Summary
O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos todo-animais
Abstract
Citomegalovírus humano (HCMV ou HHV-5) é um agente patogénico de risco de vida em indivíduos imunocomprometidos. Após a infecção congênita ou neonatal, o vírus pode infectar e se replicar no cérebro em desenvolvimento, o que pode induzir a danos neurológicos graves, incluindo a surdez e retardo mental. Apesar do potencial de gravidade dos sintomas, as opções terapêuticas são limitados pela falta de uma vacina e a ausência de uma terapia antiviral específica. Por outro lado, uma descrição precisa dos acontecimentos moleculares que ocorrem durante a infecção do sistema nervoso central (SNC), uma vez que ainda falta observações principalmente derivam da autópsia de crianças infectadas. Vários modelos de animais, tais como macaco rhesus CMV, foram desenvolvidos e forneceu importantes insights patogénese CMV no SNC. No entanto, apesar da sua proximidade evolutiva com seres humanos, este modelo foi limitada pelo procedimento de inoculação intracraniana utilizada para infectar os animais e contrasistently induzir infecção do SNC. Além disso, considerações éticas têm promovido o desenvolvimento de modelos alternativos, entre os quais a infecção neonatal de ratos recém-nascidos com citomegalovírus rato (MCMV) foi recentemente levado a avanços significativos. Por exemplo, foi reportado que a injecção intraperitoneal de MCMV para Balb / c recém-nascidos resulta em infecção de neurónios e células gliais em áreas específicas do cérebro. Estas descobertas sugerem que a inoculação experimental de ratinhos pode recapitular os défices induzidos pela infecção por HCMV em crianças. No entanto, uma análise dinâmica de infecção MCMV de neonatos é difícil de realizar, porque metodologia clássica requer o sacrifício de um número significativo de animais em diferentes pontos de tempo para analisar a carga viral e / ou os parâmetros de auto-imunes. Para contornar esse obstáculo e permitir futuras investigações dos raros animais mutantes, foram aplicados in vivo tecnologia de imagem para realizar uma análise tempo-curso do viral difusão no cérebro após injecção periférica de um MCMV recombinante expressando a luciferase C57Bl / 6 neonatos.
Introduction
Citomegalovírus Humano (HCMV/HHV-5) é um membro da família β-herpesvírus. HCMV é altamente prevalente, patógeno oportunista que é geralmente adquirida durante a infância como uma infecção assintomática 1. Tal como todos os vírus de herpes, o HCMV persiste durante toda a vida do hospedeiro, cujo sistema imunitário bem controla a replicação viral. Episódios de reativação viral ocorrem principalmente em indivíduos imunocomprometidos, como pacientes transplantados que recebem medicamentos para evitar a rejeição do enxerto 2. Nos adultos, o HCMV também foi ligada a glioblastomas 3. Além disso, o HCMV é um patógeno importante para recém-nascidos com imunidade imaturo 4-6. A infecção primária no desenvolvimento do feto ou recém-nascido pode ter consequências graves. Infecção por HCMV é a causa infecciosa mais comum de defeitos congênitos e doenças da infância em países desenvolvidos. Estima-se que a incidência de infecção neonatal HCMV afecta 0,5-1% of todos os nascidos vivos, entre os quais 5-10% vão sofrer de sintomas graves, tais como microcefalia ou hipoplasia. Além disso, 10% das crianças infectadas com infecção viral subclínica, mais tarde, desenvolver sequelas levando a retardo mental, perda, defeitos visuais ou convulsão e epilepsia 7,8 audição.
Ao contrário de outros herpesvírus humanos, tais como herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) que podem ser inoculadas aos ratos via diferentes vias de injecção 9, a replicação do citomegalovírus é específico da espécie. Este recurso investigações de HCMV patogênese que são realizadas em diferentes modelos animais severamente prejudicada (rato, porquinho da índia, macaco rhesus) e seus respectivos CMVs específica do host genuínos. Todos os CMVs apresentam semelhanças significativas no tamanho do genoma e organização, tropismo tecidual e regulação da expressão gênica. Eles também induzir patologias semelhantes nas suas respectivas hospedeiro. Apesar da diversidade genômica serinterpolação de HCMV e rato citomegalovírus (MCMV) (50% das ORFs presentes no vírus humano estão identificadas no CMV de murino), o modelo de rato demonstrou recentemente a ser vantajoso, principalmente porque as estirpes mutantes podem ser testados quanto à sua capacidade para controlar viral replicação in vivo. Isto levou a uma tela genética que permitiu uma estimativa do número de genes do rato expressos na fase adulta, que compõem a "resistome" para este vírus 10. No total, isto indica que os ratinhos infectados com MCMV representam um modelo atractivo para o estudo das interacções hospedeiro-vírus em adultos. A exploração de infecção congênita por CMV é mais complexa porque as diferenças na organização camada da placenta entre humanos e camundongos prejudicar a transmissão da mãe para o feto da infecção viral em camundongos. Recentemente, a injeção direta de MCMV na placenta no dia 12,5 de gestação permitiu infecção cerebral de ratos recém-nascidos que levaram à deterioração 11 de audição. No entanto, a maioria investigations agora usam injeção intraperitoneal de 4-20 neonatos hr de idade para proporcionar a disseminação viral sistêmica potencialmente levando à infecção cerebral hematogênica, um modelo que é mais relevante do que a de uma injeção intracraniana. Este protocolo fornecido conhecimentos importantes sobre patogénese CMV e, mais particularmente, foi demonstrado que a infecção MCMV de recém-nascidos resulta em replicação virai em células neuronais e gliais localizados nos focos inflamatórios, que são infiltrados com células mononucleares como macrófagos 12. Este relatório também descrito morfogénese alterada do cerebelo acompanhado com proliferação diminuída granular neuronal e da migração e indução de múltiplos genes do interferão-estimuladas. O papel essencial das células T CD8 + para o controlo de MCMV no sistema nervoso central também foi avaliado pelo mesmo grupo 13. Um aspecto importante a considerar quando se analisa o efeito patológico de um micróbio é a dinâmica do infectaríons. No caso do MCMV, é particularmente crucial para explorar e quantificar a progressão da disseminação do vírus no cérebro em desenvolvimento de modo a compreender e prever a magnitude das futuras lesões neurobiológicos. Tradicionalmente, a quantificação da progressão de uma infecção normal requer o sacrifício dos animais infectados titule o patógeno em tecidos, tais como o cérebro, que são de outro modo inacessíveis. Este tipo de protocolo é agora desafiado por necessária melhoria do bem-estar animal e os 3Rs (Reduzir, Refine, Replace) Princípios 14. Usando em tecnologias de imagem in vivo pode permitir uma redução drástica do número de animais que são necessárias em experiências de infecção in vivo. Aqui, vamos relatar e descrever a análise tempo-curso de disseminação viral para o cérebro sobre intraperitoneal MCMV-Luc injeção para recém-nascidos de rato. Usando os mesmos animais, nós rastreados e monitorizados in vivo os locais de intensa viral de replicação durante um período de 2 semanas.
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Protocol
1. Preparação da suspensão virai
- Obter a tensão Smith de MCMV expressando luciferase (MCMV-Luc 15) do laboratório de Ulrich Koszninowski. Neste recombinante, o gene da luciferase é inserido no locus IE2 do genoma do MCMV.
- Para amplificar MCMV-Luc, infectar uma linha celular estromal de medula óssea de murino (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) com MCMV em diferentes multiplicidade de infecção (MOI, com 0,001 a 1) 16. Por isso, adicionar o vírus a células cultivadas em meio isento de soro a 37 ° C. Após uma hora, remover o sobrenadante e substituir com meio DMEM suplementado com soro de vitela fetal a 10% (FCS). Cinco dias mais tarde, a colheita do meio de cultura e armazenamento de alíquotas a -80 ° C até à sua utilização.
- Titulação da suspensão virai por ensaio de placas.
- Dividir células 3T3 (ATCC # CRL-1658) numa placa de 24 poços a 40.000 células / poço em 1 ml de DMEM suplementado com FCS a 10% contendo penicilina (200 UI / ml) e steptomycin (200 mg / mL) E incubar durante 24 horas a 37 ° C.
- Preparar diluições em série (10 -1 a 10 -8) de uma aliquota de suspensão de MCMV em DMEM e infectar as células-alvo (3T3) com 200 ul de diluição após a remoção de meio de cultura celular. Incubar 1 hora a 37 ° C. Adicionar 1 ml de Topo Medium (DMEM 3% de FCS, 2% (v / v), gentamicina, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 8 g / L de carboximetil celulose) e incubar 5 dias a 37 ° C.
- Fixar as células por adição de 200 ul de 10% de formaldeído (diluição de formaldeído com água deve ser realizado numa câmara de químico para evitar inalações tóxicas) a cada poço, e a incubação de 6 horas à temperatura ambiente. Remova o meio de cultura por pipetagem + fixador para fora e adiciona-se 200 ul de solução de coloração de células (1% de violeta de cristal (w / v) em etanol a 20%). Antes do uso, diluir uma parte com 9 partes de água Milli-Q. Incubar 2 min à temperatura ambiente, lavar a placa 3-4x por imersão em água, deixar secar e contar o número de placas com um binóculo.
<li> Diluir MCMV-Luc em DMEM para obter 50 PFU em 50 ul e deixar em gelo até à sua utilização. Usando inóculos virais mais elevados induz letalidade antes dos neonatos chegar a 2-3 semanas de idade. Em nossa experiência, a 500 PFUs induziu letalidade em todos os recém-nascidos de 5 a 7 dias após a injecção.
2. A injeção de recém-nascidos
- Quando recém-nascidos (de 4 a 20 ratos hr de idade) estão disponíveis, manipular o lixo e as fezes da gaiola com luvas antes de manusear cuidadosamente os filhotes para evitar a contaminação com odores "estrangeiros" que gostaria de sublinhar a mãe e induzir a rejeição dos filhotes .
- Realizar uma injecção intraperitoneal usando uma seringa de insulina (29 g) como mostrado na Figura 1A. Segure o recém-nascido com a pele dorsal. Com o lado ventral para cima, introduzir a agulha sob a pata dianteira e empurre-o suavemente por via subcutânea para atingir a cavidade peritoneal (um pouco abaixo do umbigo). Atualmente, injetar 1% de azul de metileno diluído em DPBS e monitorar a sobrevivência de practice antes de executar a técnica de infecções virais. Desde azul de metileno é claramente visível durante o processo de injeção, recomendamos realizar esta injeção "treinamento" em primeiro lugar para garantir a entrega correta da suspensão viral na cavidade intraperitoneal.
- Eliminar as pequenas gotas de sangue que possam surgir e colocar o recém-nascido de volta na gaiola.
3. In vivo de imagens
- No dia 7, lidar com os recém-nascidos com os mesmos cuidados, como mencionado anteriormente. Injectar intraperitonealmente uma mistura de anestésicos (4 mg / ml de cetamina, 0,8 mg / ml de xilazina) e luciferina (0,15 mg / g de peso corporal) em 50 ul em cada animal. O peso médio corporal dos animais é de 1-2 g e a dose de anestésicos por animal é: 40 mg de cetamina, xilazina 8 ug Espera 12-15 min, até que a luciferina atinge o seu máximo de emissão. Isto tem de ser determinada de antemão e depende do fornecedor luciferina e do sistema de imagem utilizada.
- Enquanto os filhotes são anesthetized, marcá-los para identificação futura colheita e um pequeno pedaço de tecido que pode ser então utilizada para a futura genotipagem se os animais mutantes são utilizados.
- Coloque as crias no sistema de aquisição de imagem e executar da luz emitida por todo o corpo. Sete dias após a infecção, o vírus foi replicado em várias cópias em órgãos-alvo, tais como o fígado, rins, pulmões e glândulas salivares e, portanto, a duração da exposição deve ser curta. No nosso caso, realizar a aquisição de 10 a 20 segundos (Figura 1B). A plataforma na câmara de aquisição do dispositivo de imagem necessita de ser aquecido para evitar arrefecimento excessivo da temperatura do corpo dos animais anestesiados. Além disso, é útil para obter imagens de baixa resolução de vários animais dentro de um ciclo de aquisição e, em seguida, subir a plataforma mais próxima da lente da câmera, a fim de se concentrar em uma parte de um animal particular ou um órgão isolado após dissecação. O software deve permitir mudanças rápidasdos parâmetros (tempo de exposição, mostra a distância / lente, sensibilidade), quantificação de regiões definidas de interesse e futuro exportação de imagens instantâneas.
- Para adquirir o sinal de luz a partir da cabeça apenas cobrir o corpo dos neonatos deitado lateralmente com um papel espesso e escuro que vai mascarar os fotões emitidos ao nível dos órgãos em que ocorre alta replicação viral (fígado, pulmões, glândulas salivares) e realizar aquisição de 5 a 10 min (Figura 1C). Realizar aquisição do lado oposto do animal, nas mesmas condições.
- Reintroduzir os filhotes na gaiola e colocar uma lâmpada de aquecimento na parte superior para evitar resfriamento excessivo dos neonatos anestesiados. Regularmente monitorar a recuperação pós-anestésica. Com a dose indicada, a anestesia actualmente dura 30 min.
- Repita o mesmo procedimento nos dias 9, 11 e 14. Nos dias 11 e 14, alterar a dose de anestésicos (6 mg / ml de cetamina, 1,2 mg / ml de xilazina).
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Representative Results
Uma experiência representativa está ilustrada na Figura 1. Após a injecção intraperitoneal de 50 PFU de MCMV-Luc (painel A mostra uma injecção semelhante realizada com azul de metileno para visualizar o percurso da agulha subcutânea), recém-nascidos, foram anestesiados e receberam simultaneamente 0,3 mg de substrato de luciferase (luciferina, Caliper). Quinze minutos mais tarde, os animais foram colocados lado ventral para cima na câmara de aquisição do IVIS 50 (In Vivo Imaging System, calibre) e a luz emitida por todo o animal foi capturado durante uma exposição de 10 seg. O painel B mostra imagens instantâneas tiradas nos dias 7, 9, 11 e 14 com o software (Living Imagem 3.2, Caliper) dedicado para a análise. As imagens foram calibradas com as mesmas configurações: Max emissão foi fixado em 10 7 fótons por segundo (p / s) e 10 min a 6 p / seg. A partir destas figuras, verifica-se que o título virai global em todo o animal diminui ao longo do tempo. Quantificação a luminescência realizada com o mesmo software confirma esta observação (não mostrado). Em seguida, cobriu o corpo inteiro, exceto a cabeça do animal com um papel grosso, escuro, que impede que os fótons emitidos por órgãos como pulmões, fígado, rins e glândulas salivares de ser detectados pela câmera digital. Isso permite que uma exposição mais longa (5 min em nosso caso) e revela um local discreto no nível da orelha esquerda, cuja intensidade aumenta entre os dias 7 e 14 (Painel C). Um sinal também aparece na parte inferior da mandíbula e nariz do animal. As imagens foram criadas com Max em 2000 p / seg e min a 100 p / seg. Esta experiência, realizada no mesmo animal, entre o dia 0 e no dia 14, indica que a evolução da infecção viral pode ser gravado e quantificado com esta tecnologia, e que a difusão de MCMV para o cérebro podem ser observados in vivo, de forma dinâmica.
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Figura 1. Análise tempo-curso de um recém-nascido representante do mouse infectados experimentalmente com um citomegalovírus luminescente A. intraperitoneal injeção azul de metileno. Nos recém-nascidos. A imagem ampliada (direita) mostra a trajetória da injecção subcutânea no tórax. B. In vivo, formação de imagens do mesmo neonato desde o dia 7 ao dia 14 após a injecção de MCMV-Luc. A luminescência de todo o animal anestesiado e é visualizado mediante injecção de luciferina e 10 segundos de exposição. C. luminescência emitida pela cabeça (lado esquerdo) do mesmo animal no dia 7-14. Extinguindo dos fotões a partir do resto do corpo com um papel escuro permite uma exposição mais longa (5 min.)
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Discussion
Usando a tecnologia de imagem vivo para monitorar MCMV-Luc disseminação de ratos recém-nascidos, pudemos observar propagação viral para o cérebro de animais mutantes, ao contrário do tipo selvagem. Além disso dissecação do animal e imagiologia ex vivo do cérebro confirmou a presença do vírus luminescente no sistema nervoso central. Além disso, também realizada imuno-histoquímica (não mostrado) em secções finas de cérebro com um anticorpo específico para a proteína E1 MCMV início e observou-se que na verdade, MCMV está presente nas mesmas áreas, como aquelas em que foi detectada luminescência, indicando assim que a visualização macroscópica A luz emitida pelo conjunto, os animais anestesiados vivo reflecte efectivamente as características da infecção viral que ocorre in vivo.
Tal análise tem sido amplamente utilizada para os animais adultos, por exemplo para monitorar o crescimento de tumores após implantação de células luminescentes. No nosso caso, o desafio era usar neonates para os quais a anestesia gasosa com isoflurano entregue ao animal dentro da câmara de aquisição não foi possível por razões técnicas. Por isso, fomos obrigados a usar a injeção de ketamina / xilazina e adaptado a dose ao pequeno tamanho dos recém-nascidos. Também lidou com os filhotes com cuidado para evitar o risco de rejeição por sua mãe. Seguindo as recomendações e doses descritos aqui, e que são críticos para a manipulação segura e os resultados dos filhotes de anestesia de recém-nascidos torna-se uma opção viável alternativa que permite longos períodos de imobilidade necessários para realizar na imagem in vivo.
Além disso, porque o nível de luminescência pode ser quantificada com o software apropriado, demonstrou-se que a progressão da infecção durante um período de 2 semanas é caracterizada por uma diminuição da carga viral nas peritoneais órgãos (fígado, baço, rins), e os pulmões, enquanto a propagação do vírus no cérebro pode ser progressivamente evidenciado. Thé de observação, que pode ser observado nos animais mutantes e não nos controlos, serão documentados com mais detalhes e uma análise estatística num manuscrito em preparação em que a natureza do gene mutado também será discutida. No entanto, o nosso método de imagem constitui uma melhoria significativa em relação às técnicas clássicas que requer a eutanásia a vários animais para cada ponto de tempo, seguido por métodos de tempo e de recursos de consumo (teste de placas ou PCR quantitativo) para medir títulos virais em homogenatos preparados a partir de diferentes órgãos após a dissecação. Isso também está em consonância com os princípios éticos que regem a experimentação animal, que exigem esforço constante para minimizar os números suficientes para alcançar significância estatística. Finalmente, outra vantagem da sequência do mesmo animal (marcado no dia 7), durante toda a duração da experiência é a de reduzir as variações inter-individuais. Como resultado, a quantificação feita em cada ponto de tempo (dias 7, 9, 11 e 14) perfORMED num grupo de 6 neonatos melhora muito a significância estatística dos resultados (dados não mostrados).
Atualmente usamos esta metodologia para analisar o impacto de mutações em camundongos na disseminação da MCMV e um manuscrito atualmente em relatórios de preparação aumentada propagação viral no cérebro de animais mutantes. Nossa experiência indica que comparando um grupo de 5-6 mutantes para um grupo equivalente de recém-nascidos de controle fornece dados de alta qualidade e significativo. Nós não, no entanto, considerar esta metodologia adequada para a triagem de phenodeviants gerados por um programa de mutagênese aleatória.
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Disclosures
Os autores declaram não competindo interesse financeiro.
Declaração de ética
Os animais foram mantidos em condições livres de patógenos na instalação do Institut d'Imunologia et d'Hématologie cuidados com os animais. Manipulação de ratos e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a lei francesa para a Protecção dos Animais de Laboratório. O procedimento foi aprovado pelo serviço veterinário de la Préfecture du Bas-Rhin (França) com o número de autorização A-67-345.
Acknowledgments
Agradecemos Lee Tuddenham (IBMC, em Estrasburgo) para amplificar e titulação MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Estrasburgo) para permissão de uso do biotério do Instituto de Virologia. Apoio financeiro do INSERM, Université de Strasbourg ea Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) é reconhecido. A participação inicial de Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante seu projeto de Mestre também é reconhecido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
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