Artigo de método

Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

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DOI:

10.3791/50561

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6 de janeiro de 2014

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

Avaliada em hospedeiros de imunocompetente sintônico, a vacina de células dendríticas baseadas em células dendríticas baseadas em câncer (CSC) demonstrou imunidade antitumoral significativamente maior do que as vacinas tradicionais de DC pulsadas com células tumorais a granel heterogêneas.

Resumo

Identificamos populações de células-tronco cancerígenas (CSC) enriquecidas de melanoma murino D5 síngênico a C57BL/6 camundongos escamosos SCC7 scc7 scc7 sgênicas para camundongos C3H usando ALDEFLUOR/ALDH como marcador, e testamos sua imunogenicidade usando o lisato celular como fonte de antígenos para pulsar células dendríticas (DCs). Os DCs pulsados com lises de CSCelevados aldh induziam imunidade antitumor protetora significativamente maior do que os DCs pulsados com os lises de células tumorais inteiras não variadas em ambos os modelos e em um ajuste de metástase pulmonar e um s.c. ajuste de crescimento do tumor, respectivamente. Este fenômeno deveu-se às respostas humorais induzidas pela vacina CSC, bem como às respostas anti-CSC celulares. Em particular, esplenócitos isolados do hospedeiro submetido à vacina CSC-DC produziram uma quantidade significativamente maior de IFNγ e GM-CSF do que esplenócitos isolados do hospedeiro submetidos à vacina de linsatrato pulsado de células tumorais não sortidas. Esses resultados apoiam os esforços para desenvolver uma vacina terapêutica baseada em CSC autóloga para uso clínico em um ambiente adjuvante.

Introdução

As células-tronco cancerígenas são relativamente resistentes à quimioterapia convencional e radioterapia1,2. Por outro lado, essa população de células pode ser as células responsáveis pela recaída e progressão dos cânceres após as terapias tradicionais de câncer1-4. Devido à falta de expressão de antígenos tumorais diferenciados em células-tronco cancerosas, as células-tronco cancerígenas podem escapar das intervenções imunológicas atuais da terapia para o câncer, que são principalmente projetadas para atingir os antígenos nas células tumorais diferenciadas. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias especificamente voltadas e destruindo as células-tronco cancerígenas pode manter promessas de aumentar a eficácia terapêutica do tratamento atual do câncer. Para isso, isolamos populações de células-tronco cancerígenas (CSC) enriquecidas a partir de dois tumores animais (melanoma D5 e câncer de células escamosas SCC7), e as usamos como fonte de antígeno para pulsar células presentes de antígenos (células dendríticas, DC) para preparar a vacina CSC-TPDC. Em seguida, avaliamos a imunidade antitumor induzida pela vacina CSC-TPDC nos hospedeiros de imunocompetente sintérico, camundongos B6 e camundongos C3H, respectivamente. A eficácia do antitumor induzido pelo CSC-TPDC foi comparada com a vacina tradicional dc pulsada com lise de células tumorais heterogêneas não sortidas (H-TPDC), que já foi usada pelo nosso grupo5,6, bem como por outros pesquisadores7 tanto em estudos pré-clínicos quanto em ensaios clínicos.

Protocolo

1. Coloração ALDEFLUOR

  1. Preparação de amostras celulares: Preparar suspensão celular única de células tumorais, seja de células tumorais cultivadas ou de amostras de tumores recém-colhidas. Conte as células e ajuste a suspensão celular a uma concentração de 1 x 106 células/ml no tampão de ensaio ALDEFLUOR.
  2. Rotular quatro tubos de teste de poliestireno de 12 mm x 75 mm como tubos de controle da seguinte forma: #1: Não manchado, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR mais DEAB, e #4: 7AAD.
  3. Para estes tubos de controle, coloque a suspensão celular de 1ml em #1 e #4, mas 2 ml em tubos #2. Adicione 5 μl DEAB (inibidor de ALDH) no tubo #3 e mantenha no gelo. Em seguida, adicione 10 μl ativado substrato ALDEFLUOR ao tubo #2, misture e transfira imediatamente 1 ml da mistura para #3 do tubo.
  4. Ao mesmo tempo, adicione 2 μl ativado substrato ALDEFLUOR por milhão de células ao resto das células (tubos de amostra) também em 1 x 106 células/ml no Tampão de Ensaio ALDEFLUOR.
  5. Incubar tanto os 4 tubos de controle quanto os tubos de amostra por 30 minutos em banho-maria de 37 °C.
  6. Após a incubação, adicione 5 μl 7AAD no tubo de controle #4 e 1 μl 7AAD 1 x 106 células ao tubo de amostra. Incubar 10 min a 4 °C.
  7. Centrifugar todos os tubos por 5 min a 250 x g e remover supernaspe.
  8. Células resuspend em ALDEFLUOR Assay Buffer.
  9. Realize a classificação baseada em citometria de fluxo.
  10. Defina os portões de triagem usando células manchadas de ALDEFLUOR tratadas com DEAB como controle negativo e as células manchadas de propidium (PI) 7AAD para controle de viabilidade. Com base nesses controles, foi estabelecido um portão para distinguir as células ALDEFLUOR+/ALDHalta,D5 e SCC7. Esses portões serão então usados para classificar todas as células amostrais preparadas acima para as células ALDEFLUOR+/ALDHhigh D5 e SCC7.

2. Preparação da vacina célula dendrítica de células-tronco-tronco do câncer (CSC-TPDC)

  1. Eutanize camundongos (síngênicos B6 e C3H, respectivamente) usando CO2 e isolam ossos de fêmur e tíbia.
  2. Coloque os ossos em 75% de etanol por 1 min a temperatura ambiente. Em seguida, lave os ossos usando HBSS.
  3. Corte a cabeça dos ossos e use uma agulha de 21 G e uma seringa de 10 ml para empurrar as células em um prato.
  4. Aspire e assopre as células usando a seringa para fazer a suspensão de célula única.
  5. Após centrifugação em 1.500 rpm por 5 min, descarte o supernasce. Em seguida, adicione 5 ml de tampão de lise RBC à lise do RBC por 1 min em banho de água de 37 °C.
  6. Conte o número da célula e ajuste a suspensão celular para uma concentração de 1 milhão de células/ml em meio completo (CM) contendo 10 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.
  7. Cultume as células e compense CM mais IL-4 e GM-CSF 3 dias depois.
  8. No5º dia, colhe as células dendríticas imaturas (DCs) e prepare o meio de isolamento DC contendo 4,2 ml de solução C mais 1 ml de gradiente de densidade OptiPrep.
  9. Suspenda as pelotas de célula em 5 ml CM. Adicione a suspensão da célula ao meio de isolamento lentamente. Centrífuga a 2.000 rpm à temperatura ambiente.
  10. Colete os DCs entre o CM e o meio de isolamento. Conte o número celular e ajuste a suspensão celular para uma concentração de 1 milhão de células/ml em meio de cultura contendo 10 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.
  11. Prepare as células de tumores suspendendo as células D5 ou SCC7altas ou não sortidas de ALDH em meio de cultura e sujeitas a rápidas exposições de congelamento quatro vezes seguidas de giro em ∼100 x g por 5 min para coletar a porção de membrana dos lises.
  12. Para preparar csc-tpdc, pulso DCs com o lysate de célulasaltas ALDH autólogas. Para preparar h-TPDC, pulso DCs com linsato heterogêneo de células tumorais não variadas. A razão entre DC e células tumorais é a mesma.

3. Vacinação e Avaliação da Eficácia

  1. Vacinar camundongos B6 normais, respectivamente, com 2.500 células tumorais D5 CSC-TPDC ou D5 H-TPDC subcutânea(s.c). Vacinar animais C3H normais.c. com 5.000 células tumorais CSC-TPDC ou SCC7 H-TPDC, respectivamente.
  2. Após a vacinação, desafie os camundongos B6 com as células tumorais heterogêneas D5 i.v. Eutanize os camundongos usando CO2 20 dias depois. Colher os pulmões e enumerar metástases pulmonares.
  3. No modelo SCC7, desafie os camundongos C3H com células tumorais SCC7 não sortidas.c do lado oposto da vacina DC. Monitore o tamanho do tumor.
  4. No final dos experimentos eutanize os camundongos B6 e C3H usando CO2. No dia 34 após a primeira vacina, eutanize camundongos com CO2, e ao mesmo tempo colete os baços de cada grupo com um procedimento asséptico.
  5. Ative o baço células T e/ou B com anti-CD3 imobilizado mais anti-CD28 mAbs em CM contendo hrIL-2 ou LPS mais mAb anti-CD40 (FGK45).
  6. Após a ativação, colete supernacantes e use para ensaio ELISA.
  7. Para ensaio ELISA, cubra placas com anticorpos para IFNγ, GM-CSF e IgG a 4 °C O/N.
  8. Após a aplicação do buffer de bloqueio, adicione amostras e padrões e incubar à temperatura ambiente.
  9. Lave a placa e adicione anticorpo de detecção HRP e substrato TMB para incubação.
  10. Meça a absorvância em um leitor de placa ELISA em 450 nm dentro de 30 minutos após parar a reação.

Resultados

ALDEFLUOR/ALDH tem sido usado como um único marcador para isolar células-tronco em múltiplas malignidades8-11. Identificamos populações cancerígenas enriquecidas com células-tronco em dois modelos tumorais D5 e SCC7 usando ALDEFLUOR como marcador. Detectamos células ALDEFLUOR+ no melanoma murino B16-D5 e câncer de células escângenas SCC7. Verificou-se que as células ALDEFLUOR+ contribuem com aproximadamente 0,5% e 5,2% nas linhas de células tumorais cultivadas D5 e SCC7, respectivamente (Figura 1). Células tumorais recém-colhidas de tumores estabelecidos foram analisadas para confirmar a existência de células ALDEFLUOR+. Como também mostrado na Figura 1,houve 2,5% e 4,2% das células ALDEFLUOR+ dos tumores In vivo estabelecidos D5 e SCC7, respectivamente. A tumorigenicidade e a capacidade de autoconexão dessaspopulações classificadas D5 e SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH foram avaliadas no hospedeiro de imunocompetente síngênico, os camundongos C57BL/6 e C3H,respectivamente 8.

Utilizamos células tumorais heterogêneas para pulsar DCs (H-TPDC) tanto em estudos em animais quanto em ensaios clínicos5,6. Para examinar a imunogenicidade dos CSCs, isolamos o CSCalto da ALDH e pulsamos DC com o lisato dos CSCs para gerar CSC-TPDC(Figura 2) e usamos o H-TPDC como um controle convencional de vacina contra o câncer para testar se o CSC-TPDC tem algum efeito benéfico na prevenção do crescimento tumoral.

Avaliamos a imunogenicidade dos CSCs examinando a imunidade antitumoral protetora induzida pelo CSC-TPDC. No modelo D5, foram vacinados camundongos imunocompetntes ingênuos.c com CSC-TPDC ou H-TPDC (na mesma razão: razão DC). Os grupos de controle receberam soro fisiológico (PBS). Uma semana após a última vacina, os camundongos foram desafiados com células tumorais D5 não variadas por via intravenosa(i.v.),e os pulmões foram colhidos 3 semanas depois para enumerar metástases pulmonares. Como mostrado na Tabela 1, em comparação com o grupo PBS, os camundongos tratados com o H-TPDC desenvolveram menos metástases pulmonares. É importante ressaltar que os camundongos tratados com CSC-TPDC apresentaram significativamente menos metástases pulmonares do que o grupo de vacinas H-TPDC em ambos os experimentos realizados. No modelo SCC7, foram vacinados animais C3H normais.c com SCC7 CSC-TPDC ou H-TPDC, respectivamente, no flanco direito, seguidos por desafiadores com células tumorais SCC7 não sortidas.c no flanco esquerdo. Comparado com o grupo PBS, h-TPDC induziu imunidade anti-tumor modesta contra o crescimento do tumor. No entanto, houve inibição significativa do crescimento tumoral em camundongos que foram tratados com CSC-TPDC quando comparados tanto com o grupo controle quanto com o grupo H-TPDC (p<0,05, Figura 3). Esses resultados indicam que os CSCs poderiam ser usados como uma fonte de antígeno mais eficaz para carregar DCs do que as células tumorais tradicionais induzindo imunidade protetora contra o desafio das células tumorais.

Para entender melhor os mecanismos subjacentes à imunidade antitumor protetora induzida pelo CSC, colhemos os baços dos animais submetidos à vacinação de DC no final dos experimentos. As células do baço foram então ativadas por anti-CD3/CD28/IL-2 ou anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Em seguida, os supernacantes culturais foram coletados para detectar a expressão de citocinas e anticorpos.  Houve produções significativamente maiores de IFNγ e GM-CSF pelas células do baço dos animais vacinados com D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC (Figura 4). Além disso, houve uma produção significativa (p<0,05) maior de IgG por células de baço ativadas LPS/anti-CD40 coletadas dos animais vacinados com D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC em comparação com D5 H-TPDC ou SCC7 H-TPDC. Esses anticorpos foram encontrados para se ligarem aos CSCs D5 e SCC7, respectivamente, e tal vinculação poderia resultar na lise CSC na presença do complemento8.

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Figura 1. Asaltas populações de ALDHFLUOR+/ALDH foram detectadas em tumores de células escângenas murinas recém-colhidas e tumores escânceres SCC7. As células tumorais tratadas com 50 mmol/L DEAB, inibidor específico da ALDH, foram utilizadas como controle negativo. Clique aqui para ver imagem maior. 

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Figura 2. Geração de vacinas contra células-tronco baseadas em células dendríticas. Para a preparação de CSC-TPDC e H-TPDC, as células dendríticas derivadas da medula óssea foram pulsadas com células tumoraisaltas ou não sortidas de ALDH, respectivamente. Clique aqui para ver imagem maior. 

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Figura 3. A vacina dc pulsada com csc (CSC-TPDC) poderia induzir imunidade de antitumor protetor protetor mais eficaz na .c. Modelo de tumor SCC7. Clique aqui para ver imagem maior. 

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Figura 4. Respostas celulares sistêmicas mais potentes no hospedeiro imunocompetente vacinados com CSC-TPDC.  Os esplenócitos foram colhidos dos animais submetidos à vacinação H-TPDC ou CSC-TPDC, e foram ativados conforme indicado. Os supernacantes culturais foram então coletados para detecção de citocinas usando ELISA. Clique aqui para ver imagem maior. 

Discussão

Os hospedeiros imunocomprometidos, como os camundongos SCID, impedem avaliações imunológicas de CSCs devido à falta de imunidade adaptativa dentro dos hospedeiros. Neste estudo, avaliamos a imunogenicidade dos CSCs em hospedeiros imunocompetntes, o que poderia imitar mais de perto as configurações dos pacientes. Os CSCs enriquecidos são imunogênicos e podem induzir imunidade protetora de tumores mais eficaz quando seus lisosatos são carregados para DCs como uma vacina em comparação com DCs com pulso de células tumorais não eleitos.  Mecanicamente, a proteção foi conferida por indução seletiva de anticorpos CSC-reativos e células T8, bem como a produção de citocina tipo 1, por exemplo, IFNγ e GM-CSF.

A maioria das imunoterapias atuais, incluindo vacinas baseadas em células dendríticas e a transferência de células T adotivas, são projetadas para atingir antígenos diferenciados por tumores. CSCs, que podem não expressar esses antígenos diferenciados, podem, portanto, escapar desses alvos imunológicos. Em contraste, a vacina CSC projetada para atingir especificamente células-tronco cancerígenas pode destruir essa população especial das células cancerosas e, assim, melhorar a eficácia terapêutica da vacina prevenindo a recaída tumoral e a metástase.

Em ambas as células tumorais cultivadas e tumores recém-colhidos, identificamos a população enriquecida com CSC por citometria de fluxo baseada na atividade desidrogenase de alto aldeído. Tais célulasaltas de ALDH poderiam ser isoladas pela triagem de fluxo para serem usadas como fonte de antígeno para pulsar DC para gerar CSC-TPDCs. A comparação com célulasaltas aldh isoladas de células tumorais cultivadas versus de tumores recém-colhidos não demonstrou diferença significativa em termos de indução da imunidade anti-CSC8. Esses resultados revelaram o potencial de uso de CSCs isolados de células tumorais cultivadas ou de tumores recém-colhidos para aplicação clínica.

Para ser clinicamente relevante, a vacina precisa ser examinada em um ambiente terapêutico. Esses experimentos estão sendo realizados em nosso laboratório.

Divulgações

A STEMCELL Technologies tem suportado as taxas de publicação do Open Access.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Will e Jeanne Caldwell Doowed Research Fund do Centro de Câncer Integral da Universidade de Michigan e, em parte, pela nih grant CA82529 e pela Gillson Longenbaugh Foundation.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ALDHEFLOUR KITStemcell Technologies1700
Murine IL-4Pepro Tech214-14
Murine GM-CSFPepro Tech315-03
Mouse GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Gradiente de Densidade MédioSigma AldrichD1556
BD OptEIA TMB Reagente Substrato Conjuntode
Biosciences BD FACS Aria Cell SorterBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058
Equipamento 555214 BD

Referências

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