Summary
Qui, presentiamo un metodo per l'analisi al microscopio ottico di cellule terminali in tracheali
Abstract
La forma delle cellule è fondamentale per la funzione delle cellule. Tuttavia, nonostante l'importanza della morfologia cellulare, poco si sa su come le singole cellule generano forme specifiche. Cellule terminali tracheali Drosophila sono diventati un potente modello genetico per individuare e chiarire i ruoli dei geni necessari per la generazione di morfologie cellulari. Cellule terminali sono una componente di una rete tubolare ramificata, il sistema tracheale che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni. Cellule terminali sono un ottimo modello per studiare questioni di forma delle cellule in quanto in possesso due architetture cellulari distinti. In primo luogo, cellule terminali hanno una morfologia ramificata elaborata, simile ai neuroni complessi, in secondo luogo, i rami terminali cellulari sono formate da tubi sottili e contengono un lume intracellulare di membrana. Analisi quantitativa di terminale numero ramo cella, organizzazione ramo e forma singola branca, può essere utilizzato per fornire informazioni sul ruolo di specifici meccanismi geneticocanismi nella realizzazione di una cella ramificata. Analisi di formazione del tubo in queste cellule può rivelare meccanismi conservate della tubulogenesi comuni ad altre reti tubolari, quali la vascolarizzazione vertebrato. Qui si descrivono le tecniche che possono essere utilizzate per risolvere rapidamente, immagine e analizzare sia i modelli di ramificazione e la formazione del tubo in cellule terminali all'interno di larve di Drosophila. Queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare cellule terminali in animali wild-type e mutanti, o mosaici genetici. A causa della elevata efficienza di questo protocollo, è anche adatto per la genetica, la base di RNAi, o schermi di droga nel sistema tracheale Drosophila.
Introduction
La forma delle cellule è critico per la funzione delle singole celle all'interno di un organismo, così come cellule che funzionano come parte di un tessuto o organo. Usiamo Drosophila cellule terminali tracheali, un componente del sistema respiratorio degli insetti, per indagare i meccanismi molecolari che partecipano al controllo di due tipi conservate della morfologia cellulare: ramificazione e di formazione del tubo (lumenogenesis). Cellule terminali sono situati alle estremità di una rete di tubi ramificati che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni 1 e hanno una morfologia ramificato elaborato che dipende da un FGF via di segnalazione che è controllato da livelli di ossigeno locale all'interno tessuti bersaglio 2. Rami di cellule terminali sono tubi sottili, con piene di gas lume subcellulari che attraversa ogni ramo. Le architetture cellulari distinti di cellule terminali, insieme con la facilità con cui l'analisi genetica può essere eseguita in Drosophila, rendono queste cellule un modello eccellente fo meccanismi di escrescenza cellulare investigare, ramificazione, e formazione del tubo intracellulare. Cellule terminali hanno dimostrato un modello utile per comprendere alcune delle vie di segnalazione che portano alla differenziazione delle cellule ramificate, escrescenza, e la maturazione 2-4. Utilizzando questo sistema imparziale, schermi avanti genetici per mutanti morfogenesi delle cellule sono stati eseguiti, cedendo intuizioni in meccanismi che controllano la forma delle cellule 5,6. Per esempio, questi schermi hanno rivelato che una RabGAP specifica è richiesta per la polarità del citoscheletro e il traffico delle vescicole in formazione di lumen e di posizionamento 7; che l'adesione integrine-mediata è necessario per la stabilità ramo 8, e che le proteine PAR-polarità epiteliali regolare il traffico di membrana polarizzata richiesto sia per ramificazione e formazione lumen 9. Altri studi in cellule terminali hanno dimostrato che è necessaria l'accumulo di actina asimmetrico e organizzazione dei microtubuli per l'allungamento delle cellule e lumenogenesis Qui, descriviamo un metodo per risolvere rapidamente intatto terzo instar larve di Drosophila per l'analisi del terminale cellulare ramificazione e la formazione di lumen. Questo protocollo può anche essere eseguita su entrambi i primi e secondi animali instar. Chiave di questa tecnica è la capacità di visualizzare cellule terminali che sono geneticamente etichettati mediante espressione proteina fluorescente direttamente attraverso la cuticola larvale degli animali intatti. Dal momento che questa procedura non richiede manipolazioni post-fissazione, come colorazione degli anticorpi, di osservare le cellule, che ben si adatta ad analisi ad alta velocità, tra cui lo screening genetico o di droga. Espressione della proteina fluorescente rivela la struttura dei rami cytoplasmically-riempite. Formazione del tubo può essere monitorato in parallelo utilizzando microscopia brightfield per identificare il lume pieno di gas, che contrasta con il fluido circostante-fillndr tessuti. Incluso in questo protocollo è il metodo per la generazione di mosaici genetici basati sul sistema MARCM 11, per la produzione di cellule terminali mutanti omozigoti marcati con proteine fluorescenti in animali altrimenti non etichettati. Ciò è necessario, poiché cellule terminali elaborano solo le loro strutture complesse relativamente tardi nello sviluppo; mosaici genetici consentono di bypass delle esigenze del gene in altri tessuti precedenti in sviluppo. . Per generare cloni marcm, trachea sono etichettati con il driver tracheale specifico fiato (btl) 12 qui descritto è il protocollo per il cromosoma X di Drosophila, per altri cromosomi, una procedura simile può essere utilizzato, con i reagenti genetica appropriata al cromosoma essere esaminato. Qui, trachea sono etichettati da espressione di una GFP cytoplasmically localizzata, ma la procedura funziona ugualmente bene con espressione di altre proteine fluorescenti, quali DsRed. Inoltre, abbiamo incluso un metodo per quantificare modelli di ramificazione e la formazione di lumen in cellule terminali, sulla base di metodi sviluppati per la caratterizzazione di modelli neuronali 13 filiali. Questo tipo di dati quantitativi può essere critica nel discernere il ruolo preciso dei geni nel processo di ramificazione o lumenogenesis, oltre a permettere un confronto diretto tra diversi mutanti 9.
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Protocol
1. Generazione Mosaico
- Genetic Croce
w FRT 19A vasca: Gal80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (maschi) X * FRT 19A / Bal (femmine), dove * rappresenta il mutante da esaminare. Nota: Impostare attraversare almeno un giorno prima dell'esperimento, in quanto ciò permette animali di accoppiarsi in modo appropriato. - Pre-lay: croce Trasferimento a fiale volare-alimentari con una piccola macchia di pasta di lievito di birra fresco collocato sul supporto. Lasciare posare per 1 ora a 25 ° C.
- Lay: animali trasferimento dal pre-lay fiala per una fiala fresco con una piccola macchia di pasta di lievito fresco. Lasciare posare per 6 ore a 25 ° C.
- Adulti trasferimento al pre-laici fiala per la conservazione e l'uso in esperimenti successivi. Scossa raffreddano immediatamente il flaconcino contenente lay 0-6 hr vecchi embrioni per 45 min a 38 ° C, in un bagno di acqua circolante. Nota: La superficie del cibo dovrebbe essere sotto il livello dell'acqua per verificare tutteembrioni sono opportunamente calore scioccato.
- Incubare calore fiale scioccato a 25 ° C per 4-5 giorni fino al terzo stadio le larve iniziano a vagare.
2. Screen per Mosaico Animali
- Utilizzando una pinza sottile raccogliere delicatamente errante larve terzo instar dai lati del flaconcino e metterli in refrigerati 100% glicerolo in un piccolo piatto di plastica.
- Esaminare le larve utilizzando un microscopio ad alto ingrandimento-dissezione dotato di ottica a fluorescenza. Identificare le larve con espressione mosaico di cellule tracheali fluorescente. Tipicamente, questo può essere fatto a 10-20X ingrandimenti.
3. Fissazione di calore
- Utilizzando una pinza sottile accuratamente raccogliere animali mosaico fuori del piatto e posto in una goccia di fresco 100% di glicerolo su un mm bianco vetro vetrino da microscopio 75x25x1. Nota: animali multipli possono essere inseriti nei menu (Figura 1A).
Animali possono anche essere posizionate in una goccia di glicerolo direttamente su un vetrino,ma bisogna fare attenzione durante la fissazione (passo 3.2), come gli animali si riscalda molto rapidamente e possono diventare eccessivamente fisso. - Posto vetrino sul vetro 70 ° C con blocco termico finché gli animali solo fermarsi movimento, non più di 20 sec per una diapositiva, e 10 sec per un vetrino (Figura 1B). Animali volontà guizzo inizialmente ma fermarsi e diventare rigido e allungato una volta morto. Nota: l'esposizione a fonti di calore troppo lungo per evitare di danneggiare rami terminali e lumen, così come rendere il segnale GFP fioca e diffusa. Per un'efficienza ottimale si raccomanda di avere il blocco di calore nella stessa stanza come i microscopi.
- Utilizzando una pinza sottile accuratamente orientare tutte le larve nei menu in una sola direzione, in modo tale che tutte le larve sul vetrino sono orientate parallelamente tra loro (Figura 1C).
- Posizionare delicatamente un micro vetro di copertura 18x18mm su di larve (o invertire il vetrino su un vetrino) ed evitare formazione di bolle (Figura 1D). Nota: coprioggetto non può trovarsi esattamentepiatta su larve, questo non è un problema.
- Larve di immagine entro 30 min. Cellule terminali fissi di calore si degrada e segnale GFP diventerà molto diffuso.
4. Nel Imaging in vivo di cellule terminali tracheali
- Porre il vetrino sul palco di uno stereomicroscopio composto. Con obiettivo 5X individuare i due tronchi dorsali paralleli da anteriore a posteriore sulla superficie dorsale dell'animale (Figura 1F). Individuare le due cellule terminali dorsali, direttamente tra i due tronchi dorsali. Ciò consente di identificare il segmento appropriato per l'analisi.
- Una volta orientato, ruotare gli animali di immagine cellule terminali desiderati. Per fare questo, spingere con attenzione il vetrino sul bordo con le pinze perpendicolari all'asse lungo delle larve, lentamente rotolare le larve sotto il vetrino (figure 1E e 1G).
- Selezione delle cellule terminali appropriati è fondamentale per ottenere risultati coerentie confronti tra mutanti. (FB) cellule terminali La filiale di grasso corporeo si trovano facilmente adiacente al tronco dorsale, laterale alla linea mediana. Il gruppo G cellule terminali laterali (LG) sono facilmente reperibili e si trovano appena laterale della linea mediana ventrale (Figura 1H). Nota: nelle (TR10) segmenti più anteriore (Tr1) e posteriore la disposizione delle cellule terminale è divergente da altri segmenti. Analizziamo solo cellule terminali in segmenti Tr2-TR9. Cellule terminali dorsali hanno un modello di ramificazione più stereotipati di altre cellule terminali tracheali. Questo può dipendere da ulteriori segnali autonomi non-cellule, e questo dovrebbe essere considerato al momento di decidere se includerli nell'analisi.
- Una volta che una cellula terminale di interesse è stato identificato, acquisire un'immagine utilizzando l'ingrandimento desiderato, in genere 10X o 20X è meglio (Figura 2A). Nota: a causa di modelli di ramificazione variabile, cerca di catturare le immagini che includono come molti rami e suggerimenti filiali possibile.
- Senza spostare il palco, spegnere la fluorescenza e accendere la luce trasmessa per catturare un'immagine brightfield della stessa cella e il piano focale (Figura 2B). Il lume sarà visualizzato come scuro contrastante all'interno dello spazio cellula terminale. Se la pianificazione di quantificare rami terminali cellulari e lumen, raccogliere più immagini in più piani focali di ogni cellula terminale.
5. Analisi e quantificazione dei Terminal cellulare Morfologia Utilizzando ImageJ
- Aprire le immagini fluorescenti e campo chiaro utilizzando il ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Utilizzando il "Aggiungi tracciati" strumento, tracciare manualmente i rami e lume l'intera cella terminale.
- Utilizzando il "tracciati Label" strumento, cambia titolo e reColor assegnare ogni riga all'interno della traccia di una denominazione specifica.
- Utilizzando il "Set parametri" strumento, regolare la larghezza della linea 6-10 pixel (512x512 per immagini ottenute dalla fotocamera digitale collegata al microscopio composto. Per le telecamere risoluzione maggiore o minore, la larghezza in pixel deve essere ripartita in modo appropriato), utilizzando tutti altre impostazioni predefinite, e scegliere "OK". Quindi utilizzare il "Make istantanea" strumento per scattare una foto. Scegliere "Disegna traccia" per ottenere una fotografia istantanea della traccia che possono essere visualizzati fianco a fianco con l'originale.
- Selezionare il "tracciati Measure" strumento e selezionare il tipo di tracciamento (cioè che si dirama a misura in base alle designazioni specifiche assegnate in fase 5.3). Quindi, selezionare "Visualizza misurazioni tracing" e "Cancella misurazioni precedenti" quindi fare clic su "Esegui". Ciò produrrà un foglio elettronico che contiene il nome, etichetta, lunghezza (in pixel), e altri dati per l'immagine. Questi dati possono poi essere salvati come un foglio di calcolo Excel di Microsoft per ulteriori statisticheanalisi.
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Representative Results
Risultati sono mostrati in Figura 2. Un singolo gruppo laterale (LG) cellula terminale indica vasta subcellulare ramificazione (visualizzata da GFP, A) e un gas piene lume subcellulari che attraversa ciascuno dei rami (visualizzato mediante microscopia brightfield; B). Queste immagini sono state raccolte da un mosaico L3 larva, generato usando il sistema MARCM descritto nelle sezioni 1 e 2, e di calore fisse e ripreso, come descritti ai punti 3 e 4. Pannelli C e D mostrano una traccia NeuronJ generato, come descritto nella sezione 5, dei rami e il lume, rispettivamente, delle immagini mostrate in A & B. Pannelli E & F mostrare la posizione del grasso corporeo (FB), filiale di una larva preparato per l'imaging, come descritto nelle sezioni 3 e 4. Si noti che in questo esempio, l'animale non è un mosaico, e GFP è espresso in tutto il sistema tracheale. Pannelli G e H mostrano un esempio di una cella terminale GFP-etichettata che era calore fissato per troppo tempo. GFP è diffusa (G), branches sono ripartiti e porzioni di lumen sono gas non sono più piene, apparendo così come interruzioni delle immagini campo chiaro.
Figura 1. Preparazione larve e identificazione di cellule terminali. (A) Inserire larva in una goccia di 100% glicerolo su un vetrino. (B) larve multipla può essere disposto per fissaggio a caldo. (C) Dopo la fissazione calore, organizzano larve paralleli tra loro e perpendicolare all'asse lungo della diapositiva. (D) vetro di copertura posto sopra le larve. (E) per riorientare le larve, con attenzione spingere vetro di copertura con una pinza a rotolare gli animali. (F) Wild-tipo terza larva instar con GFP espresso tutta il sistema tracheale. I tronchi dorsali appaiati (DT) sono visibili su Thlato dorsale e. (G) La stessa larva dopo la tecnica di laminazione con il lato ventrale ora rivolto verso l'alto. (H) Schema di vista laterale di due hemisegments tracheali terza instar (uno hemisegment è evidenziata in grigio). Cerchi indicano gruppo laterale (LG) e il grasso corporeo (FB) cellule terminali che usiamo per la quantificazione. Le linee tratteggiate rappresentano altri rami del sistema tracheale che noi non ordinariamente quantificare. Per una descrizione completa dei rami tracheali in un segmento larvale, consultare Rif. 1.
Figura 2. Immagini rappresentative. (AD) Mosaico L3 larve sono stati generati utilizzando la tecnica MARCM (sezione 1) e fissati e ripreso con il protocollo nelle sezioni 2-4. Il modello di ramificazione di una singola cellula terminale LG was visualizzate da espressione mosaico di GFP (A), il lume a gas piene visualizzati con campo chiaro microscopia (B). (C) Tracciamento del modello di ramificazione della cella in A, generato utilizzando NeuronJ (sezione 5). (D) Tracciamento del lume piene di gas della cella in B, generati utilizzando NeuronJ (sezione protocollo 5). (E, F) Un corpo (FB) cellula terminale grasso (evidenziato dal cerchio rosso) visualizzato mediante espressione GFP in tutto il sistema tracheale (E) e microscopia a campo chiaro (F) in una larva preparato dal protocollo nelle sezioni 2-4. (G, H) Esempio di artefatti fissaggio ottenuti quando il campione viene riscaldato per un periodo troppo lungo. GFP è diffusa e piccoli rami hanno degradato (G). Aree di lumen anche non appaiono più piena d'aria (freccia in H). Barra della scala: 100 micron.
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Discussion
La tecnica di fissazione di calore qui descritto è uno strumento rapido e conveniente per l'imaging Drosophila larvali cellule terminali tracheali. Qui, usiamo questa tecnica per esaminare la ramificazione e lume modello di cellule wild-type. Cellule tracheali esprimono GFP, guidato dal promotore specifico tracheale senza fiato, possono essere facilmente visualizzati attraverso la cuticola larvale dopo la fissazione di calore. Gli specifici modelli di ramificazione di cellule terminali individuali, così come quelle del lume pieni d'aria, possono essere rapidamente visualizzati e misurata con questo metodo. Questa tecnica può anche essere eseguita sia prima e seconda larve instar. Tuttavia, bisogna fare attenzione nel fissare animali più piccoli, come espressione della proteina fluorescente può essere facilmente perturbato.
Nel metodo qui illustrato, descriviamo una analisi di animali mosaico con GFP espresso in cellule singole tracheali. Tuttavia, le stesse tecniche sono applicabili ad analisi di cellule tracheali sotto un number di manipolazioni sperimentali. Per esempio, gli animali in cui l'espressione genica è stato alterato da approcci molecolari, in tutto il sistema tracheale o nelle singole celle di espressione dei transgeni RNAi o proteine modificate, può anche essere esaminato con questo approccio. Trattamenti non genetici che influenzano lo sviluppo delle cellule di terminale, come farmaci o ipossia 2,14, possono anche essere caratterizzati con questi metodi. In questi ultimi casi, è necessario partire da un archivio di Drosophila costitutivamente esprimono GFP o un'altra proteina fluorescente in tutto il suo sistema tracheale al fine di visualizzare ramificazione modelli. Gas di riempimento può essere esaminato indipendentemente espressione della proteina fluorescente.
Qui vi mostriamo solo alcuni esempi di senza tag (cytoplasmically localizzata) GFP essere utilizzati per etichettare il sistema tracheale. Tuttavia, i metodi descritti qui sono anche adatti per il rilevamento di altre proteine native fluorescenti, quali DsRed, così come pro fluorescenteproteine che sono stati modificati per essere localizzati alle strutture cellulari specifiche. Per esempio, actina: GFP o tubulina: fusioni GFP può essere utilizzato per visualizzare il citoscheletro tracheale 10.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Gillian Stanfield per i commenti sul manoscritto. TAJ è sostenuto dalla University of Utah Genetica formazione di Grant T32-GM007464 dal NIH NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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