Summary
Здесь мы представляем метод для легкого анализа микроскопии клетки трахеи терминала в
Abstract
Сотовые формы имеет решающее значение для функции клеток. Однако, несмотря на важность морфологии клеток, очень мало известно о том, как отдельные клетки производят конкретные формы. Трахеи клетки Drosophila терминала стали мощным генетическая модель для определения и выяснения роли генов, необходимых для создания сотовой морфологии. Терминал клетки являются составной частью разветвленных трубчатых сети, трахеи система, которая функционирует для подачи кислорода к внутренней ткани. Терминал клетки являются прекрасной моделью для исследования вопросов формы клеток, поскольку они обладают двух различных сотовых архитектур. Во-первых, терминал клетки имеют сложную разветвленную морфологии, похож на комплекс нейронов, во-вторых, конечные ветви клетки образуются в тонких трубок и содержат мембраны внутриклеточных просвет. Количественный анализ выводом элемента номер ветви, отраслевой организации и индивидуальные формы филиал, могут быть использованы для предоставления информации о роли специфических генетических мехамов в создании разветвленной клетки. Анализ трубка образование в этих клетках может выявить консервативные механизмы тубулогенез общими для других трубчатых сетей, таких как позвоночные сосудистой сети. Здесь мы опишем методы, которые могут быть использованы для быстро исправить, изображений и проанализировать как ветвящиеся структуры и образование трубки в терминале клеток внутри личинки дрозофилы. Эти методы могут быть использованы для анализа терминал клетки дикого типа и мутантных животных, или генетических мозаик. Из-за высокой эффективности этого протокола, он также хорошо подходит для генетических, на основе РНК-интерференции, или наркотики экранов у дрозофилы трахеи системы.
Introduction
Сотовые форма является критической для функции отдельных клеток в организме, а также клетки, которые функционируют как часть ткани или органа. Мы используем Drosophila трахеи клетки терминал, компонент насекомых дыхательной системы, исследовать молекулярные механизмы, которые участвуют в контроле двух консервативных типов клеточной морфологии: ветвления и образование трубки (lumenogenesis). Терминал клетки расположены на концах сети разветвленных труб, который функционирует для доставки кислорода к внутренним тканям 1 и имеют сложную разветвленную морфология которых зависит от пути FGF сигнализации, которая управляется на местном уровне кислорода в тканях-мишенях 2. Конечные ветви ячейки тонких трубок, с газонаполненными субклеточную просвет проходит через каждого филиала. Различных сотовых архитектур терминал клетки, наряду с легкость, с которой генетический анализ может быть выполнен в Drosophila, делает эти клетки отличный е моделиили следственного механизмов клеточных вырост, ветвление и внутриклеточное образование трубки. Терминал клетки доказали полезной моделью для понимания некоторых сигнальных путей, ведущих к разветвленной дифференцировки клеток, заросли, и созревание 2-4. Используя эту систему объективной, вперед генетический скрининг мутантов клетки морфогенеза были выполнены, что дает информацию о механизмах регуляции клеточного формы 5,6. Например, эти экраны показали, что конкретный RabGAP требуется для цитоскелета полярности и везикул в просвете формирования и позиционирование 7; что интегрин-опосредованную адгезию требуется для ветви стабильность 8, и что эпителиальные PAR-полярность белки регулируют поляризованный торговли мембраны требуется для ветвления и формирования просвета 9. Другие исследования в терминале клетках показали, что асимметричный накоплению актина и организации микротрубочек необходима для удлинения клеток и lumenogenesis Здесь мы описываем способ быстро исправить нетронутыми третьего возраста личинок Drosophila для анализа клеммой элемента ветвления и образование просвета. Этот протокол также может быть выполнена на обоих первом и втором животных возрастной стадии. Ключ для этого метода является возможность визуализации терминал клетки, генетически меченных флуоресцентными экспрессии белка непосредственно через личиночной кутикулы интактных животных. Так как эта процедура не требует никакой последующей фиксацией манипуляций, таких как окрашивание антител, наблюдать клетки, он хорошо подходит для высокопроизводительного анализа, в том числе генетические или скрининга лекарственных средств. Флуоресцентные экспрессии белка раскрывает структуру цитоплазматически заполненные ветвей. Образование трубки можно отслеживать в режиме параллельного использования светлого микроскопии для идентификации газонаполненных просвета, который контрастирует с окружающей жидкостью заполненияЭд тканей. В этом протоколе является способ генерации генетической мозаики на основе системы MARCM 11, для производства гомозиготных мутантных клеток терминал меченных флуоресцентными белков в противном случае немеченого животных. Это необходимо, так как терминал клетки только разработать свои сложные структуры относительно поздно в процессе развития; генетической мозаики позволяют обход требований гена в других тканях ранее в развитии. . Для генерации MARCM клонов, трахеи помечены использованием трахеи конкретного драйвера дыхание (бут) 12 Описанный здесь протокол для хромосомы Drosophila X, для других хромосом, аналогичная процедура может быть использована, с генетическими реагентов соответствующей хромосоме быть рассмотрены. Здесь, трахеи помечены путем экспрессии цитоплазматически локализованных GFP, но процедура работает одинаково хорошо с экспрессией другие флуоресцентные белки, такие как DsRed. Кроме того, мы включили метод для количественного ветвящиеся структуры и формирования в просвете терминала элементы на основе методов, разработанных для характеристики моделей нейронных филиал 13. Этот вид количественных данных может иметь решающее значение в плане определения точной роли генов в процессе разветвления или lumenogenesis, а также позволяет прямое сравнение различных мутантов 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мозаика поколения
- Генетические Креста
W FRT 19А ванна: GAL80 ФЛП 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (мужчины) X * FRT 19А / Бал (женщины), где * представляет собой мутанта, подлежащих рассмотрению. Примечание: Настройка пересечь по крайней мере за один день до эксперимента, так как это позволяет животным спариваться соответствующим образом. - До прокладки: Трансфер крест летать питания флаконы с небольшим мазком свежей пасты дрожжей поместить на носитель. Разрешите заложить в течение 1 часа при 25 ° C.
- Lay: Трансфер животных от до прокладки флакон новый флакон с небольшой мазок свежей пасты дрожжей. Разрешите заложить в течение 6 часов при 25 ° C.
- Передача взрослых обратно в предварительно лежал флакон для хранения и использования в последующих экспериментах. Сразу теплового шока, что к чему флакон, содержащий 0-6 часа эмбрионы в течение 45 мин при 38 ° С, в циркуляционной водяной бани. Примечание: поверхность пищевого продукта должна быть ниже уровня воды для проверки всехЭмбрионы соответствующим тепловому шоку.
- Выдержите тепловому шоку флаконах при 25 ° С в течение 4-5 дней, пока третий возраст не начинают бродить.
2. Экран для мозаичных Животные
- Использование тонких щипцов осторожно выбирать блуждающий личинок третьего возраста от стенок сосуда и поместить их в охлажденный 100% глицерина в небольшую пластиковую пластину.
- Изучить личинки использовании большого увеличения рассекает микроскоп оснащен флуоресцентным оптики. Определить личинки с мозаичными выражение флуоресцентно меченных трахеи клетками. Как правило, это может быть сделано в 10-20-кратным увеличением.
3. Термофиксации
- Использование тонких щипцов тщательно подобрать мозаику животных из блюда и место в капле свежей 100% глицерина на 75x25x1 мм белый предметное стекло микроскопа. Примечание: несколько животных могут быть помещены в капли (рис. 1А).
Животные могут также быть помещены в капле глицерина непосредственно на покровное стекло,но необходимо соблюдать осторожность при фиксации (п. 3.2), а животные будут нагреваться очень быстро и может стать более фиксированной. - Место стекло на 70 ° C тепла блока до животных не просто остановить движение, не более 20 сек для слайд, и 10 сек для покровного стекла (рис. 1В). Животные извиваться изначально, но остановиться и становятся жесткими и удлиненные раз мертв. Примечание: слишком длинные воздействие тепла может привести к повреждению и конечные ветви люмен, а также сделать сигнал GFP тусклым и диффузным. Для оптимальной эффективности рекомендуется иметь нагревательный блок в одной комнате с микроскопами.
- Использование тонких щипцов тщательно ориентировать все личинки в капле в одном направлении, так что все личинки на слайде ориентированы параллельно друг другу (фиг. 1С).
- Аккуратно 18x18mm микро стеклянной крышкой в верхней части личинки (или инвертировать покровное на предметное стекло) и избежать образования пузырей (рис. 1D). Примечание: покровного не может лежать точноплоская над личинками, это не проблема.
- Изображения личинок в течение 30 мин. Тепло фиксированных клетках терминал будет деградировать и GFP сигнал станет очень диффузным.
4. Прижизненного изображения трахеи Клетки терминал
- Поместите слайд на стадии соединение стереомикроскопа. Использование 5-кратным цель найти двух параллельных стволов спинного работает спереди назад на спинной поверхности животного (рис. 1F). Найдите два спинных клетки терминала, непосредственно между двумя спинным стволов. Это помогает определить соответствующий сегмент для анализа.
- После ориентированной, вращать изображения животных нужные ячейки терминала. Чтобы сделать это, осторожно толкать покровное на краю пинцетом, перпендикулярных продольной оси личинки, медленно прокатки личинки под покровным (фиг. 1E и 1G).
- Выбор подходящей клетки терминал имеет решающее значение для устойчивых результатови сравнения между мутантами. Филиал жира тела (FB) клетки терминала можно легко найти рядом с спинной ствол, сбоку от средней линии. Боковые группы G терминал клетки (LG) легко найдены и находятся всего в боковом из вентральной срединной линии (рис. 1H). Примечание: в самой передней (Tr1) и задний (Tr10) сегментах расположения терминала клетки расходится от других сегментов. Мы только анализировать терминала клеток в сегментах TR2-TR9. Клетках спинного терминала имеют более стереотипные ветвления, чем другие клетки трахеи терминала. Это может зависеть от дополнительных, не автономные ячейки сигналы, и это следует учитывать при принятии решения о включении их в анализе.
- После выводом элемента интерес был определен, захват изображения с помощью желаемого увеличения; обычно 10X или 20X лучше (рис. 2А). Примечание: в связи с переменной ветвящиеся структуры, пытаются захватить изображения, в которых, как многие отрасли и отраслевых советов, как возможно.
- Не двигая сцену, выключите флуоресценции и включите проходящем свете, чтобы захватить светлое изображение того же клетке и фокальной плоскости (рис. 2В). Просвет будет представить как мрачно контрастные в терминале пространстве клетки. Если планируете количественно выводом элемента филиалов и люмен, собирать несколько изображений в различных фокальных плоскостях каждого терминала клетки.
5. Анализ и количественное определение терминала морфологии клеток с использованием ImageJ
- Откройте люминесцентные и светлого изображения с помощью ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) плагин NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Используя кнопку "Добавить обводка" инструмент, вручную отслеживать филиалов и просвета всей клетки терминала.
- Использование "Этикетка обводка" инструмент, переименовывать и Recolor назначить каждой линии в след специальное обозначение.
- Использование "Настройка параметров" инструмент, регулировать толщину линии из 6-10 пикселей (512x512 для изображений, полученных с цифровой камеры подключены к сложным микроскопом. Для выше или ниже разрешение камер, то ширина должна быть масштабной должным образом), используя все остальные параметры по умолчанию, и выберите "OK". Затем с помощью "Сделать снимок" инструмент для получения изображения. Выберите "Нарисуй след", чтобы получить снимок следов, которые могут быть показаны бок-о-бок с оригиналом.
- Выберите "Мера обводка" и выберите инструмент отслеживания типа (т.е. какие отрасли для измерения на основе конкретных обозначений задавался в шаге 5.3). Далее выберите «Показать отслеживания измерений" и "Очистить предыдущих измерений", а затем нажмите кнопку "Выполнить". Это позволит получить таблицу, содержащую имя, этикетки, длина (в пикселях), и другие данные для изображения. Эти данные могут быть сохранены в виде таблиц Microsoft Excel для дальнейшей статистическойанализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты показаны на рисунке 2. Одной боковой группы (LG) терминала ячейка показывает обширную субклеточную ветвления (визуализировали GFP;) и газонаполненные субклеточную просвет проходит через каждую из ветвей (изучались под микроскопом светлое, б). Эти изображения были собраны из личинки мозаики L3, генерируется с использованием MARCM системы, описанные в разделах 1 и 2, а тепло фиксируется и отображаемого, как описано в разделах 3 и 4. Панели C и D показывают NeuronJ генерируется следа, как описано в разделе 5, филиалов и просвета, соответственно, изображения, показанные на панели & B. E & F показать расположение жира (FB) филиал в личинку подготовлены для работы с изображениями, как описано в разделах 3 и 4. Отметим, что в этом примере животное не мозаики, и GFP выражается во всей системе трахеи. Панели G и H в качестве примера показана GFP-меченых терминал клетка, которая была зафиксирована тепла в течение слишком долгого времени. GFP диффузный (G), Brancheс сломались и части люмен больше не заполненных газом, таким образом, появляясь как перерывы в светлое изображение.
Рисунок 1. Подготовка личинок и идентификации терминала клеток. (A) Место личинка в капле 100% глицерина на предметном стекле. (B) Несколько личинок могут быть размещены на тепло фиксации. (C) После термической фиксации, организовать личинки параллельно друг другу и перпендикулярно длинной оси слайда. (D) Снять крышку стекла на личинок. (E) переориентировать личинки, аккуратно нажмите покровного стекла щипцами, чтобы бросить животных. (F) дикого типа третьей взрослой личинки с GFP выразил всем трахеи системы. Парных тыльных стволов (DT) видны на гоэлектронной спинной стороне. (G) То же личинку после прокатки технику с брюшной стороны теперь вверх. (H) Схема бокового зрения двух третьего возраста трахеи hemisegments (один hemisegment будет выделена серым цветом). Кружки боковые группы (LG) и жира (FB) терминала клетки, которые мы используем для количественного определения. Пунктирные линии представляют других отраслей трахеи строй, который мы обычно не количественно. Для полного описания трахеи филиалы в личиночной сегменте, относятся к работе 1.
Рисунок 2. Представитель изображения. (AD) личинок L3 мозаики были получены с использованием MARCM технику (раздел 1) и фиксированными и отображаемого использованием протокола в разделах 2-4. Ветвления одного LG терминал клетки вавизуализировали с мозаикой выражения GFP (); газонаполненное просвете визуализируется с светлого микроскопии (B). (C) Отслеживание ветвления ячейки, в, генерируется с использованием NeuronJ (раздел 5). (D) Отслеживание газонаполненных просвет ячейки B, генерируется с использованием NeuronJ (протокол раздел 5). (E, F) жира (FB) выводом элемента (выделено красным кругом) визуализировали с помощью GFP выражения во всем трахеи системы (Е) и светлого микроскопии (F) в личинку подготовленный протокол в разделах 2-4. (G, H) Пример фиксации артефактов, полученные при нагревании образца в течение слишком длительного периода. GFP диффузный и мелких ветвей деградировали (G). Не Области просвета также больше не появляются заполненные воздухом (стрелка на H). Шкала бар: 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методика фиксации тепла описанный здесь быстрый и удобный инструмент для работы с изображениями дрозофилы личиночной трахеи клетки терминала. Здесь мы используем эту технику, чтобы изучить ветвления и просвет структуру клеток дикого типа. Трахеи клеток, экспрессирующих GFP, движимый трахеи специфический промотор дыхание, могут быть легко визуализированы через личиночной кутикулы после термической фиксации. Конкретные разветвление моделей отдельных клеток терминала, а также тех, заполненные воздухом полости, может быть быстро визуализировали и измеряли с использованием этого метода. Этот метод также может быть выполнена на обеих первой и второй стадии личинок. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при фиксации мелких животных, как флуоресцентные экспрессии белка может быть легко нарушена.
В способе, показанном Здесь мы описываем анализ мозаики животных с GFP выраженные в одной клетки трахеи. Однако те же самые методики применимы и к анализу трахеи клетки под NumbeR экспериментальных манипуляций. Например, животные, у которых экспрессия гена была изменена молекулярные подходы, на протяжении трахеи системе или в отдельных клетках путем экспрессии трансгенов RNAi или модифицированные белки, также могут быть рассмотрены с этим подходом. Негенетические лечения, которые влияют на терминал развития клеток, таких как лекарственные средства или гипоксии, 2,14, также могут быть охарактеризованы с использованием этих методов. В этих последних случаях, необходимо начать с запасом Drosophila конститутивной выражения GFP или другого флуоресцентного белка на протяжении всей своей трахеи системы для визуализации ветвящиеся структуры. Газонаполнительных может быть рассмотрен независимо от флуоресцентных экспрессии белка.
Здесь мы показываем только примеры непомеченная (цитоплазматически локализованных) GFP используется для обозначения системы трахеи. Однако способы, описанные здесь, также пригодны для обнаружения других местных флуоресцентные белки, такие как DsRed, а также флуоресцентные пробелки, которые были модифицированы, чтобы быть локализованы в конкретных субклеточных структур. Например, актин: GFP или тубулина: GFP слияния может быть использован для визуализации трахеи цитоскелета 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Джиллиан Stanfield замечания по рукописи. Таджикистан при поддержке Университета штата Юта генетики Обучение Грант T32-GM007464 от NIGMS NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A.
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
