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Immunology and Infection

का प्रयोग करें Published: July 6, 2013 doi: 10.3791/50409
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1ImmunoRhumatologie Moléculaire, INSERM UMR_S 1109, Centre de Recherche d'Immunologie et d'Hématologie, Université de Strasbourg

Summary

नवजात शिशुओं की मानव साइटोमेगालोवायरस (एचसीएम्वी) संक्रमण मानसिक मंदता का एक महत्वपूर्ण कारण का प्रतिनिधित्व करता है, अभी तक वायरस प्रेरित रोगजनन के लिए अग्रणी आणविक घटनाओं अभी भी खराब समझ रहे हैं. मस्तिष्क संक्रमण की गतिशीलता की जांच करने के लिए, हम पूरे पशु अनुकूलित

Introduction

मानव साइटोमेगालोवायरस (HCMV/HHV-5) β-दाद वायरस परिवार का एक सदस्य है. एचसीएम्वी आमतौर पर एक स्पर्शोन्मुख संक्रमण के रूप में 1 प्रारंभिक जीवन के दौरान प्राप्त कर लिया है, जो एक अत्यधिक प्रचलित, अवसरवादी रोगज़नक़ है. सभी herpesviruses तरह, एचसीएम्वी जिनकी प्रतिरक्षा प्रणाली मजबूती से वायरल प्रतिकृति को नियंत्रित मेजबान के पूरे जीवन भर बनी रहती है. वायरल पुनर्सक्रियन के प्रकरणों ज्यादातर ऐसे भ्रष्टाचार अस्वीकृति 2 को रोकने के लिए दवाओं प्राप्त प्रत्यारोपण के रोगियों के रूप में immunocompromised व्यक्तियों में हो. वयस्कों में, एचसीएम्वी भी glioblastomas 3 से जोड़ा गया है. इसके अलावा, एचसीएम्वी अपरिपक्व प्रतिरक्षा को 4-6 के साथ नवजात शिशुओं के लिए एक प्रमुख रोगज़नक़ है. विकासशील भ्रूण या नवजात शिशु में प्राथमिक संक्रमण गंभीर परिणाम हो सकते हैं. एचसीएम्वी संक्रमण विकसित देशों में जन्मजात जन्म दोष और बचपन विकारों का सबसे आम संक्रामक कारण है. यह नवजात एचसीएम्वी संक्रमण की घटनाओं में 0.5-1% ओ को प्रभावित करता है कि अनुमान हैच 5-10% ऐसे microcephaly या अनुमस्तिष्क hypoplasia के रूप में गंभीर लक्षणों से ग्रस्त है जो बीच में सभी जीवित जन्मों. इसके अलावा, उपनैदानिक ​​वायरल संक्रमण से संक्रमित शिशुओं की 10% बाद में नुकसान, दोष दृश्य या जब्ती और मिर्गी 7,8 सुनवाई, मानसिक मंदता के लिए अग्रणी sequellae का विकास होगा.

जैसा कि इंजेक्शन 9 के विभिन्न मार्गों के माध्यम से चूहों के लिए टीका किया जा सकता है जो इस तरह हरपीज सिंप्लेक्स 1 (HSV-1/HHV-1) के रूप में अन्य मानव herpesviruses करने का विरोध किया, cytomegalovirus प्रतिकृति प्रजातियों विशिष्ट है. इस सुविधा के लिए गंभीर रूप से विभिन्न पशु मॉडल में प्रदर्शन कर रहे हैं जो एचसीएम्वी रोगजनन की जांच बाधा उत्पन्न (माउस, चूहे, गिनी पिग, रीसस बंदर) और उनके संबंधित असली मेजबान विशिष्ट CMVs गया है. सभी CMVs जीनोम आकार और संगठन, ऊतक tropism और जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण समानताएं दिखा रहे हैं. वे भी अपने संबंधित मेजबान में इसी तरह की विकृतियों को प्रेरित. बावजूद जीनोमिक विविधता होनाबीच एचसीएम्वी और माउस cytomegalovirus (MCMV) (ORFs का 50% murine सीएमवी में पहचाने जाते हैं मानव वायरस में मौजूद है), माउस मॉडल हाल ही में ज्यादातर उत्परिवर्ती उपभेदों वायरल को नियंत्रित करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है, क्योंकि फायदेमंद साबित हुई है vivo में प्रतिकृति. यह इस वायरस 10 से "resistome" रचना जो वयस्क अवस्था में व्यक्त माउस जीन की संख्या का आकलन सक्षम है, जो एक आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए प्रेरित किया है. कुल मिलाकर, यह कि MCMV संक्रमित चूहों वयस्कों में मेजबान वायरस बातचीत के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं इंगित करता है. मानव और चूहे के बीच अपरा परत संगठन में मतभेद चूहों में वायरल संक्रमण की मां से भ्रूण संचरण ख़राब क्योंकि जन्मजात सीएमवी संक्रमण के अन्वेषण और अधिक जटिल है. हाल ही में, गर्भ के दिन 12.5 पर नाल में MCMV के प्रत्यक्ष इंजेक्शन हानि 11 की सुनवाई के लिए नेतृत्व जो चूहों नवजात शिशुओं के मस्तिष्क संक्रमण सक्षम है. हालांकि, ज्यादातर मैंnvestigations अब संभावित hematogenous मस्तिष्क संक्रमण के लिए अग्रणी प्रणालीगत वायरल प्रसार, एक intracranial इंजेक्शन की तुलना में अधिक प्रासंगिक है जो एक मॉडल उपलब्ध कराने के लिए 4-20 घंटे की उम्र में नवजात शिशुओं की intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग करें. इस प्रोटोकॉल सीएमवी रोगजनन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है और अधिक विशेष रूप से, यह मैक्रोफेज 12 तरह mononuclear कोशिकाओं के साथ घुसपैठ कर रहे हैं जो भड़काऊ foci में स्थित neuronal और glial कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति में नवजात शिशुओं के परिणाम की कि MCMV संक्रमण का प्रदर्शन किया गया था. इस रिपोर्ट में यह भी कम बारीक न्यूरॉन प्रसार और प्रवास और कई इंटरफेरॉन उत्तेजित जीन के शामिल होने के साथ साथ सेरिबैलम की बदल morphogenesis का वर्णन किया. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में MCMV के नियंत्रण के लिए सीडी 8 + टी कोशिकाओं की अनिवार्य भूमिका भी एक ही समूह के 13 से सूचना मिली थी. एक सूक्ष्म जीव के रोग प्रभाव का विश्लेषण करने पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू को संक्रमित की गतिशीलता हैआयन. MCMV के मामले में, यह भविष्य neurobiological चोटों की भयावहता को समझने और पूर्वानुमान करने के क्रम में विकासशील मस्तिष्क में वायरल प्रसार की प्रगति का पता लगाने और यों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, एक संक्रमण की प्रगति की मात्रा का ठहराव संक्रमित पशुओं की नियमित बलिदान अन्यथा दुर्गम हैं जो इस तरह के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों में रोगज़नक़, अनुमापांक करने की आवश्यकता है. प्रोटोकॉल के इस प्रकार अब आवश्यक पशु कल्याण के सुधार और 3Rs (बदलें, परिष्कृत करें, कम करें) सिद्धांतों 14 से चुनौती दी है. Vivo इमेजिंग तकनीकों में उपयोग vivo संक्रमण प्रयोगों में आवश्यक हैं जो जानवरों की संख्या में भारी कमी अनुमति दे सकता है. यहाँ, हम रिपोर्ट और माउस नवजात शिशुओं को intraperitoneal MCMV ल्यूक इंजेक्शन पर मस्तिष्क में वायरल प्रसार का एक समय पाठ्यक्रम विश्लेषण का वर्णन है. एक ही पशुओं का उपयोग करना, हम तीव्र vi की साइटों पर नज़र रखी और vivo में निगरानीएक 2 सप्ताह की अवधि के दौरान ral प्रतिकृति.

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Protocol

1. वायरल निलंबन की तैयारी

  1. उलरिच Koszninowski की प्रयोगशाला से MCMV व्यक्त luciferase के स्मिथ तनाव (MCMV ल्यूक 15) प्राप्त करते हैं. इस पुनः संयोजक में, luciferase जीन MCMV जीनोम की ie2 लोकस में डाला जाता है.
  2. MCMV ल्यूक बढ़ाना, संक्रमण के विभिन्न बहुलता (MOI, 0.001-1) 16 पर MCMV साथ एक murine अस्थि मज्जा stromal सेल लाइन (M2-10B4, ATCC # सीआरएल-1972) को संक्रमित. इस के लिए, 37 में सीरम मुक्त माध्यम में संवर्धित कोशिकाओं को वायरस जोड़ने डिग्री सेल्सियस एक घंटे के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटाने और DMEM 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ पूरक के साथ बदलें. पांच दिन बाद, आगे का उपयोग करें जब तक -80 में मध्यम संस्कृति और दुकान aliquots डिग्री सेल्सियस फसल.
  3. पट्टिका परख द्वारा वायरल निलंबन का अनुमापन.
    1. DMEM के 40,000 कोशिकाओं में एक 24 अच्छी तरह से थाली में 3T3 कोशिकाओं (ATCC # सीआरएल-1658) भाजित / कुएं में 1 मिलीलीटर पेनिसिलिन (200 आइयू / एमएल) और steptomycin (200 मिलीग्राम / एमएल युक्त 10% एफसीएस के साथ पूरक) और 37 पर 24 घंटे सेते डिग्री सेल्सियस
    2. DMEM में MCMV निलंबन के एक विभाज्य के धारावाहिक dilutions (10 -1 से 10 -8) तैयार करें और सेल संस्कृति के माध्यम से निकालने के बाद कमजोर पड़ने के 200 μl के साथ लक्ष्य कोशिकाओं (3T3) को संक्रमित. 37 से कम 1 घंटा सेते डिग्री सेल्सियस शीर्ष मध्यम के 1 मिलीलीटर (DMEM के 3% एफसीएस, 2% (v / v) gentamycin, 200 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 200 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 8 ग्राम / एल Carboxymethyl सेलूलोज़) जोड़ें और 37 पर 5 दिनों सेते डिग्री सेल्सियस
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 200 μl 10% formaldehyde (पानी के साथ formaldehyde के कमजोर पड़ने विषाक्त inhalations से बचने के लिए एक रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए) जोड़ने, और कमरे के तापमान पर 6 घंटा incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें. बाहर pipetting द्वारा संस्कृति के माध्यम + Fixator निकालें और 200 μl सेल धुंधला समाधान (20% इथेनॉल में 1% क्रिस्टल वायलेट (w / वी)) जोड़ें. उपयोग करने से पहले, 9 भागों मिल्ली क्यू पानी के साथ 1 हिस्सा पतला. कमरे के तापमान पर 2 मिनट सेते हैं, पानी में भिगोने से 3-4x प्लेट धोने, एक दूरबीन के साथ सजीले टुकड़े की संख्या सूखी और भरोसा करते हैं.
    4. <ली> 50 μl में 50 PFUs प्राप्त है और आगे उपयोग करें जब तक बर्फ पर छोड़ने के लिए DMEM में MCMV ल्यूक पतला. नवजात शिशुओं उम्र के 2-3 सप्ताह तक पहुँचने से पहले उच्च वायरल inoculums का प्रयोग मारक लाती है. हमारे अनुभव में, 500 PFUs इंजेक्शन के बाद हर नवजात शिशु 5 से 7 दिनों में मारक प्रेरित.

2. नवजात शिशुओं का इंजेक्शन

  1. नवजात शिशुओं (4 से 20 घंटे की उम्र में चूहों) उपलब्ध हैं, माँ तनाव और पिल्ले की अस्वीकृति को उत्पन्न होता है कि 'विदेशी' odors के साथ संक्रमण से बचने के लिए सावधानी से पिल्ले को संभालने से पहले कूड़े और दस्ताने के साथ पिंजरे के मल में हेरफेर .
  2. चित्रा 1 ए में दिखाया गया के रूप में एक इंसुलिन सिरिंज (29 जी) का उपयोग कर एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन. पृष्ठीय त्वचा के साथ नवजात शिशु को पकड़ो. उदर पक्ष के साथ, अगली टांग के नीचे सुई परिचय और धीरे peritoneal गुहा (नाभि के नीचे एक छोटी सी) प्राप्त करने के लिए subcutaneously यह धक्का. वर्तमान में हम DPBS में पतला 1% Methylene नीले इंजेक्षन और पी के लिए अस्तित्व की निगरानीवायरल संक्रमण के प्रदर्शन से पहले ractice तकनीक. Methylene नीले इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, हम intraperitoneal गुहा में वायरल निलंबन के समुचित वितरण सुनिश्चित करने के लिए पहली बार इस "प्रशिक्षण" इंजेक्शन प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं.
  3. पैदा होती है और नवजात शिशु वापस पिंजरे में जगह हो सकती है कि छोटे रक्त बूंदों को हटा दें.

3. Vivo इमेजिंग में

  1. 7 दिन, एक ही जैसा कि पहले उल्लेख किया है चेताते साथ नवजात शिशुओं को संभाल. Intraperitoneally के निश्चेतक (4 मिलीग्राम / एमएल ketamine, 0.8 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine) और प्रत्येक जानवर में μl 50 में luciferin (0.15 मिलीग्राम / छ शरीर के वजन) के मिश्रण इंजेक्षन. जानवरों का औसत शरीर के वजन 1-2 ग्राम और anesthetics के प्रति पशु की खुराक है: luciferin उत्सर्जन की अपनी अधिकतम तक पहुँच जाता है जब तक ketamine 40 ग्राम, xylazine 8 ग्राम 12-15 मिनट रुको. यह पहले से निर्धारित किया गया है और luciferin प्रदाता और इस्तेमाल इमेजिंग सिस्टम पर निर्भर करता है.
  2. पिल्ले anestheti रहे हैंजेड, भविष्य की पहचान के लिए उन्हें टैग और उत्परिवर्ती पशुओं इस्तेमाल कर रहे हैं तो फिर भविष्य जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा फसल.
  3. इमेजिंग प्रणाली में पिल्ले रखें और पूरे शरीर द्वारा उत्सर्जित प्रकाश का अधिग्रहण करते हैं. संक्रमण के बाद सात दिन, वायरस लक्ष्य ऐसे यकृत जैसे अंगों, गुर्दे, फेफड़े और लार ग्रंथियों में कई प्रतियों में दोहराया गया है, इसलिए जोखिम की अवधि कम किया जाना चाहिए. हमारे मामले में, हम 10 से 20 सेकंड (चित्रा 1 बी) के लिए अधिग्रहण प्रदर्शन करते हैं. इमेजिंग डिवाइस के अधिग्रहण के चैम्बर में मंच anesthetized जानवरों के शरीर के तापमान के अत्यधिक ठंडा करने से बचने के लिए गर्म होने की जरूरत है. इसके अलावा, यह अधिग्रहण का एक दौर के भीतर कई पशुओं की कम संकल्प छवियों को प्राप्त करने और फिर, विच्छेदन के बाद एक विशेष जानवर या एक पृथक अंग के एक भाग पर ध्यान केंद्रित करने के क्रम में मंच के करीब कैमरे के लेंस को स्थानांतरित करने के लिए उपयोगी है. सॉफ्टवेयर तेजी से बदलाव सक्षम करना होगाब्याज और स्नैपशॉट छवियों के भविष्य के निर्यात से परिभाषित क्षेत्रों के मापदंडों का (जोखिम समय, दूरी नमूना / लेंस, संवेदनशीलता), मात्रा का ठहराव.
  4. केवल सिर से प्रकाश संकेत प्राप्त करने के लिए, उच्च वायरल प्रतिकृति होता है जहां अंगों के स्तर (यकृत, फेफड़े, लार ग्रंथियों) में उत्सर्जित फोटॉनों मुखौटा और प्रदर्शन करेंगे कि एक मोटी, काले कागज के साथ laterally झूठ बोल नवजात शिशुओं के शरीर को कवर 5 से 10 मिनट (चित्रा 1C) के लिए अधिग्रहण. उसी स्थिति में पशु के विरोध के पक्ष के अधिग्रहण को पूरा करें.
  5. पिंजरे में पिल्ले reintroduce और anesthetized नवजात शिशुओं के अत्यधिक ठंडा करने से बचने के लिए शीर्ष पर एक हीटिंग दीपक रखें. नियमित बाद संवेदनाहारी वसूली की निगरानी. संकेत खुराक के साथ, संज्ञाहरण वर्तमान में 30 मिनट तक रहता है.
  6. दिन 9, 11 और 14 पर एक ही प्रक्रिया दोहराएँ. दिन 11 और 14 पर, निश्चेतक (6 मिलीग्राम / एमएल ketamine, 1.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine) की खुराक बदल जाते हैं.

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Representative Results

एक प्रतिनिधि प्रयोग चित्रा 1 में सचित्र है. MCMV ल्यूक के 50 PFUs (पैनल एक सुई के चमड़े के नीचे मार्ग कल्पना करने के लिए नीले Methylene के साथ प्रदर्शन एक ऐसी ही इंजेक्शन से पता चलता है) की intraperitoneal इंजेक्शन पर, नवजात शिशुओं anesthetized थे और एक साथ luciferase सब्सट्रेट (Luciferin, कैलिपर) के 0.3 मिलीग्राम प्राप्त किया. पंद्रह मिनट बाद, जानवरों IVIS 50 के अधिग्रहण के चैम्बर (Vivo इमेजिंग सिस्टम में, कैलिपर) में उदर पक्ष रखा गया था और पूरी पशुओं द्वारा उत्सर्जित प्रकाश एक 10 सेकंड प्रदर्शन के दौरान कब्जा कर लिया था. पैनल बी विश्लेषण के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर (छवि 3.2, कैलिपर रहते हैं) के साथ दिन 7, 9, 11 और 14 में लिया स्नैपशॉट छवियों से पता चलता है. छवियों ही सेटिंग के साथ तुले थे: अधिकतम उत्सर्जन 10 7 प्रति सेकंड फोटॉनों (पी / सेक) और 10 6 पी / सेकंड में न्यूनतम पर सेट किया जाता है. इन चित्रों से, यह पूरे जानवर में समग्र वायरल अनुमापांक समय के साथ कम हो जाती है कि प्रतीत होता है. की मात्रा एक ही सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन luminescence के इस अवलोकन (नहीं दिखाया गया है) की पुष्टि करता है. इसके बाद, हम इस तरह के फेफड़े, जिगर, गुर्दे और डिजिटल कैमरा से पता लगाया जा लार ग्रंथियों के रूप में अंगों द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों से बचाता है, जो एक मोटी, काले कागज के साथ जानवर की, सिर को छोड़कर, पूरे शरीर को कवर किया. यह अब जोखिम (हमारे मामले में 5 मिनट) सक्षम बनाता है और जिसकी तीव्रता 7 दिन और 14 दिन (पैनल सी) के बीच बढ़ जाती बाएं कान के स्तर पर एक असतत स्थान का पता चलता है. एक संकेत भी जानवर के निचले जबड़े और नाक पर दिखाई देता है. छवियाँ 100 पी / सेकंड से कम 2,000 पी / सेकंड और न्यूनतम पर एक मैक्स के साथ स्थापित किए गए थे. 0 दिन और 14 दिन के बीच ही जानवर पर प्रदर्शन यह प्रयोग, वायरल संक्रमण का विकास दर्ज की गई है और इस तकनीक के साथ मात्रा और मस्तिष्क को MCMV के प्रसार गतिशील vivo में मनाया जा सकता है कि हो सकता है कि इंगित करता है.

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चित्रा 1. प्रयोगात्मक नवजात शिशुओं में एक luminescent cytomegalovirus. ए Intraperitoneal methylene नीले इंजेक्शन से संक्रमित एक प्रतिनिधि माउस नवजात शिशु का समय बेशक विश्लेषण. बढ़ाया चित्र (दाएं) छाती पर इंजेक्शन के चमड़े के नीचे रास्ता दिखाता है. दिन 7 से ही नवजात शिशु के vivo इमेजिंग में बी MCMV ल्यूक इंजेक्शन के बाद 14 दिन के लिए. पूरे संवेदनाहृत पशु से luminescence luciferin इंजेक्शन और 10 सेकंड के जोखिम पर कल्पना की है. 14 को दिन 7 पर एक ही पशु के सिर (बाईं ओर) द्वारा उत्सर्जित सी. Luminescence. एक काले कागज के साथ शरीर के बाकी हिस्सों से शमन फोटॉनों अब जोखिम (5 मिनट) सक्षम बनाता है.

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Discussion

चूहों नवजात शिशुओं में MCMV ल्यूक प्रसार पर नजर रखने के लिए vivo इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में उपयोग करना, हम के रूप में जंगली प्रकार का विरोध करने के उत्परिवर्ती पशुओं के मस्तिष्क को वायरल प्रसार निरीक्षण कर रहे थे. मस्तिष्क के पशु और पूर्व vivo इमेजिंग के आगे विच्छेदन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में luminescent के विषाणु की उपस्थिति की पुष्टि की. इसके अलावा, हम भी MCMV E1 जल्दी प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी के साथ मस्तिष्क पतली वर्गों पर () नहीं दिखाया immunohistochemistry प्रदर्शन किया है और वास्तव में, MCMV luminescence का पता चला था जिसमें उन लोगों के रूप में ही क्षेत्रों में मौजूद है कि मनाया, इस प्रकार की है कि macroscopic के दृश्य का संकेत पूरे, जीना anesthetized जानवरों द्वारा उत्सर्जित प्रकाश वास्तव में vivo में होता है कि वायरल संक्रमण की विशेषताओं को दर्शाता है.

इस तरह के विश्लेषण व्यापक रूप luminescent कोशिकाओं के प्रत्यारोपण पर ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए उदाहरण के लिए, वयस्क जानवरों के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारे मामले में, चुनौती neona उपयोग करने के लिए थाअधिग्रहण के कक्ष के अंदर पशु के लिए दिया isoflurane के साथ गैसीय संज्ञाहरण तकनीकी कारणों के लिए संभव नहीं था जिसके लिए tes है. इसलिए, हम xylazine / ketamine के इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए मजबूर कर दिया और हम नवजात शिशुओं की छोटे आकार की खुराक अनुकूलित किया गया. हम भी उनकी मां द्वारा अस्वीकृति के जोखिम से बचने के लिए सावधानी से पिल्ले को संभाला. अनुसरण करके सिफारिशों और खुराक यहाँ वर्णित है, और vivo इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक गतिहीनता की लंबी अवधि के लिए सक्षम बनाता है, जो एक विकल्प व्यवहार्य विकल्प बन जाता पिल्ले की सुरक्षित हेरफेर और परिणाम, नवजात शिशुओं की संज्ञाहरण के लिए महत्वपूर्ण हैं जो.

Luminescence के स्तर उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है क्योंकि इसके अलावा, हम एक 2 सप्ताह की अवधि के दौरान संक्रमण की प्रगति एक कम वायरल पेरिटोनियल अंगों में लोड (जिगर, तिल्ली, गुर्दे) और फेफड़ों की विशेषता है कि प्रदर्शन मस्तिष्क में वायरस के प्रसार को उत्तरोत्तर इसका सबूत किया जा सकता है. गुउत्परिवर्ती पशुओं में नहीं है और नियंत्रण में देखा जा सकता है जो अवलोकन, अधिक जानकारी और उत्परिवर्तित जीन की प्रकृति भी चर्चा की जाएगी जहां तैयारी में एक पांडुलिपि में एक सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ दर्ज हो जाएगा है. फिर भी, हमारे इमेजिंग विधि अलग से तैयार homogenates में वायरल titers को मापने के लिए समय और संसाधन की खपत के तरीके (पट्टिका परख या मात्रात्मक पीसीआर) के बाद हर बार बिंदु के लिए कई जानवरों की इच्छामृत्यु की आवश्यकता है जो शास्त्रीय तकनीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार का गठन विच्छेदन पर अंगों. यह सांख्यिकीय महत्व तक पहुँचने के लिए पर्याप्त संख्या को कम करने के लिए निरंतर प्रयास की आवश्यकता है, जो पशु प्रयोग शासी नैतिकता के सिद्धांतों के साथ लाइन में भी है. अंत में, प्रयोग की पूरी अवधि के दौरान ही जानवर (सुबह 7 बजे टैग किए गए) के बाद का एक और लाभ यह है कि अंतर - व्यक्तिगत विविधताओं को कम करना है. नतीजतन, मात्रा का ठहराव हर समय बिंदु (दिनों 7, 9, 11 और 14) perf पर बनाया6 नवजात शिशुओं के एक समूह पर ormed बहुत परिणाम (नहीं दिखाया डेटा) के सांख्यिकीय महत्व को बेहतर बनाता है.

हम वर्तमान में उत्परिवर्ती पशुओं के मस्तिष्क में वायरल प्रसार संवर्धित तैयारी रिपोर्टों में वर्तमान MCMV के प्रसार और एक पांडुलिपि पर चूहों में परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस पद्धति का उपयोग करें. हमारा अनुभव नियंत्रण नवजात शिशुओं के एक बराबर समूह को 5-6 म्यूटेंट के एक समूह की तुलना में उच्च गुणवत्ता और महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करता है कि इंगित करता है. हम फिर भी, एक यादृच्छिक mutagenesis के कार्यक्रम से उत्पन्न phenodeviants की स्क्रीनिंग के लिए इस पद्धति को उपयुक्त नहीं समझती.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.

आचार बयान

पशु Institut d 'Immunologie एट डी' Hématologie के पशु देखभाल की सुविधा में रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में बनाए रखा गया. चूहों और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की हैंडलिंग प्रयोगशाला पशु के संरक्षण के लिए फ्रांस के कानून के अनुसार आयोजित की गई. प्रक्रिया प्राधिकरण संख्या ए 67-345 के तहत सेवा véterinaire डे ला प्रान्त डु Bas-Rhin (फ्रांस) द्वारा अनुमोदित किया गया था.

Acknowledgments

हम विषाणु विज्ञान संस्थान के पशु सुविधा का उपयोग करने की अनुमति के लिए amplifying और MCMV ल्यूक और थॉमस BAUMERT (INSERM U748, स्ट्रासबर्ग) titrating के लिए ली Tuddenham (IBMC, स्ट्रासबर्ग) धन्यवाद. INSERM, Université डी स्ट्रासबर्ग और एजेंस Nationale डे ला Recherche (ANR-08-सूरत-005-01) से वित्तीय सहायता स्वीकार किया है. उनके मास्टर परियोजना के दौरान सोनिया Beroud और लेटिशिया Lelieur की प्रारंभिक भागीदारी भी स्वीकार किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
DMEM Fisher Scientific W3523A
Methylen blue Sigma Aldrich 319112
Insulin needles VWR 613-4897
Ketamine CentraVet Ket 201
Xylazine/Vetranal Sigma Aldrich 46995
DPBS DUTSCHER P0436500
Luciferin Caliper 760504
gentamycin Sigma Aldrich G1272
penicillin/streptomycin Gibco 15070
carboxymethylcellulose Sigma Aldrich C4888
formaldehyde Sigma Aldrich F8775
crystal violet Sigma Aldrich C3886
Equipment
IVIS 50 Caliper/Perkin Elmer

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References

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का प्रयोग करें<em&gt; विवो में</em&gt; इमेजिंग नवजात शिशुओं में प्रायोगिक माउस साइटोमेगालोवायरस संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने के लिए
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Ostermann, E., Macquin, C., Bahram,… More

Ostermann, E., Macquin, C., Bahram, S., Georgel, P. Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates. J. Vis. Exp. (77), e50409, doi:10.3791/50409 (2013).

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