Summary
ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים החיים
Abstract
ציטומגלווירוס האנושי (או HCMV HHV-5) הוא מחולל מחל מסכנת חיים בחיסון אנשים שנפרצו. עם זיהום מולד או ילוד, הווירוס יכול להדביק ולשכפל במוח המתפתח, אשר עלול לגרום לניזק נוירולוגים חמור, כולל חירשות ופיגור שכלי. למרות החומרה הפוטנציאלית של התסמינים, האפשרויות הטיפוליות מוגבלות על ידי חוסר הזמינות של חיסון והעדר טיפול אנטי ספציפי. יתר על כן, תיאור מדויק של אירועים המולקולריים המתרחשים במהלך הזיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא עדיין חסר מאז תצפיות נובעות בעיקר מהנתיחה שלאחר המוות של ילדים נגועים. כמה מודלים של בעלי חיים, כגון CMV רזוס מקוק, פותחו וסיפק תובנה חשובות בפתוגנזה CMV של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות הקרבה האבולוציונית שלו עם בני אדם, מודל זה היה מוגבל על ידי הליך החיסון תוך גולגולתי משמש כדי להדביק את החיות וחסרונותistently לגרום לזיהום מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, שיקולים אתיים קידמו את הפיתוח של מודלים חלופיים, ביניהם זיהום בילוד של עכברי בני יומם עם עכבר ציטומגלווירוס (MCMV) הוביל לאחרונה להתקדמות משמעותית. לדוגמה, דווח כי זריקת intraperitoneal של MCMV לילודי Balb / ג מובילה לזיהום של תאי עצב ותאי גלייה באזורים מסוימים במוח. ממצאים אלו הראו כי חיסון ניסיוני של עכברים עשוי לסכם את הגירעונות הנגרמים על ידי זיהום HCMV בילדים. עם זאת, ניתוח דינמי של זיהום MCMV של ילודים הוא קשה לביצוע, כי המתודולוגיה קלסית דורשת הקרבה של מספר לא מבוטל של בעלי חיים בנקודות זמן שונים על מנת לנתח את נטל ו / או פרמטרים הקשורים לחיסון הנגיפי. כדי לעקוף את צוואר הבקבוק הזה ולאפשר לחקירות עתידיות של בעלי חיים שעברו מוטציה נדירות, אנחנו מוחלים in vivo הדמיה הטכנולוגיה כדי לבצע ניתוח בזמן קורס של Viraהפצת L במוח על הזרקה היקפית של MCMV רקומביננטי להביע לוציפראז לC57BL / 6 ילודים.
Introduction
ציטומגלווירוס האנושי (HCMV/HHV-5) הוא חבר של משפחת β-ההרפס. HCMV היא הפתוגן שכיח ביותר, אופורטוניסטי שהוא בדרך כלל שנרכש במהלך חייו המוקדמים כזיהום ללא תסמינים 1. כמו כל herpesviruses, HCMV נמשכת לאורך כל חייו של המארח שמערכת חיסון חזק שולטת שכפול נגיף. פרקים של הפעלה מחדש נגיפית בעיקר להתרחש אצל אנשים מדוכאי חיסון, כגון חולים להשתלה מקבלים תרופות למניעת דחיית שתל 2. אצל מבוגרים, HCMV גם קשורה לglioblastomas 3. בנוסף, HCMV היא הפתוגן בולט עבור תינוקות עם חסינות בשלה 4-6. הדבקה ראשונית בעובר או ילוד הפיתוח יכולה להיות השלכות חמורות. HCMV זיהום הוא הסיבה זיהומית הנפוצה ביותר של מומים מולדים מולדים והפרעות ילדות במדינות מפותחות. ההערכה היא כי השכיחות של זיהום HCMV ילוד משפיעה על 0.5-1% oF כל הלידה חי בין 5-10% שיסבלו מתסמינים חמורים כגון microcephaly או hypoplasia המוח הקטן. בנוסף, 10% מהתינוקות שנדבקו בזיהום נגיפי תת קליני יהיו מאוחר יותר לפתח sequellae מוביל לפיגור שכלי, אובדן שמיעה, ליקויים חזותיים או התקף אפילפסיה ו7,8.
בניגוד לherpesviruses אדם אחר כגון הרפס סימפלקס 1 (HSV-1/HHV-1) אשר ניתן לעכברים מחוסן דרך נתיבים של הזרקה 9 שונים, שכפול ציטומגלווירוס הוא מינים ספציפיים. תכונה זו פגעה קשה בחקירות של פתוגנזה HCMV אשר בוצעו במודלים של בעלי חיים שונים (עכבר, חולדה, חזיר, קוף רזוס) וCMVs מארח הספציפי האמיתי שלהם. כל CMVs מפגין דמיון משמעותי בגודל הגנום וארגון, כמיהות רקמות ורגולציה של ביטוי גנים. הם גם לגרום למחלות דומות במארח שלהם, בהתאמה. למרות גיוון גנטי להיותTween HCMV וציטומגלווירוס העכבר (MCMV) (50% מORFs להציג בוירוס האנושי מזוהים בCMV העכברי), מודל העכבר הוכיח לאחרונה להיות יתרון, בעיקר משום שניתן לבדוק זנים מוטנטים ליכולת שלהם לשלוט ויראלי שכפול in vivo. זה הוביל למסך גנטי שאפשרו הערכה של מספר הגנים עכבר לידי ביטוי בשלב הבוגר המרכיבים את "resistome" לווירוס הזה 10. בסך הכל, זה מצביע על כך MCMV עכברים נגועים מייצגים מודל אטרקטיבי לחקר אינטראקציות בין מאכסן לוירוס במבוגרים. החקירה של זיהום CMV מולד היא מורכבת יותר בגלל הבדלים בארגון שכבת שליה בין אדם ועכברים לפגוע בשידור אם לעובר של זיהום ויראלי בעכברים. לאחרונה, הזרקה ישירה של MCMV בשליה ביום 12.5 להריון אפשרה זיהום המוח של ילודים עכברים שהביאו לליקוי שמיעת 11. עם זאת, רובnvestigations כעת להשתמש בזריקת intraperitoneal של 4-20 ילודים בני שעה כדי לספק הפצה נגיפית מערכתית שעלולים לגרום לדלקת מוח hematogenous, מודל שהוא יותר רלוונטי מזו של הזרקה תוך גולגולתי. פרוטוקול זה סיפק תובנה חשובות פתוגנזה CMV ועוד במיוחד, זה הודגם כי זיהום MCMV של תוצאות יילודים בשכפול נגיף בתאים עצביים וגליה נמצאים במוקדים דלקתיים אשר חדרו עם תאי mononuclear כמו מקרופאגים 12. דו"ח זה גם תאר המורפוגנזה שינתה של המוח הקטן מלווה עם התפשטות פחת פרטנית נוירון והגירה והאינדוקציה של גני אינטרפרון מגורה מרובים. התפקיד החיוני של CD8 + תאי T לשליטת MCMV במערכת העצבים המרכזית שדיווח גם על ידי אותה הקבוצה 13. היבט חשוב לשקול בעת ניתוח ההשפעה פתולוגית של חיידק הוא את הדינמיקה של להדביקיון. במקרה של MCMV, זה חיוני במיוחד כדי לחקור ולכמת את ההתקדמות של הפצת נגיף למוח המתפתח, כדי להבין ולחזות את סדר הגודל של פציעות הנוירוביולוגי בעתיד. באופן מסורתי, כימות של ההתקדמות של זיהום דורשת הקרבה הקבועה של בעלי חיים נגועים לכיילה את הפתוגן ברקמות, כגון מוח, שהם נגישים אחרים. זה סוג של פרוטוקול כעת לערער על ידי שיפור הכרחי של רווחת בעלי חיים ואת 3Rs (צמצום, מקד, החלף) 14 עקרונות. שימוש בטכנולוגיות ההדמיה vivo עשויה לאפשר הפחתה דרסטית של מספר בעלי החיים אשר נחוצות בזיהום בניסויי vivo. כאן אנו מדווחים ומתארים את ניתוח בזמן קורס של הפצה נגיפית אל תוך המוח על זריקת intraperitoneal MCMV לוק לילודי עכבר. שימוש באותם בעלי החיים, אנחנו במעקב והפיקוח in vivo האתרים של vi האינטנסיבישכפול RAL בתקופה 2 בשבוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ההשעיה ויראלי
- השג את זן סמית לוציפראז להביע MCMV (MCMV לוק 15) ממעבדתו של אולריך Koszninowski. בזה רקומביננטי, הגן בלוציפראז מוכנס במוקד IE2 של הגנום MCMV.
- כדי להגביר MCMV לוק, להדביק קו עכברי מח עצם סטרומה תא (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) עם MCMV בריבוי שונה של זיהום (משרד הפנים, 0.001 ל -1) 16. לשם כך, להוסיף וירוס לתאים בתרבית במדיום חופשי בסרום על 37 ° C. לאחר שעה, להסיר את supernatant ולהחליף אותו עם DMEM בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS). חמישה ימים לאחר מכן, לקצור את מדיום התרבות וaliquots החנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- טיטרציה של ההשעיה נגיפית על ידי assay פלאק.
- פיצול תאי 3T3 (ATCC # CRL-1658) בצלחת גם 24 ב40,000 תאים / היטב ב1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FCS המכיל פניצילין (200 IU / מ"ל) וsteptomycin (200 מ"ג / מ"ל) ו דגירה 24 שעות ב 37 ° C.
- הכן דילולים סידוריים (10 -1 עד 10 -8) של aliquot של ההשעיה MCMV בDMEM ולהדביק תאי המטרה (3T3) עם 200 μl דילול לאחר הסרת מדיום תרבות תא. דגירה שעה 1 ב 37 ° C. הוסף 1 מ"ל של למעלה בינוני (DMEM FCS 3%, 2% (V / V) gentamycin, 200 IU / ml פניצילין, 200 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 8 גרם / L carboxymethyl תאית) ודגירה 5 ימים על 37 ° C.
- תקן את התאים על ידי הוספת 200 פורמלדהיד 10% μl (דילול של פורמלדהיד עם מים צריך להיעשות במנדף כימי, כדי למנוע אינהלציות רעילות) זה טוב, ודוגר 6 שעות בטמפרטורת חדר. סור בינוני תרבות + קיבוע על ידי pipetting את הפתרון ולהוסיף 200 מכתים תא μl (1% קריסטל סגול (W / V) ב20% אתנול). לפני השימוש, לדלל חלק 1 עם 9 חלקי מים מילי-Q. דגירה 2 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף את צלחת 3-4x על ידי שרייתו במים, שלא תתייבש ולספור את מספר השלטים עם משקפת.
<li> לדלל MCMV לוק בDMEM להשיג 50 PFUs ב50 μl ולהשאיר על קרח עד לשימוש נוסף. שימוש inoculums נגיפי גבוה יותר גורם קטלני לפני הילודים להגיע 2-3 שבועות של גיל. מניסיוננו, 500 PFUs לגרום קטלני בכל 5 עד 7 ימי ילוד לאחר הזרקה.
2. הזרקה של ילודים
- כאשר ילודים (4 עד 20 עכברים, ישנים שעות) זמינים, לתפעל את ההמלטה והצואה של הכלוב עם כפפות לפני הטיפול בזהירות את הגורים כדי למנוע זיהום עם ריחות "זרים" שידגיש את אמו ולגרום לדחייה של הגורים .
- לבצע זריקת intraperitoneal באמצעות מזרק אינסולין (29-G) כפי שמוצג באיור 1 א. החזק את הילוד עם עור הגב. עם צד עד הגחון, להציג את המחט מתחת לרגל הקדמית ולדחוף אותו בעדינות מתחת לעור כדי להשיג חלל הצפק (קצת מתחת לטבור). בשלב זה אנו להזריק 1% מתילן הכחולים מדולל DPBS ולפקח על הישרדות לעמפרקטיקות טכניקה לפני ביצוע זיהומים ויראליים. מאז תילן כחול נראה בבירור במהלך תהליך ההזרקה, אנו ממליצים על ביצוע הזרקה זו "הכשרה" ראשון, כדי להבטיח אספקה נאותה של ההשעיה נגיפית בחלל intraperitoneal.
- לחסל את טיפות הדם הזעירות שעלולים להתעורר ואת המקום בחזרה הילוד לתוך הכלוב.
3. בשנת vivo ההדמיה
- ביום 7, לטפל בילודים עם אותו מזהיר כאמור. הזרק intraperitoneally תערובת של חומרי הרדמה (4 מ"ג / מיליליטר קטמין, 0.8 מ"ג / מיליליטר xylazine) וluciferin (0.15 משקל גוף מ"ג / גר ') ב50 μl בכל חיה. משקל גוף ממוצע של בעלי החיים הוא 1-2 גרם ומינון של חומרי הרדמה לבעלי חיים הוא: 40 מיקרוגרם קטמין, מיקרוגרם xylazine 8 חכה 12-15 דקות עד שמגיע למקסימום של luciferin פליטה שלה. זה צריך להיקבע מראש ותלוי במערכת ההדמיה משמשת הספק וluciferin.
- בעוד הגורים הם anesthetiZed, לתייג אותם לזיהוי בעתיד ולקצור פיסה קטנה של רקמה שלאחר מכן ניתן להשתמש עבור genotyping עתיד אם נמצאים בשימוש בעלי חיים שעברו מוטציה.
- מניחים את הגורים במערכת ההדמיה ולבצע רכישה של האור הנפלט ע"י הגוף כולו. שבעה ימים לאחר הדבקה, הווירוס משוכפל לעותקים רבים באיברי המטרה כגון כבד, כליות, ריאות ובלוטות רוק, ולכן משך חשיפה צריך להיות קצר. במקרה שלנו, שאנו מבצעים את הרכישה עבור 10 עד 20 שניות (איור 1). הפלטפורמה בתא רכישת מכשיר ההדמיה צריכה להיות מחוממת כדי למנוע קירור יתר של טמפרטורת הגוף של בעלי חיים מורדמים. בנוסף, כדאי לקבל תמונות ברזולוציה נמוכות של כמה בעלי חיים בסיבוב רכישה אחד ולאחר מכן לעבור, עד הפלטפורמה קרובה יותר לעדשת המצלמה כדי להתמקד בחלק אחד של בעלי חיים מסוימים או איבר מבודד בעקבות נתיחה. התוכנה צריכה לאפשר שינויים מהיריםאחד מהפרמטרים (זמן חשיפה, מדגם מרחק / עדשה, רגישות), כימות של אזורים מוגדרים של עניין ויצוא עתידי של תמונות תמונת מצב.
- לרכישת אות אור מהראש בלבד, לכסות את הגוף של הילודים שוכבים רוחבי עם נייר עבה, כהה שמסתיר את הפוטונים הנפלטים ברמה של האיברים שבו שכפול נגיפי גבוה מתרחש (בכבד, ריאות, בלוטות רוק) ולבצע רכישה במשך 5 עד 10 דקות (איור 1 ג). לבצע רכישה של צד הניגוד של החיה באותם תנאים.
- לחדש את הגורים לכלוב ולמקם את מנורת חימום על גבי כדי למנוע קירור יתר של הילודים הרדימו. באופן קבוע לפקח על התאוששות לאחר ההרדמה. עם מינון המצוין, הרדמה כיום נמשכת 30 דקות.
- חזור על אותו ההליך בימים 9, 11 ו -14. בימי 11 ו -14, לשנות את המינון של חומרי הרדמה (6 מ"ג / מיליליטר קטמין, 1.2 מ"ג / מיליליטר xylazine).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסוי נציג מודגם באיור 1. על זריקת intraperitoneal של 50 PFUs של MCMV לוק (לוח מראה זריקה דומה הופיעה עם מתילן הכחול כדי להמחיש את המסלול תת עורית של המחט), ילודים היו מורדמים וקיבל בו זמנית 0.3 מ"ג של מצע לוציפראז (Luciferin, קליפר). רבע שעה לאחר מכן, בעלי החיים הונחו צד הגחון בחדר רכישת IVIS 50 (במערכת הדמית vivo, קליפר) והאור הנפלט ע"י כל בעלי החיים נתפס במהלך חשיפת שנייה 10. לוח ב 'מציג תמונת מצב תמונות שצולמו בימי 7, 9, 11 ו -14 עם התוכנה (חיים 3.2 תמונה, קליפר) מוקדשת לניתוח. את התמונות היו מכוילת עם אותן ההגדרות: מקס הפליטה מוגדרת ב10 7 פוטונים לשנייה (עמ '/ שנייה) ודקות ב 10 עמ' 6 / שנייה. מהתמונות הללו, נראה כי כייל נגיף הכולל בכל בעלי החיים פוחת לאורך זמן. כימות הארה הופיעה עם אותה התוכנה מאשרת תצפית זו (לא מוצג). בשלב הבא, כיסינו את כל גוף, חוץ מהראש, מהחיה עם נייר עבה, כהה המונע את הפוטונים הנפלטים על ידי איברים כגון ריאות, כבד, כליות ובלוטות רוק להיות מזוהה על ידי המצלמה הדיגיטלית. זה מאפשר חשיפה ארוכה יותר (5 דקות במקרה שלנו) ומגלה מקום דיסקרטי ברמה של אוזנו השמאלית בעוצמה שמגבירה בין היום 7 ויום 14 (לוח ג'). אות מופיעה גם בלסת התחתונה ואפו של בעל החיים. תמונות הוקמו עם מקס ב2,000 עמ '/ שנייה ודקות ב 100 עמ' / שנייה. ניסוי זה, שבוצע על בעלי החיים זהים בין 0 יום ויום 14, מצביע על כך שההתפתחות של זיהום ויראלי יכולה להיות מוקלטת ולכמת את הטכנולוגיה הזאת ושהפצת MCMV למוח ניתן לצפות דינמית in vivo.
1.jpg "/>
איור 1. ניתוח בזמן קורס של ילוד עכבר נציג נגוע בניסוי עם ציטומגלווירוס זורח. הזרקה מתילן כחולה Intraperitoneal א בילודים. התמונה המוגדלת (מימין) מציגה את הנתיב תת עורית של הזריקה בבית החזה. ב in vivo ההדמיה של אותו ילוד מיום 7 ליום 14 לאחר הזרקת MCMV לוק. הארה מהחיה הרדים השלמה היא מדמיינת על הזרקת luciferin וחשיפת שנייה 10. הארת ג נפלטת על ידי הראש (בצד שמאל) של אותה החיה בימים 7 עד 14. מרווה את הפוטונים משאר הגוף עם נייר כהה מאפשר חשיפה ארוכה יותר (5 דקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש בטכנולוגיית ההדמיה vivo כדי לפקח על הפצת MCMV לוק בילודים עכברים, היינו מסוגלים להתבונן התפשטות נגיף למוח של בעלי חיים שעברו מוטציה, בניגוד לטבע מהסוג. נתיחה נוספת של בעלי החיים וההדמיה vivo לשעבר של המוח אישר את נוכחותו של וירוס זורח במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, אנחנו גם ביצע אימונוהיסטוכימיה (לא מוצג) בסעיפים דקים מוח עם נוגדנים ספציפיים לחלבון מוקדם MCMV E1 וציינו כי אכן, MCMV נמצא באותם אזורים כמו אלה שבם הארה התגלתה, ובכך מצביעים על כך שההדמיה מקרוסקופית של האור הנפלט ע"י חיות שלמות הרדימו חיות, משקף למעשה את המאפיינים של זיהום נגיפי המתרחש בגוף חי.
ניתוח מסוג זה כבר בשימוש נרחב לבעלי חיים מבוגרים, למשל כדי לפקח על צמיחת גידול השתלה של תאים זורחים. במקרה שלנו, האתגר היה להשתמש neonaTES שהרדמת הגזים עם isoflurane תימסר לבעלי החיים בתוך חדר הרכישה לא הייתה אפשרית מסיבות טכניות. לכן, אנו נאלצים להשתמש בהזרקת קטמין / xylazine ומתאמנים את המינון לגודל הקטן של הילודים. אנחנו גם טיפל בגורים בזהירות כדי למנוע את הסיכון של דחייה על ידי אמם. על ידי ביצוע ההמלצות והמינונים שתוארו כאן, ואשר הם קריטיים למניפולציה בטוחה ותוצאה של את הגורים, הרדמה של תינוקות הופכת להיות אפשרות מעשית חלופית המאפשרת תקופות ארוכות של חוסר תנועה הנדרשות לביצוע בתחום ההדמיה vivo.
יתר על כן, מכיוון שרמת הארה ניתן לכמת עם התוכנה המתאימה, אנחנו הוכיחו כי ההתקדמות של הזיהום במהלך תקופה 2 שבועות מאופיינת בעומס נגיפי ירד באיברי הצפק (כבד, טחול, כליות) וריאות, בעוד שניתן בהדרגה להיות שמעיד התפשטות נגיף במוח. ההוא תצפית, אשר יכולה להיות הבחינה בבעלי חיים שעברו מוטציה ולא בבקרה, תהיה מתועדת עם פרטים נוספים וניתוחים סטטיסטיים בכתב יד שבו בהכנת טבעו של הגן שעבר מוטציה יהיה גם דן. עם זאת, שיטת ההדמיה שלנו מהווה שיפור משמעותי בהשוואה לטכניקות הקלסיים אשר דורשת המתת חסד של בעלי חיים שונים עבור כל נקודת זמן, ואחריו בזמן שיטות וגוזלות משאבים (assay פלאק או PCR כמותי) כדי למדוד titers ויראלי בhomogenates שהוכן משונה את איבריו לאחר הנתיחה. זו גם עולה בקנה אחד עם עקרונות האתיקה המסדירים את הניסויים בבעלי חיים אשר דורשים מאמץ מתמיד כדי למזער את הכמות מספקת כדי להגיע למובהקות סטטיסטיות. לבסוף, יתרון נוסף של בעקבות אותו בעל החיים (מתויג ביום 7) במהלך כל תקופת הניסוי הוא להפחית וריאציות בין פרט. כתוצאה מכך, כימות נעשה בכל נקודת זמן (ימים 7, 9, 11 ו -14) ביצועיםormed על קבוצה של 6 תינוקות משפר באופן משמעותי את המובהקות סטטיסטיות של התוצאות (מידע לא מוצג).
בשלב זה אנו משתמשים במתודולוגיה זו כדי לנתח את ההשפעה של מוטציות בעכברים על הפצתו של כתב יד MCMV וכרגע בהכנת דוחות augmented התפשטות נגיפית במוח של בעלי חיים שעברו מוטציה. הניסיון שלנו מצביע על כך שהשוואה בין קבוצה של 5-6 מוטציות לקבוצה מקבילה של ילודים בקרה מספקת נתונים באיכות גבוהה ומשמעותיים. אנחנו לא, לעומת זאת, רואים במתודולוגיה זו מתאימה להקרנת phenodeviants שנוצר על ידי תכנית mutagenesis אקראית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.
הצהרת אתיקה
בעלי חיים הוחזקו בתנאי הפתוגן ללא במתקן הטיפול בבעלי החיים של מכון d'et d'Immunologie Hématologie. טיפול בעכברים ונהלי ניסוי נערכו בהתאם לחוק הצרפתי להגנה על חיות מעבדה. הנוהל אושר על ידי שירות véterinaire דה לה פריפקטורה du Bas-Rhin (צרפת) תחת מספר האישור-67-345.
Acknowledgments
אנו מודים לי Tuddenham (IBMC, שטרסבורג) להגברה וtitrating MCMV לוק ותומס Baumert (INSERM U748, שטרסבורג) לאישור להשתמש במתקן בעלי החיים של המכון לווירולוגיה. תמיכה כספית מINSERM, אוניברסיטת דה שטרסבורג וסוכנות הידיעות Nationale de la Recherche (ANR-08-הבעה-005-01) היא הודתה. ההשתתפות הראשונית של סוניה Beroud והלטישה Lelieur במהלך פרויקט הורים שלהם היא גם הודתה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G.
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K.
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
