Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

Summary

Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Abstract

Em 2001, pesquisadores da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, descreveu o isolamento de uma nova população de células-tronco adultas do tecido adiposo lipoaspirada que inicialmente denominado Células lipoaspirado ou células processados ​​PLA. Desde então, essas células-tronco foram renomeados como células-tronco adiposo-derivadas ou ASC e passaram a se tornar um dos mais populares populações de células-tronco adultas nos campos da investigação em células estaminais e medicina regenerativa. Milhares de artigos agora descrever o uso de ASC em uma variedade de modelos animais regenerativos, incluindo a regeneração óssea, reparação de nervos periféricos e engenharia cardiovascular. Artigos recentes começaram a descrever a miríade de usos para ASC na clínica. O protocolo mostrado neste artigo descreve o procedimento básico para manualmente e enzimaticamente isolando ASC de grandes quantidades de lipoaspirates obtidos a partir de procedimentos cosméticos. Este protocolo pode ser facilmente escalado para cima ou para baixo para accommodcomeu o volume de lipoaspirado e pode ser adaptado para isolar as ASC de tecido adiposo obtidas por abdominoplasties e outros processos semelhantes.

Introduction

Em 2001, uma população putativo de células-tronco multipotentes do tecido adiposo foi descrito na revista Engenharia de Tecidos ^1. Estas células receberam o nome Processado lipoaspirado ou PLA células devido à sua derivação de tecido lipoaspirado processado obtidos através de cirurgia estética. O método de isolamento descritas neste artigo foi baseado em estratégias enzimáticas existentes para o isolamento da fracção do estroma vascular (SVF) a partir de tecido adiposo ^2. O SVF tem sido definida como uma população minimamente processados ​​de glóbulos vermelhos, fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos e pré-adipóci....

Protocol

O protocolo mostrado aqui descreve o isolamento Manual de ASC de lipoaspirates obtidos através de procedimentos cosméticos utilizando digestão enzimática e centrifugação diferencial. Este protocolo foi publicado na revista Engenharia de Tecidos, em 2001, ^1, em que as células resultantes foram chamados células lipoaspirado ou células processados ​​PLA por causa de seu isolamento a partir de lipoaspirates. No entanto, o termo célula PLA foi agora substituído pelo termo células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC para dar ao campo algum tipo de conformidade em termos de nomenclatura. As células isoladas por este protocolo foi mostrado p....

Results

O esboço protocolo acima descreve um método manual, enzimática para o isolamento de um SVF a partir de um grande volume de amostra lipoaspirado. Dentro deste SVF são populações de células numerosas, incluindo o ASC. Numerosos estudos propõem que este SVF cultura sob condições de cultura de tecidos padrão irá seleccionar uma população de fibroblastos aderentes susceptíveis de ser composto principalmente do tipo ASC. Consistente com isto, temos mostrado, utilizando citometria de fluxo e de imunofluorescência, que os aglom.......

Discussion

O tecido adiposo para o isolamento de ASC pode vir de várias formas: desde peças sólidas de tecido obtidos por meio de ressecção ou lipoaspiração em pedaços menores obtidos, quer através de extração de seringa ou lipoaspiração assistida por sucção (ou seja, a lipoaspiração). Se mais células SVF (ASC) e, assim, pode ser obtido a partir de amostras de tecido adiposo ressecados ou aspirados está claro como estudos conflitantes foram apresentadas ^{16, 17.} É possível que um ou outro tipo de tecido adiposo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’ s Modificação de Eagle’ s Médio)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	com 4,5 g/ml de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio
Penicilina/Estreptomicina	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10.000 UI/ml penicilina/10.000 μ g/ml de estreptomicina
Anfotericina B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μ g/ml de anfotericina B
10X PBS (solução salina tamponada fosfo)	Mediatech Cellgro	25-053-CI	sem cálcio, sem magnésio
Tripsina/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0,25% tripsina/2,21mM EDTA
Colagenase tipo IA (de Clostridium histolyticum)	Sigma	C2674	preparação bruta; < 125 unidades de digestão de colágeno/mg sólido
FBS (Soro Fetal Bovino) inativado pelo calor	Gemini Bioproducts	100106	fonte USDA,
pipetas sorológicas de 10 ml inativadas	Genesee Scientific	12-104
Pipetas sorológicas de 25 ml	Genesee Scientific	12-106
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml	Genesee Scientific	21-106
Placas de cultura de tecidos de 100 mm	Genesee Scientific	25-202
Placas de cultura de tecidos de 150 mm	Genesee Scientific	25-203
Unidades de filtro Stericup de 500 ml	Membrana Millipore	SCGPU05RE	PES, 0,22 μ filtros de células m pore
	FisherBrand	22-363-549	100 μ m malha de nylon
dexametasona - solúvel	em água Sigma	D-2915
L-ácido ascórbico 2 fosfato	Sigma	A-8960
β-glicerofosfato sal dissódico	Sigma	G-9422	também conhecido como glicerofosfato
insulina	Sigma	I-6634	feito de indometacina de pâncreas bovino
	Sigma	I-7378
apo-transferrina	Sigma	T-4382
TGFβ 1	R& D Systems	240-B-002	humano recombinante
Red O	Sigma	O-0625
Alcian Blue	Sigma	A-5268
nitrato de prata	Sigma	S-0319
ácido clorídrico	Fisher Scientific	A144
Paraformaldeído	Fisher Scientific	30525-89-4	fornecido como estoque
[cabeçalho]
Equipamento necessário
Classe II A/B Capuz de biossegurança	Thermo Scientific		garante que o capuz tenha linhas de vácuo para aspiração
Centrífuga de bancada	Hermle Labnet	Z383	Rotor basculante para tubos de 50 ml necessário, capaz de 1200xg Banho-maria
	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	capacidade de 5-10L, capaz de 37C
Auxiliares de pipeta automatizados	Drummond Pipeta Aid XL	4-000-105
CO2 Incubadora	Thermo Scientific	Forma 310	com camisa direta de calor ou água