Summary
ここでは、気管内端末細胞の光学顕微鏡分析のための方法を提案する
Abstract
セル形状は、細胞の機能にとって重要である。しかし、細胞の形態の重要性にもかかわらず、少し特定の形状を生成する方法を個々の細胞について知られている。 ショウジョウバエ気管末端細胞は細胞の形態を生成するために必要な遺伝子の役割を識別し、解明するための強力な遺伝モデルとなっている。端末細胞は、分岐筒ネットワークの構成要素は、内部組織に酸素を供給するように機能することを気管系である。ターミナル細胞は、彼らは二つの異なる携帯電話のアーキテクチャを持っているとして、セル形状の問題を調査するための優れたモデルです。まず、端末細胞は、複雑なニューロンと同様の精巧な分枝状の形態を有し、第二、端末のセル枝は細い管として形成され、膜結合型細胞内腔を含んでいる。端末セル枝番号、分岐組織と個々のブランチ形状の定量分析を、特定の遺伝子メカの役割に関する情報を提供するために使用することができる分枝状細胞の意思でanisms。これらの細胞における管形成の分析は、例えば脊椎動物の脈管構造のような他の管状ネットワークに共通の細管形成の保存メカニズムを明らかにすることができる。ここでは、迅速に、画像を固定するために使用することができる技術を記述し、 ショウジョウバエの幼虫内でも分枝パターンと端子細胞における管形成を分析する。これらの技術は、野生型および変異動物細胞内の端末、または遺伝子モザイクを分析するために使用することができる。このため、プロトコルの高効率化のため、それはまた、遺伝よく、RNAiのベース、またはショウジョウバエ気管系における薬物の画面に適している。
Introduction
セル形状は、組織または器官の一部として、個々の生体内の細胞、ならびに細胞機能の機能にとって重要である。分岐管形成および（lumenogenesis）：我々は、細胞の形態の2つの保存種類の制御に関与する分子機構を調べるためにショウジョウバエ気管末端細胞、昆虫呼吸器システムの構成要素を使用する。端子細胞は、機能が内部組織1に酸素を提供し、標的組織内のローカル2酸素レベルによって制御されるFGFシグナル経路に依存する精巧な分枝状形態を有するようにすること分岐状のチューブネットワークの先端に配置されている。ターミナル細胞の枝には、各ブランチを介して実行してガスを充填した細胞内腔と、細い管である。遺伝子解析がショウジョウバエにおいて実行される際の容易性と共に端末細胞の別個のセルラーアーキテクチャでは、これらの細胞の優れたモデルfを行うまたは、細胞の伸長のメカニズムを調査して分岐し、細胞内の管形成。端末細胞は、分枝状細胞分化、伸長、および成熟2-4に至るシグナル伝達経路のいくつかを理解するのに有用なモデルを証明している。公正このシステムを用いて、細胞形態形成変異体のための順遺伝子スクリーニングは、細胞形状5,6を制御するメカニズムについての洞察を得行われている。インテグリン媒介接着は分岐安定8に必要であること、、例えば、これらの画面には、特定のRabGAPが管腔形成とポジショニング7における細胞骨格の極性と小胞輸送に必要とされることが明らかになっていると、その上皮PAR-極性タンパク質が必要な偏光膜輸送を規制分岐と管腔形成9の両方に。端末細胞における他の研究は、非対称アクチンの蓄積と微小管の組織細胞の伸長およびlumenogenesisに必要であることが示されている ここでは、急速に、端末セル分岐と管腔形成の分析にそのままサード齢ショウジョウバエの幼虫を修正する方法について説明します。このプロトコルはまた、第1及び第2齢動物で行うことができる。この手法の鍵は、遺伝的に直接、そのまま動物の幼虫のクチクラを通じて蛍光タンパク質発現によって標識されているターミナル細胞を可視化する機能です。この手順は、このような抗体染色などの任意の定着後の操作は、細胞を観察する必要がないので、よく遺伝子または薬物スクリーニングを含む、ハイスループット分析に適している。蛍光タンパク質の発現は、細胞質で満たされた分岐の構造を明らかにする。管形成は、並列周囲を埋める流体と対照ガス充填管腔を識別する明視野顕微鏡を使用して監視することができる編組織。 このプロトコルに含まれているそれ以外の場合は未標識動物における蛍光タンパク質で標識されたホモ接合変異体端末細胞を産生するためのMARCMシステム11に基づいて、遺伝的モザイクを生成する方法である。端末細胞は、比較的遅い開発におけるそれらの複雑な構造を詳しく説明するため、これは必要であり、遺伝的モザイクは、以前の開発における他の組織における遺伝子要件のバイパスを可能にする。 。MARCMクローンを生成するには、気管がここで説明息気管固有のドライバ（BTL）12を用いて標識していると、 ショウジョウバエの X染色体のためのプロトコルであり、他の染色体のために、同様の手順である染色体に適した遺伝試薬で、使用することができます検討した。ここでは、気管細胞質局在化GFPの発現によってラベル付けされますが、手順はそのようなDsRedのような他の蛍光タンパク質の発現でも同様に動作します。 さらに、我々はニューロンの分岐パターン13を特徴付けるために開発された方法に基づいて、端末細胞の分岐パターンと管腔形成を定量化する方法が含まれている。定量的なこの種のデータは、目の肥えた正確な分岐またはlumenogenesis過程における遺伝子の役割だけでなく、さまざまな変異体9との間の直接比較を可能に重要なことができます。
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Protocol
1。モザイク生成
- 遺伝的交雑
W FRT 19A浴槽 ：GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4、UAS-GFP（男性）X *を検討する変異を表し* FRT 19A / バル （メス）、。注：これは動物が適切に嵌合することができるように、実験前に少なくとも1日を越える設定します。 - プリ素人：転送クロスメディア上に置かれ、新鮮な酵母ペーストの小さな汚れとフライ食品のバイアルへ。 25℃で1時間置くことを許可
- レイ：新鮮な酵母ペーストの小さな塗抹標本と新鮮なバイアルにプリ置くバイアルから動物を転送します。 25℃で6時間置くことを許可
- その後の実験で貯蔵および使用のために事前に置くバイアルに戻って大人を転送します。すぐにヒートショック循環水浴中で38℃で45分間のために0-6時間古い胚を含む素人のバイアル。注：食品の表面はすべてを検証するために水位より下でなければなりません胚を適切にショックを受けて加熱されています。
- 3齢幼虫がさまよい始めるまで4-5日間25℃でヒートショックバイアルをインキュベートする。
2。モザイク動物用の画面
- 細かい鉗子を使用すると、静かにバイアルの側面から放浪サード齢幼虫を選んで、小さなプラスチック板でチルド100％グリセロールにそれらを配置します。
- 蛍光光学系を搭載した高倍率·解剖顕微鏡を使って幼虫を調べます。蛍光標識された気管の細胞のモザイク表現で幼虫を識別します。通常、これは10〜20倍の倍率で行うことができる。
3。熱固定
- 細かい鉗子を使用して慎重に75x25x1 mmの白いガラスの顕微鏡スライド上に新鮮な100％のグリセロールのドロップディッシュと場所のモザイク動物を選び出す。注：複数の動物を降下（ 図1A）に配置することができる。
動物はまた、カバースリップ上に直接グリセロールの低下に配置することができ動物は非常に迅速に加熱され、オーバー固定になることができるとしてではなく、ケアが、固定（ステップ3.2）中に撮影されなければならない。 - 動物まで、70℃のヒートブロック上に配置したスライドガラスは、単にカバースリップ（ 図1B）のためにスライドし、10秒間、何以上20秒移動しない停止。動物は、最初は身をくねらせますが、停止して、剛性と細長い一度死んだようになります。注：熱過ぎる暴露は、端末の枝やルーメンを損傷するだけでなく、薄暗いと拡散GFPシグナルを作ります。最適な効率のためには、顕微鏡と同じ部屋にヒートブロックを持っていることをお勧めします。
- オリエントは慎重にスライド上のすべての幼虫が互いに（ 図1C）に平行に配向しているような一方向にドロップ全ての幼虫を、細かい鉗子を使用する。
- そっと幼虫の上部（またはスライドガラス上にカバースリップを反転）に18x18mmマイクロカバーガラスを配置し、気泡を形成します（ 図1D）を避ける。注：カバースリップは、正確に嘘をつかないこと幼虫以上フラット、これは問題ではありません。
- 30分以内に撮影幼虫。熱固定端末セルが劣化するとGFP信号が極めて拡散になるであろう。
4。気管ターミナル細胞のin vivoイメージング
- 複合実体顕微鏡のステージ上でスライドを置きます。動物の背側表面（ 図1F）で後部に前方から実行している2つの平行背トランクを見つけ5X対物レンズを用いて。直接2背トランクの間に2つの背側の端子セルを探します。これは、分析のための適切なセグメントを識別するのに役立ちます。
- 一度指向、画像希望の端末細胞に動物を回転させます。これを行うには、慎重にゆっくりとカバースリップ（ 図1Eおよび1G）の下に幼虫を転がり、幼虫の長軸に鉗子垂直な端にカバースリップを押してください。
- 適切な端子セルを選択すると、一貫性のある結果を得るために重要であると変異体間の比較。体脂肪ブランチ（FB）端子細胞が簡単に正中線に横背トランクに隣接発見されています。横グループG端子細胞は（LG）を簡単に発見されたと腹側正中線（ 図1H）のちょうど横に位置しています。注：ほとんどの前方（Tr1部）と後部（Tr10を）セグメントにおける端末セルの配置が他のセグメントから発散です。我々は唯一のセグメントTr2を-Tr9の、端末細胞を分析する。背ターミナル細胞は他の気管の端末細胞よりステレオタイプの分岐パターンを持っている。これは、付加的、非細胞自律的な信号に依存することが、分析に含めるかどうかを決定する際にこれを考慮すべきである。
- その他の端末のセルが識別されたら、所望の倍率を使用してイメージをキャプチャ、典型的には10X又は20X（ 図2A）が最適である。注：変数分岐パターンに起因するが、できるだけ多くの枝と枝のヒントとして含める画像をキャプチャしよう。
- ステージを移動させずに、蛍光のスイッチをオフにし、同じセルと焦点面（ 図2B）の明視野画像をキャプチャするために透過光をオンにします。ルーメンは暗くターミナルセル空間内対照として視覚化されます。末端細胞の枝やルーメンを定量化することを計画している場合は、各端末のセルの複数の焦点面に複数の画像を収集しています。
5。 ImageJのを使用してターミナル細胞形態の分析と定量
- ImageJの（用いた蛍光と明視野画像を開きhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ ）NeuronJプラグイン（ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/を ）。
- "追加トレーシング"ツールを使用して、手動で端末全体の細胞の枝や内腔をトレースします。
- "ラベル·トレーシング"ツールを使用して、名前の変更およびrトレース内の特定の指定を各ラインを割り当てるecolor。
- "パラメータ設定"ツールを使用して、6-10ピクセルから線幅を調整（複合顕微鏡に接続されたデジタルカメラから得られた512×512の画像のために。高いか低い解像度のカメラでは、ピクセル幅が適切にスケーリングする必要があります）、すべてを使用してその他のデフォルト設定、および "OK"を選択します。その後、画像を取るために "スナップショットの作成"ツールを使用します。オリジナルと並べて表示することができるトレースのスナップショットを取得するには、 "トレースを描く"を選択します。
- "測定トレーシング"ツールを選択して、トレースタイプ（ すなわちステップ5.3で割り当てられた固有の名称に基づいて測定するためにどの枝）を選択します。次に、 "RUN"をクリックしますと "クリア以前の測定" "トレースの測定値を表示する"を選択します。これは、名前、ラベルの長さ（ピクセル単位）、およびイメージの他のデータを含むスプレッドシートを生成する。このデータは、さらに、統計のためのMicrosoft Excelスプレッドシートとして保存することができます分析。
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Representative Results
結果を図2に示す。や枝のそれぞれを介して実行してガスを充填した細胞内腔;単一横グループ（LG）ターミナル電池は広範囲細胞内分岐（GFPによって可視化）を示しています（明視野顕微鏡による可視化を、B）。これらの画像は、モザイクL3幼虫から収集セクション1及び2に記載MARCMシステムを用いて生成され、熱が固定され、結像などのセクション3及び4に記載されている。パネルC＆Dは、A＆Bパネルに示されている画像のそれぞれの枝のようにセクション5で説明NeuronJ生成されたトレースと、内腔を示すE＆F幼虫の脂肪体（FB）枝の位置を示しセクション3及び4に記載の撮像のために調製。この例では、動物はモザイクではなく、GFPが全体気管システム全体で表現されることに注意してください。パネルG、Hはあまりにも長い時間のために固定熱だったGFP標識末端細胞の一例を示している。 GFPは、びまん性である（G）、BRANCHEsが壊れており、内腔の部分は、もはやガスが満たされていない、ので、明視野像で休憩として現れる。
図1。端末細胞の幼虫の準備と識別。スライドガラスに100％グリセロールの降下（A）を配置幼虫。（B）複数の幼虫を熱定着のために配置することができるが、（C）熱固定後、互いに平行に幼虫を整理すると垂直スライドの長軸に。幼虫以上（D）場所のカバーガラスは（E）を慎重に動物をロールピンセットでカバーガラスを押して、幼虫向きを変更します（F）GFPと野生型3齢幼虫は全体で表現気管システム。ペアの背トランク（DT）が目の上に表示され電子背側。今上向きに腹側とローリング技術の後に（G）と同じ幼虫。（H）2サード齢気管hemisegments（1 hemisegmentは灰色で強調表示されている）の側面図の図。円は横方向グループ（LG）と体脂肪（FB）我々は定量に使用ターミナル細胞を示す。点線は、我々が日常的に定量化しません気管システムの他の支店を表しています。幼虫セグメントにおける気管枝の詳細については、文献1を参照してください。
図2。代表的な画像（AD）モザイクL3幼虫は、セクション2-4のプロトコルを使用してMARCM法（セクション1）を用いて生成され、固定されており、撮像した。シングルLG端末セルWaの分岐パターンsがGFPのモザイク式（）により可視化し、ガスを充填した管腔は明視野顕微鏡（B）で可視化。 （C）NeuronJを（セクション5）を使用して生成のセル、の分岐パターンのトレース。 （D）NeuronJを（プロトコル部5）を使用して生成されたBのセルのガス封入ルーメン、のトレース。 （E、F）体脂肪（FB）端子セルが（赤い円で強調）セクション2-4のプロトコルにより調製し幼虫における気管系（E）と明視野顕微鏡（F）全体GFP発現によって可視化した。試料は長すぎる時間加熱したときの定着アーチファクトの（G、H）実施例。 GFPは、拡散され、小さな枝は（G）劣化しています。また、内腔の面積は、もはや（Hの矢印）空気で満たされた表示されません。スケールバー：100μmである。
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Discussion
ここで説明した熱定着方式は、撮像ショウジョウバエの幼虫の気管末端細胞の迅速かつ便利なツールである。ここでは、野生型細胞の分岐とルーメンパターンを調べるためにこのテクニックを使用しています。 息気管特異的プロモーターによって駆動GFPを発現する気管細胞は熱固定後の幼虫のクチクラを通じて簡単に可視化することができる。特定の分岐個別端末のセルのパターンと同様に、空気で満たされた管腔のものは、迅速に可視化し、この方法を用いて測定することができる。この技術はまた、第1及び第2齢幼虫を行うことができる。蛍光タンパク質の発現が容易に破壊することができるようにしかし、注意が、小さい動物を固定で撮影しなければならない。
ここに示した方法では、単一の気管細胞で発現GFPをモザイク動物の分析が記載されている。ただし、同じ技術がnumbe下気管細胞の分析に適用可能である実験操作のR。例えば、遺伝子発現をRNAiの導入遺伝子又は修飾されたタンパク質の発現によって分子のアプローチによって、気管システム全体または個々の細胞における改変された動物は、また、この方法で検査することができる。このような薬物または低酸素2,14などの端末細胞の発達に影響を与える非遺伝子治療は、これらの方法を用いて特徴付けることができる。これらの後者のケースでは、分岐パターンを可視化するために、 ショウジョウバエの在庫恒常的に発現するGFPまたはその気管システム全体の他の蛍光タンパク質で開始する必要がある。ガス充填は関係なく、蛍光タンパク質の発現を調べることができる。
ここで、我々は唯一の気管システムにラベルを付けるために使用されているタグの付いていない（細胞質局在化）GFPの例を示しています。しかし、ここで記載される方法はまた、DsRedのような他の天然の蛍光タンパク質、ならびに蛍光プロの検出に適している特定の細胞内構造に局在することに変更されましたteins。例えば、アクチン：GFPまたはチューブリン：GFP融合体は細胞骨格気管10を可視化するために使用することができる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、原稿上のコメントにジリアンスタンフィールドに感謝します。 TAJはNIHのNIGMSからユタ遺伝トレーニンググラントT32-GM007464大学によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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