclusão de células pode ser realizada através da impressão de gotículas de DEX sobre um substrato e cobrindo-os com uma solução de PEG que contêm as células. A tensão interfacial formada entre as duas soluções poliméricas de células faz com que a cair em torno do lado de fora da gotícula de DEX e formar uma clareira circular que pode ser usado para ensaios de migração. Ilhas de células pode ser modelado por meio da supressão de uma célula fase rica DEX em uma solução de PEG ou cobrindo o DEXgota com uma solução de PEG. Co-culturas podem ser formados directamente através da combinação de exclusão de células com DEX patterning ilha. Estes métodos são compatíveis com uma variedade de abordagens para manipulação de líquidos, incluindo micropipetting manual, e pode ser usado com virtualmente qualquer tipo de célula aderente.

Introduction

De duas fases aquosas sistemas (ATPSs) formam-se quando as soluções de dois polímeros incompatíveis são misturados em conjunto em concentrações suficientemente elevadas. A separação de fases é influenciada por uma série de factores que incluem o peso molecular e polaridade dos polímeros, a temperatura da solução, pH e teor iónico do solvente aquoso ^{de 1, 2.} O ponto em que as duas soluções poliméricas separadas, é determinada pelas propriedades físico-químicas do sistema de fase escolhida, mas geralmente ocorre em baixas concentrações de polímero (inferiores a 20% wt / wt), sob condições não desnaturantes, permitindo ATPSs a ser utilizado para a biotecnologia ^3-9 aplicações.

De longe, os mais extensivamente estudados ATPS é o polietileno glicol (PEG) / dextrano sistema (DEX). Os ATPS formadas por estes polímeros de baixo custo e biocompatível foi originalmente descrita para a purificação de biomoléculas por meio de particionamento molecular ^{de 2, 10.} Particionamentoocorre quando as moléculas ou partículas adicionais que não contribuem para o sistema de fases são misturadas com PEG e DEX. Com base nas suas afinidades relativas para ou DEX ou PEG, as moléculas ou partículas será preferencialmente residir dentro de uma das duas fases, ou na interface. Outra propriedade do SDFA PEG / DEX é a existência de tensão interfacial entre as duas fases de polímero. ATPSs formados por PEG e DEX geralmente exibem as tensões interfaciais, que são muito mais baixos do que outras fases líquido-líquido e dois sistemas, tais como óleo e água, no entanto, as forças de tensão interfacial ainda exercem efeitos em pequenas partículas, tais como vírus, células e agregados de proteína ^{2 , 11-13.} Finalmente, visto que um maior peso molecular de PEG e DEX separado em concentrações baixas (inferiores a 5% em peso / peso para polímeros de alto peso molecular variedades), na presença de concentrações fisiológicas de sais, há poucos ou nenhuns efeitos nocivos sobre as células de mamíferos incorporado dentro destas sistemas^14-16.

Recentemente, as propriedades interfaciais e efeitos de particionamento de ATPSs foram aplicadas por nosso laboratório para padronização de células ^{14, 16-20.} Isto foi conseguido por uma densa micropatterning solução DEX em substratos de cultura de células na presença de PEG. Quando as células são incorporados na fase de PEG, são excluídos de entrar nas gotículas de DEX, devido a PEG / DEX tensão interfacial ^20. Quando as células são modelados na fase de DEX, eles são retidos na superfície do substrato de cultura de células por tensão interfacial e partição ^{16, 17, 19.}

Em contraste com outros métodos de padronização celular, ATPS padronização celular é fácil de aprender e requer apenas conhecimentos rudimentares sobre os polímeros em si, e da capacidade de realização de cultura de células e usar uma micropipeta. Outros métodos para padronização de células muitas vezes envolvem equipamentos especializados e treinamento que não são facilmente traduzidos para poe ciências da vida. Por exemplo, alguns métodos (microcontact impressão ou impressão a jacto de tinta) células padrão indirectamente mediante a aplicação de padrões de biomoléculas adesivas de células a um substrato de cultura que, posteriormente, servir como locais para ligação de células ^{21, 22.} Embora as abordagens indirectas são úteis para alguns tipos de células, elas requerem um elevado grau de destreza do utilizador e equipamento especializado para fabricar a ferramenta de modelação, e pode carecem de especificidade, dependendo do tipo específico de célula padrão / biomolécula. Alternativamente, as células podem ser depositadas com uma especificidade elevada padrão por meio de métodos de modelação directos, que incluem padrões de fluxo laminar stenciling, e impressão jacto de tinta ^23-26. No entanto, essas técnicas também requerem perícia do utilizador e equipamento especializado e podem danificar as células durante o processo de impressão. Embora estes métodos geralmente produzem padrões precisos de células, para padronização célula para ser uma ferramenta útil nas ciências da vida, deve ser rentável umª simples de implementar.

Relatamos aqui um protocolo detalhado para a geração de culturas de células utilizando os estampados ATPSs descritos nos nossos pedidos anteriormente publicados-. Usando apenas micropipetas, os usuários podem gerar zonas de exclusão de células ou ilhas de células para os ensaios de migração. Isto é conseguido por meio de PEG / DEX tensão interfacial ou que retém as células na fase de DEX ou exclui células depositadas na fase de PEG de DEX. Combinando estas duas técnicas fundamentais de modelação, é possível gerar rapidamente co-culturas de células, tais como fibroblastos de células de fígado de co-culturas. Métodos de padronização, os parâmetros e os resultados esperados ATPS são descritos em detalhe.

Protocol

1. Caracterização fase do sistema: Limiares determinante para a Separação de Fase

1. Preparar soluções contendo PEG e DEX no tampão desejado, ou meio de cultura celular, como mostrado na Figura 1 (pontos roxos) em 15 ml ou 50 ml de tubos cónicos. Daqui por diante, o PEG e DEX se referirá a 35 kDa PEG e DEX 500 kDa, no entanto, concentrações críticas vão mudar dependendo dos dois polímeros usados. Registar a massa de PEG e DEX em cada solução. Soluções de alta concentração de polímeros pode levar várias horas para dissolver. Vórtice pode ser utilizado para as soluções isentas de soro. Para meios contendo soro ou proteínas, colocar os tubos em um estágio de balanço até que ambos os polímeros são completamente dissolvido. Registar o peso dos meios de comunicação utilizados para dissolver os polímeros e tomar nota das concentrações iniciais.
2. Uma vez que os polímeros estão completamente dissolvidos, as soluções devem aparecer turva. Esta é a primeira indicação de que a separação de fases ocorreu. Para confirmar isso, permitir que osoluções de polímero a descansar numa posição vertical à temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugação a 1000 xg pode ser utilizado para acelerar o processo de separação de fases. A fase inferior mais densa será DEX-rico e a fase de topo será PEG-rico.
3. Lentamente, adicionar tampão adicional ou de mídia para os tubos. Pequenos incrementos deverá ser utilizado de modo a não ultrapassar o ponto de separação de fases.
4. Quando a solução torna-se clara e não se separa da fase após a centrifugação, o limiar para a separação de fases foi atingido. Registar o peso final do tubo.
5. Utilizando os pesos anteriores registadas para os polímeros, juntamente com o peso final após a adição de meios de comunicação, determinar a% em peso / peso de cada um dos dois polímeros em que a separação de fase não ocorre.
6. Traçar estes valores como PEG% p / p sobre o eixo y e% wt / wt DEX sobre o eixo x. Esta trama, conhecido como a curva binodal, pode ser usado para determinar a concentração de limiar de separação de fases para Concentrati diferenteComplementos de PEG / DEX em um meio de cultura de células específico.

2. Configuração 1: Padronização de exclusão (formato de 96 poços Plate)

1. Preparar soluções separadas de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células. Use ATPS soluções de pelo menos duas vezes o ponto crítico para assegurar que um ATPS permanece após os polímeros de equilibrar-se com respeito ao outro. Há uma pequena quantidade de fluxo de DEX para a fase rica em PEG e vice-versa, por isso, trabalhar muito perto da concentração crítica pode resultar em perda de fase do sistema em termos de concentração gota abaixo do ponto crítico. Da mesma forma, a transferência da placa de cultura de células para uma incubadora com humidade e temperatura controlada pode alterar as propriedades de duas fases e tornar as duas soluções miscíveis. Nota: Algumas células podem ter um melhor desempenho com outras formulações ATPs. Formulações aceitáveis ​​podem ser seleccionados com base nas curvas de binodais determinados a partir da parte 1.
2. Colheita das células a serem usadas para a exclusão patterning. Determinar o número total / concentração de células disponíveis. Opcional: rotular as células com CellTracker ou outros não-citotóxicos rótulos para microscopia de fluorescência.
3. Agregar as células e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células por exclusão. Por exemplo, um poço de uma placa de 96 poços requer 37500 células de fibroblastos de ser ressuspensas em 200 ul de PEG para produzir confluência no dia seguinte. Dimensionar estes números como apropriado para outros tipos de células e tamanhos de substratos de cultura.
4. Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Gotas maiores volumes maiores produzem zonas de exclusão. Que variam em tamanho de gotículas 0,1-1 ul são recomendados para micropatterning exclusão. Opcional: DEX gotículas podem ser depositados 24 hr antes do tempo permitido para desidratar e à temperatura ambiente. Isso pode produzir padrões mais limpas.
5. Pipetar 200 ul de suspensão de células em PEG tele bem para cobrir as gotículas de DEX.
6. Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO _2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões.
7. Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura.
8. Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora.
9. Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células para a zona de exclusão.

3. Configuração 2: Padronização Island (formato de 96 poços Plate)

1. Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima.
2. Colheita das células a serem usadas para padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis.
3. Pellet e ressuspender as células em um volume apropriado de 12,8% DEX para alcançar a concentração desejada de células por patterning ilha. As concentrações de 5000 cells / ul ou menos são recomendados para os tipos de células fortemente aderentes. Para as células que têm dificuldade em fixar ou células que aderem fracamente, concentrações de até 10.000 células / uL pode ser considerada.
4. Trabalhar rapidamente, para evitar a secagem, as gotas de pipeta 0,5 ul de DEX sobre um substrato seco de células de cultura, como descrito acima. Não permitir que as gotas para secar. Opcional: 200 ul de solução de PEG pode ser adicionado ao poço antes do tempo. DEX gotículas pode então ser depositado na solução de PEG, onde irá afundar para o fundo e a superfície de contacto da cultura. Isso pode produzir padrões mais limpas da ilha.
5. Cobrir as gotículas DEX com 200 uL de PEG.
6. Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO _2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões.
7. Remover a solução de PEG e lavar três vezes com 200 ul de meio de cultura.
8. Adicionar nova culturamédio e de retorno para a incubadora.
9. Monitorar as culturas periodicamente para observar a movimentação das células e para fora de proliferação das ilhas.

4. Configuração 3: Exclusão Co-culturas (formato de 96 poços Plate)

1. Preparam-se soluções de 5,0% p / p de PEG e 12,8% em peso / peso DEX em meio de cultura de células, como descrito acima.
2. Colheita das células a serem usadas para a exclusão e padronização ilha. Determinar o número total / concentração de células disponíveis para cada tipo de célula. Opcional: Alguns pares de células podem exibir índices de proliferação significativamente diferentes. Para evitar que as células excluídas superpopular as células insulares estampados (especialmente para culturas de longo prazo), o tratamento das células utilizadas para a exclusão com mitomicina C, durante 2 horas ou irradiar-los antes da colheita. Isto irá evitar a proliferação. CellTracker corantes fluorescentes podem ser usadas para distinguir as duas populações de células, se necessário.
3. Agregar as células e ressuspender o sedimento de exclusion padronização em um volume apropriado de 5,0% de PEG para obter o número desejado de células, como descrito acima. Ressuspender o sedimento em patterning ilha em um volume apropriado de 12,8% DEX para conseguir a concentração desejada de células, como descrito acima.
4. Usando uma micropipeta, dispensar 0,5 ul de gotas de suspensão de células de DEX sobre um substrato de cultura de células secas. Não permitir que as gotas para secar.
5. Cobrir as gotículas DEX com 200 ul de suspensão de células PEG.
6. Coloca-se num incubador humidificado durante 12 horas a 37 ° C, 5% CO _2. Certifique-se de que o prato não é inclinada durante o manuseio e que está colocado sobre uma prateleira incubadora nível para evitar a perturbação dos padrões.
7. Remover a solução de PEG e lavar três vezes em 200 ul de meio de cultura.
8. Adicionar meio de cultura fresco e de retorno para a incubadora.
9. Monitorar as co-culturas de observar a interação entre populações de células. Opcionais: Os controles podem ser preparados através da realização de exclusão ou ilha padronização individually, por co-cultura de células que não interagem ou bloqueando as vias de interesse em uma ou ambas as populações de células antes ou depois da modelação.

Results

Para selecionar uma combinação apropriada de PEG e DEX para padronização de células é importante para determinar a curva binodal. Esta curva de delineia os pontos em que se podem formar um ATPS e pode variar para um dado conjunto de polímeros com base em temperatura, pH e teor iónico. Para a cultura de células que requerem formulações médias personalizadas que podem ser necessários para determinar experimentalmente a curva binodal. Isto é conseguido através da geração de uma série de ATPSs que estão longe do binodal e v...

Discussion

A ATPS método micropatterning célula exige conhecimentos muito pouco além de proficiência em técnicas de cultura de células e podem ser rapidamente dominado. As vantagens desta abordagem são que é barato, rápido e compatível com uma variedade de tipos de células e formatos de cultura. Por estas razões, o nosso protocolo deve ser adotada facilmente por cientistas da vida, particularmente aqueles que estudam a proliferação celular, migração e quimiotaxia, e da influência de interações juxtacrine e parácrina entre populaçõ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Fabricante
Dextran 500.000 kDa	Pharmacosmos, Dinamarca
Polietilenoglicol 35000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Rastreador de celular	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Soro Fetal Bovino	Gibco, Carlsbad, CA