Summary
ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.
Abstract
ב2001, חוקרים באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, תאר את בידודה של אוכלוסייה חדשה של תאי גזע בוגרים מרקמת שומן liposuctioned שהם בתחילה כינו את תאי Lipoaspirate מעובד או תאי PLA. מאז, תאי גזע אלה כבר לשנות את שמם כתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs והלכו על מנת להפוך לאחת מאוכלוסיות תאי גזע בוגרים הפופולריות ביותר בתחומי מחקר בתאי גזע ורפואה רגנרטיבית. אלפי מאמרי החברה מתארים את השימוש של ASCs במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים משובי, כוללים התחדשות עצם, תיקון עצב היקפי והנדסת לב וכלי דם. מאמרים אחרונים החלו לתאר את מספר עצום של שימושים לASCs במרפאת. הפרוטוקול שמוצג במאמר זה מתאר את ההליך הבסיסי לידני ואנזימי בידוד ASCs מכמויות גדולות של lipoaspirates מתקבל מהליכים קוסמטיים. פרוטוקול זה בקלות וניתן לשנותם למעלה או למטה כדי accommodאכלתי את עוצמת הקול של lipoaspirate ויכול להיות מותאם לבודד ASCs מרקמת שומן שהושג באמצעות abdominoplasties ונהלים דומים אחרים.
Introduction
ב2001, אוכלוסייה משוערת של תאי גזע multipotent מרקמת שומן שתוארה בכתב עת הנדסת רקמות 1. תאים אלה ניתנו תאים שם מעובד Lipoaspirate או PLA בשל גזירתם מרקמות lipoaspirate מעובד שהושגו באמצעות ניתוח קוסמטי. שיטת הבידוד המתוארת במאמר זה הייתה מבוסס על אסטרטגיות האנזימטית קיימות לבידוד של החלק של כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן 2. SVF הוגדר כאוכלוסיית עיבוד מינימאלי של תאי דם אדום, fibroblasts, בתאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes מראש adipocytes שעדיין לדבוק במצע רקמת תרבות 2, 3. Culturing של SVF זה לאורך הזמן מוצע לחסל הרבה של אוכלוסיות תאים מזהמים אלה ולגרום לאוכלוסייה חסיד, fibroblastic. fibroblasts אלה זוהה בספרות ל40 השנים האחרונות כמי שמראשadipocytes. עם זאת, קבוצת המחקר שלנו הוכיחה כי תאים אלה ברשות multipotency mesodermal ועל שמם אוכלוסיית SVF חסיד כתאי PLA. מחקרים מאוחרים יותר על ידי קבוצות מחקר רבות אחרות שהוספתם לפוטנציאל זה, המצביעים על שני endodermal ופוטנציאלי ectodermal (לסקירה ראתה 4). מאז אותה תקופה, תנאים נוספים רבים לתאים אלה הופיעו בספרות. על מנת לספק איזה סוג של קונסנסוס, המונח בתאי גזע שמקורם בשומן או ASCs אומצה בnd כנס IFATS השנתי 2. ככזה, ASC המונח ישמש במאמר זה.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא הליך פשוט יחסית שדורש ציוד מעבדה סטנדרטי ומשתמש בחומרים כימיים פשוטים כגון שנאגרו מלוח phospho ריאגנטים מדיה תרבות תקן הרקמות וcollagenase. זה יכול לייצר מספר גדול של ASCs בהתאם לכמות של החל שומן לרקמות נפח וג הבאזמן ulture. עם זאת, העיבוד של כמות כה גדולה של רקמת שומן יכול להציג כמה בעיות פיזיות שניתן למתן במידת שימוש בפרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול זה דורש מתקני סטרילי רקמת תרבות וברדסי בטיחות ביולוגיים שאושרו, ובכך מחייב את השימוש במתקן בתרבית רקמה שאושר. דרישה זו יכולה גם להקטין את התועלת של אוכלוסיית ASC ביישומים קליניים, אלא אם כן הם מבודדים בייצור נאות מתקנים מאושרים (GMP) מיועדים לבידוד וההרחבה של חומרים לשימוש קליני. כחלופה, מערכות אוטומטיות שיכול לבודד ASCs במערכת סגורה בחדר הניתוח היינו למנוע בעיה מפתח זה ולאפשר לשימוש המיידי של ASCs ללא כל צורך בהרחבה לאחר מכן במבחנה. נכון להיום, יש שש מערכות אוטומטיות כי הם זמינים מסחריים עבור הבידוד של תאים מהרקמה אנושית. מערכות אלו יכולות לעשות את זה אפשרי לבודדמספר משמעותי של ASCs מכמויות גדולות של רקמת שומן בעקבות הקציר שלה באופן מיידי. ASCs אלה אז יכול להיות מחדש למטופל עבור מגוון רחב של מטרות משובי ללא המטופל שתצטרכנה לעזוב את חדר הניתוח. בנוסף לפרוטוקול זה מתאר את הבידוד הידני של ASCs, פרוטוקול לבידוד אוטומטי של ASCs באמצעות מערכת Celution ניתן גם במאמר נלווה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הבידוד הידני של ASCs מlipoaspirates הושג באמצעות הליכים קוסמטיים באמצעות עיכול אנזימטי וצנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה פורסם לראשונה בכתב עת הנדסת רקמות ב2001 1, שבו התאים וכתוצאה מכך נקראים תאי Lipoaspirate מעובד או תאי PLA בגלל בידודם מlipoaspirates. עם זאת, תא PLA הטווח הוחלף עכשיו עם תאים לטווח נגזר שומן גזע או ASCs לתת תחום כלשהו של קונפורמיות במונחים של מינוח. התאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הוכחו על ידי רבים להחזיק פוטנציאל mesodermal הן במבחנה in vivo (לסקירה ראו 4). בנוסף, פוטנציאל ectodermal וendodermal של ASC יש גם נחקר -4. טכניקת הבידוד היא פשוט וברורה, ודורשת כשעה כדי להשלים. תא וכתוצאה מכךשלהם בתרבית בתנאי תרבית רקמה רגילות. עם זמן תרבות, אוכלוסיית ASC הופכת להיות יותר הומוגנית, מורכב מתאי fibroblastic שלהתרחב בקלות ולהציג את יכולת קיום טוב יותר בטווח הארוך בתרבות.
הערה: החתיכות של ציוד הנדרשים הבאות מופיעות בסוף המאמר זה. יש לעקר כל כלי הזכוכית, כלי התקשורת והחומרים כימיים דרך מעוקר או מסוננת דרך 0.22 מיקרומטר מסננים. צריכה להיות אחרי טכניקות תרבית רקמה אספטיים בכל העת. כדי להבטיח זאת, כל החומרים להציב את ארון הבטיחות הביולוגי צריכים להיות מעוקרים על ידי ריסוס עם תמיסת אתנול 70% ומנגבים במגבות נייר נקיות.
1. לפני הקציר, הכן בעקבות:
- תמיסת מלח סטרילית 1X שנאגרו phospho (PBS) לשטיפת lipoaspirates. הכן כ 1 ליטר של 1x PBS לשל lipoaspirate כל 100 מיליליטר. החיטוי PBS וכלow להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. כאופציה, אנטיביוטיקה / antimycotic ניתן להוסיף לריכוז סופי של: 100 IU / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו2.50 מיקרוגרם / amphotericin B מיליליטר פעם אחת PBS התקרר.
- .075-.1% סוג סטרילי collagenase IA (מhistolyticum Clostridium) לעיכול אנזימטי של lipoaspirate. ריכוז יהיה תלוי באיכות והמקור של collagenase - כלומר לעומת גולמי מטוהרת. סוגים אחרים collagenase עשויים לשמש (הסוג למשל collagenase II או IV) בריכוזים דומים. הכן ב1x PBS וסינון סטרילי באמצעות מערכת סינון 1,000 מיליליטר עם מסנן 0.22 מיקרומטר (איור 1 א). עם זאת, עשויים לשמש גם בקבוקי זכוכית סטרילית מצוידים במסנן עליון בקבוק. להכין ולהשתמש בטמפרטורת חדר. פתרונות Collagenase עשויים להיות מאוחסנים לטווח הקצר על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. אין להקפיא פתרון collagenase כפי שהוא עשוי להפחית את פעילותה.
- סטרילי בקרה בינוני (CM) לאיון collagenase וculturing של אוכלוסיית ASC. ל500 מיליליטר של CM, לשלב הבא: 500 מיליליטר DMEM (גלוקוז 4.5 גר '/ ל', עם L-גלוטמין), 50 מיליליטר סרום שור העובר (חום מומת), 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU פניצילין, 10,000 מיליליטר מיקרוגרם / סטרפטומיצין). כאופציה, 5 מיליליטר amphotericin B (250 amphotericin B מיקרוגרם / מיליליטר) יכול להיות גם הוסיף. סינון סטרילי של המדיה הזו נדרש אם חומרים כימיים שאינם סטרילי משמשים. הנח את CM בדקות 37 ° C אמבט המים 30 לפני השימוש כדי לחמם את המדיום.
- כלי זכוכית סטרילית וplasticware לבידוד. החיטוי כוס זכוכית 1,000 מ"ל ולאפשר להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. בנוסף, יש לי plasticware הבא מוכן: טפטפות סרולוגיות בקטריאלית (5 מיליליטר, 10 מיליליטר ו25 מיליליטר), 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, ומנות תרבות שטופלה בתרבית רקמה.
2. בידוד של ASCs מLipoaspirates
רוב lipoaspirates נאספים במכל שאיפה (ראה איור 1) ויכולה להיות מורכב משלוש שכבות נפרדות: 1) שכבה עליונה של נפט בשל תמוגה של adipocytes הבוגרת, 2) שכבה אמצעית של רקמת שומן, ו 3) תחתון, infranatant נוזל המכיל מלח ולזהם סוגי תאים כמו תאי דם אדומים (RBCs). שכבת השמן העליונה לא יכולה להיות נוכחת בכמויות משמעותיות. אם הוא קיים, הוא צריך להישאף כזיהום נפט של תרבות ASC כתוצאה מכך עלול להשפיע על יכולת הקיום של התרבות. Infranatant התחתון צריך להסיר לפני העיבוד כדי למזער את הזיהום של תרבויות ASC עם RBCs. זה ישאיר את האמצע, שכבת רקמת שומן, שלאחר מכן ניתן יהיה לרחוץ ואנזימים מתעכלים לשחרר את החלק שלה סלולארי, סטרומה וסקולרית (SVF).
- כביסה lipoaspirate: פתח את מיכל lipoaspirate בשעתי תרבית הרקמהood ולמזוג בזהירות lipoaspirate לתוך כוס זכוכית 1 ליטר סטרילי. לאפשר לשכבות lipoaspirate להפריד עד ששכבת רקמת השומן מופרדת היטב (איור 1).
- לשאוב את שכבת הנפט (אם קיימים) באמצעות, פיפטה זכוכית סטרילית וinfranatant המלוחים התחתון באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר. פעולה זו תסיר את הרוב הגדול של זיהום תאי דם אדומים ומלוח.
- להעריך את נפח שכבת רקמת שומן וכתוצאה מכך ולהוסיף סטרילי 1x PBS בנפח שווה. מערבבים את לשאוב עם פיפטה משמשת לשאיפה כדי לערבב lipoaspirate עם PBS. לאפשר לשתי השכבות להתיישב. כפי שצוין לעיל, PBS 1x ניתן להשלים עם האנטיביוטיקה / antimycotics.
- לשאוב infranatant באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר.
- תמשיך לשטוף את שבר רקמת השומן כפי שמתואר בצעדים 2.1.2. ו2.1.3. עד ששכבת השומן יש / צבע זהב צהוב. ה לשאובדואר infranatant בפעם אחרונה, והשאיר את החלק יחסי רקמת השומן בכוס הזכוכית. על מנת להבטיח הסרה מספקת של infranatant, לאפשר לשכבות lipoaspirate להתפשר על 5 דקות לאחר השטיפה האחרונה ולפני השאיפה הסופית.
- אנזימתי עיכול של lipoaspirate: הכן פתרון 1A collagenase סטרילי כפי שתואר לעיל ביחידת מסנן. הכן את נפח שווה לזה של חלקיק השומן וסינון סטרילי.
- לאחר סינון של פתרון collagenase, לבטל את יחידת המסנן העליונה, יוצק בזהירות את החלק יחסי שומן נשטף לפתרון collagenase והדוק לסגור את הבקבוק.
- מניחים את תערובת collagenase / שומן באמבט מים C ° 37 ולעכל ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מערבולת בעדינות את תערובת collagenase / שומן בכל דקות 5-10 ואת המקום בחזרה באמבט המים. שכבת רקמת השומן צריכה לקחת על הופעתו "חלקה" (figurדואר 1B) כתמורה לעיכול. זמני עיכול נוספים (כלומר עד 2 שעות) יכולים לשמש אם שכבת רקמת השומן עדיין נראה שיש חתיכות מוצקות של שומן בתוכו.
- בידוד של ASCs: מניח את תערובת collagenase / השומן מתעכל חזרה לתוך ארון הבטיחות הביולוגי. הקפד לחטא את יחידת המסנן עם 70% אתנול לפני הצבת חזרה בארון.
- aliquots 25 מיליליטר פיפטה של infranatant מכיל SVF לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר סטרילי.
- הוסף 25 מיליליטר של CM לצינור אחד. לאפשר CM כדי להשבית collagenase ידי דוגרים בטמפרטורת חדר בקבינט למשך 5 דקות.
- צנטריפוגה 10 דקות ב 1,200 XG כדי לאסוף את SVF כגלולה.
- בארון הבטיחות הביולוגי, לשאוב supernatant מצינור אחד. להבטיח את שכבת שמן העליונה וכל adipocytes צפה להישאף עם supernatant זה (
- מערבבים את כדורי SVF לתוך צינור צנטריפוגות אחד באמצעות 30 CM מיליליטר ולחלק באופן שווה יותר משני צינורות 50 צנטריפוגות מיליליטר חדשים. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.3. ולשאוב supernatants משני כדורי SVF (לא מוצגים באיור).
אופציונלי: אם תמוגה RBC היא רצויה, resuspend כל גלולה SVF ב10 מיליליטר של חיץ RBC תמוגה (160 4 Cl מ"מ NH) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.3. ולשאוב supernatants להניב את כדורי SVF (לא מוצגים באיור).- לשלב את שני כדורי SVF לתוך צינור אחד חדש צנטריפוגות באמצעות CM מיליליטר 5-10 (איור 1).
- כדי לסנן חלקיקי רקמות גדולים יותר, פיפטה גלולה SVF resuspended על מסנן רשת 100 מיקרומטר ממוקם על גבי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש ולאפשר לסינון על ידי זרימת כוח הכבידה.
- aliquots פיפטה של resuspended(ומסונן) גלולה המכילה SVF ASCs על מנות תרבות שטופלו רקמות תרבות. מוסף כל מנה עם נפח מתאים של CM.
- תרבות התאים בסנטימטר ל3-4 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ללא שינוי של מדיה.
- מערבבים את כדורי SVF לתוך צינור צנטריפוגות אחד באמצעות 30 CM מיליליטר ולחלק באופן שווה יותר משני צינורות 50 צנטריפוגות מיליליטר חדשים. צנטריפוגה כמו בשלב 2.3.3. ולשאוב supernatants משני כדורי SVF (לא מוצגים באיור).
בעקבות תקופת התרבות ראשונית זה, התקשורת והתרבות עלולה להישאף וכל תאי דם אדומים לזהם להסיר בעדינות על ידי שטיפה עם 1XPBS סטרילי. החלף עם CM ולהמשיך תרבות ASCs לפי צורך. הסוג של מאכל רקמות התרבות השתמש ואיך גלולה SVF resuspended מתחלקת בין מנות אלה יהיו תלוי במספר התאים הרצויים הבאים תרבית רקמה קונבנציונלית.
3. אפיון של אוכלוסיית ASC: בידול cytometry הזרימה וMultilineage
ברגע מבודד, אפיון של אוכלוסיית ASC צריך להתבצע. גישות מקובלות לכך כוללות זרימה ציטומגלווירוסmetry לאפיין את פרופיל אנטיגן CD פני התא של התאים והתמיינות במבחנה כדי לאשר יכולת בידול multilineage. בעוד ניתן להעריך שושלות מרובות בASCs, פרוטוקול זה מתאר את הבידול של ASCs לתוך תאים של adipogenic, osteogenic ושושלות chondrogenic כאמצעי המאשר פוטנציאלי mesodermal multilineage 5.
בבידול רב שושלת מבחנה של ASCs
- בידול osteogenic של ASCs: לפני הגיוס, להכין osteogenic בינונית (OM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 25.0 מיליליטר של FBS (.5.0% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / ml וריכוזים סופיים 10,000 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה osteogenic הבאות כדי להעניק לריכוזים מצויינים הסופיים: דקסאמתאזון (0.1 מיקרומטר סופי), L-אסקורבית חומצה 2-פוספט (סופי מיקרומטר 50.0) וβ-glycerophosphate (10.0 מ"מ סופי).
- לפני גיוס, קציר וצלחת ASCs התרבותי לתוך צלחת תרבית רקמה הרצויה, כך שconfluency של כ 50% מושגת. לכל מנה ניסיונית מצופה, צלחת מנה נוספת לשליטה אינה מושרה. לילה תרבות בסנטימטר.
הערה: confluency 50% מומלץ על מנת לאפשר להמשך התפשטות שעלולה להתרחש במהלך האינדוקציה - ביום של אינדוקציה, להסיר הבינוני ולהוסיף את הדברים הבאים: OM לבארות הרצויות osteogenic הניסיוניות וCM לבארות שליטה. נפח התקשורת המשמשת יהיה תלוי בגודל של המנה בתרבית הרקמה. ל12 מנות טובות, 1.0 מיליליטר של מדיה לכל גם הוא מספיק. עבור 6 מנות טובות, 2.0 מיליליטר של תקשורת לכל טוב מספיק. ל100 מנות מ"מ, יש להשתמש 10.0 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת.
- תרבות התאים למינימום של 14 ימים עם שינויים של המדיום המתאים כל 3-4בימים. אוכלוסיות ASC מאוד osteogenic עלולות להראות סימנים של בתצהיר מינרלים תאי מוקדם ככל אינדוקציה 7 ימים.
- בידול osteogenic (כלומר בתצהיר מינרלים תאי) ניתן לאשר באמצעות כתם היסטולוגית פון Kossa לסידן זרחה. כתם זה יהיה לייצר משקע שחור חום זיהוי הנוכחות של פוספט תאי סידן (ראה איור 2).
כדי להכתים עם מגיב פון Kossa:- הסר את OM מתאי הניסוי וCM מתאי השליטה
- תקן את התאים ל60 דקות בparaformaldehyde 4.0% ערוכים 1x PBS.
- שטוף תאים פעמיים עם 1X PBS.
- דגירה התאים עם 2.0% כסף חנקה (שהוכנו במים) בחושך במשך 30 דקות.
- הסר את הכסף חנקה, לשטוף פעמיים במים מזוקקים ואוויר יבש התאים.
- לחשוף את התאים לאור UV במשך 60 דקות לפתח calמשקע פוספט cium.
- לשטוף את התאים מספר פעמים עם 1XPBS.
- Counterstain התא עם hematoxylin אם רוצה.
- לפני גיוס, קציר וצלחת ASCs התרבותי לתוך צלחת תרבית רקמה הרצויה, כך שconfluency של כ 50% מושגת. לכל מנה ניסיונית מצופה, צלחת מנה נוספת לשליטה אינה מושרה. לילה תרבות בסנטימטר.
- בידול Adipogenic של ASCs: לפני הגיוס, להכין Adipogenic בינוני (AM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 50.0 מיליליטר של FBS (10.0% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / מיליליטר ו -10,000 בריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה adipogenic הבאים כדי להעניק לריכוזים הסופיים הצביעו: dexamethasone (1.0 מיקרומטר סופי), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX - 0.5 מ"מ סופי), indomethacin (0.2 מ"מ סופי) ואינסולין (10.0 מיקרומטר סופי ).
- לפני גיוס, קציר וצלחת ASCs התרבותי לתוך צלחת תרבית רקמה הרצויה, כך שconfluency של כ 80% מושגת. לכל מנה ניסיונית מצופה, צלחת בנוסףהמנה אל לשליטה שאינה מושרה. . תרבות הלילה בCM הערה: בידול Adipogenic של ASCs מופיע להיות יעיל יותר עם confluency המוגבר.
- ביום של גיוס, להסיר את המדיום ולהוסיף את הדברים הבאים: בבוקר עד הבארות הרצויות osteogenic הניסיוניות וCM לבארות שליטה. נפח התקשורת המשמשת יהיה תלוי בגודל של המנה בתרבית הרקמה. ל12 מנות טובות, 1.0.ml של תקשורת לכל טוב מספיק. עבור 6 מנות טובות, 2.0 מיליליטר של מדיה לכל גם הוא מספיק. ל100 מנות מ"מ, יש להשתמש 10.0 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת.
- תרבות התאים למינימום של 14 ימים עם שינויים של המדיום המתאים כל 3-4 ימים. אוכלוסיות ASC מאוד adipogenic עשויות להציג סימנים של היווצרות vacuole שומנים בדם כבר באינדוקציה 7 ימים.
- ASCs עובר התמיינות adipogenic יפתח וקואולות שומנים רבות שעשויים להיות דמיינו בקלות תחת מיקרוסקופ האור. בנוסף, רשאי בידול adipogenicלהיות מאושר באמצעות כתם היסטולוגית שמן האדום O שיצטבר בתוך וקואולות אלה (ראו איור 2).
כדי להכתים עם שמן אדום או:- הסר את המדיה מתאי הניסוי וביקורת ולתקן אותם בשביל 60 דקות באמצעות 10% מקבע סידן רשמי. כדי להכין את מקבע את זה, לשלב הבא: מים 1.0 גרם של CaCl 2, 25.0 paraformaldehyde מיליליטר 16% (4.0% סופיים) ו75.0 מיליליטר מזוקק.
- לשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS.
- לשטוף את התאים לזמן קצר עם 70% אתנול.
- דגירה התאים בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בתמיסת נפט אדום O. כדי להכין את פתרון שמן האדום O, לפזר אבקת 2.0 גרם שמן האדום O ב50.0 אתנול מיליליטר 70% ו50.0 מיליליטר אצטון.
- לשטוף את התאים עם 70% אתנול ולאחר מכן במים ברז.
- דמיינו את התאים בקרוב לאחר הצביעה עקב דהייה של הכתמים עם זמן.
- בידול Chondrogenic של ASCs: בידול Chondrogenic מושגת באמצעות טכניקה לתרבות בצפיפות גבוהה המכונה "תרבות micromass". לפני התרבות, להכין Chondrogenic בינוני (CHM) באופן הבא: לבקבוק 500 מיליליטר אחד של DMEM (4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז) להוסיף 5.0 מיליליטר של FBS (1% ריכוז סופי) ו5.0 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / ml ו10,000 מיקרוגרם / ריכוזי סופי מיליליטר, בהתאמה). לזה, הוסף את סוכני האינדוקציה chondrogenic הבאים כדי להעניק לריכוזים הסופיים הצביעו: L-אסקורבית-2-פוספט (50.0 מיקרוגרם / מיליליטר סופי), אינסולין (6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סופי), transferrin (6.25 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) וTGFβ1 (10.0 ng / ml).
- קציר ASCs צנטריפוגות למשך 5 דקות ב1,200 XG כדי גלולה תאים. ספירת התאים על מנת לקבוע את הצפיפות של ההשעיה התא.
- כדי להכין את כדורי micromass, להכין את שתי השעיות תא: השעיית ניסוי אחד הערוך CHM בצפיפות של 1 x 10 7 תאs / מיליליטר והשעית שליטה אחד שהוכנה בסנטימטר בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר.
- הנח 10.0 "טיפות" μl של ההשעיה הסלולרית בבארות בודדות של צלחת רב גם. לאפשר לדבוק ל2-3 שעות על 37 ° C.
- בעדינות שכבת הטיפות מצופות או CHM או CM נזהר שלא לנתק את התאים.
- תרבות התאים לתקופה של עד 14 ימים בCHM או CM עם שינויים במדיום כל 3-4 ימים. תאים בתרבית בCHM יהיה לדחוס בזמן זה כדי ליצור גלולה micromass בצפיפות גבוהה עם לא מעט תאים בשכבה שמסביב. תאי בקרה בתרבית לא יעברו העיבוי הזה ועוד רבים יימצא כשכבה.
- כדי לאשר chondrogenesis, לתקן את כדורים במשך 15 דקות בparaformaldehyde 4.0% (שהוכנו ב 1x PBS) בטמפרטורת חדר. כתם לנוכחות של proteoglycans sulfated באמצעות כתם היסטולוגית הכחול Alcian.
כדי להכתים באמצעות Alcian הכחול:- שטוף את הרשותכדורים קבוע raformaldehyde פעם אחת ב 1x PBS.
- דגירה את כדורים ב0.1 N HCl (pH 1.0) במשך 5 דקות כדי להוריד את ה-pH שלהן.
- הסר את HCl ולהוסיף 1% מגיב Alcian הכחול (שהוכן ב0.1 N HCl, pH 1.0). דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את המגיב הכחול Alcian ולשטוף את כדורים עם 0.1 N HCl (pH 1.0) כדי להסיר את כתם עודף.
- שוטף נוסף באמצעות מים ברז עשוי לשמש כדי להפחית מכתים רקע.
- כחלופה, כדורי micromass יכולים להיות שנקטפו, קבוע הלילה בפורמלין 10%, משובץ בפרפין והסעיפים מוכתמים עבור Alcian הכחול.
4. תזרים cytometric אפיון ASCs
אפיון פרופיל אנטיגן CD פני התא יכול להתבצע באמצעות cytometry זרימה הקונבנציונלי.
- הכנת ASCs עבור cytometry זרימה: לפנילניתוח, להכין Cytometry הצפת Flow (FCB) מורכבות מהפעולות הבאות: ארגון ה-BSA, 1.0% FBS 2.0% וsaponin 0.025% ערוכים 1x PBS.
- קציר ASCs וצנטריפוגה התאים 5 דקות ב1,200 XG לייצר גלולה.
- Resuspend תאי 1XPBS סטרילי ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. לקבוע את צפיפות התאים של ההשעיה.
- מחלקים את ההשעיה עד לaliquots של 5 x 10 5 תאים בסך הכל ו צנטריפוגות לגלולה.
- הסר את supernatant PBS ולתקן את התאים ל60 דקות ב -20 מעלות צלזיוס עם עודף של אתנול 70% קרים כקרח. במידת צורך, תאים אלה עשויים להיות מאוחסנים באתנול 70% זה ב-20 ° C במקפיא עד צורך.
- בעקבות קיבעון, לשאוב בזהירות ובעדינות אתנול לשטוף את הכדור פעמיים עם עודף של FCB. לשטוף:
- הוספת עודף של FCB ועדינות resuspend את הכדור.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,200 XG כדי לאסוף את התאיםגלולה sa.
- בזהירות לשאוב supernatant FCB.
- חזור על פעולה.
- הסר את supernatant לשטוף FCB הסופי מכל aliquot ו resuspend ב של FCB 100 μl. מוסיף את הנוגדן הראשוני fluorochrome מצומדות הרצוי באמצעות הדילול של היצרן הציע. דגירה התאים על קרח עם הנוגדן ל30 דקות.
הערה: אם נוגדנים ראשוניים fluorochrome מצומדות אינם זמינים, ניתן להשתמש בנוגדנים ראשוניים שאינם מצומדות. - לכל fluorochrome משמש (למשל FITC, PE), דגירה aliquot של תאים עם 100 FCB מיליליטר מכיל IgGs בהתאמה אלוטיפ כביקורת שלילית.
- דגירה aliquot אחד ב100 FCB מיליליטר מכיל לא נוגדנים כבקרה נוספת.
- לשטוף כל aliquot של תאים פעמיים עם FCB כמפורט בשלב 4.1.5. בעקבות לשטוף האחרון, resuspend aliquots בשל FCB 100 מ"ל ולהמשיך בניתוח תזרים.
הערה: אם נוגדנים ראשוניים שאינם מצומדות היו בשימוש: לאחר שלב זה לשטוף דגירה aliquots על קרח עבור 20 דקות עם FCB השלים עם הנוגדנים משני fluorochrome מצומדות המתאימים באמצעות הדילול של היצרן הציע. שטוף פעמיים כפי שתואר בשלב 4.1.5.
- ניתוח תזרים של ASCs: לניתוח תזרים, מינימום של 10,000 אירועים צריך לספור. יש להשתמש בבקרות בלא כתם ובהתאמה אלוטיפ להגדיר שערים על ידי פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC). לשם כך, יש להשתמש לא שולט נוגדנים (כלומר בלא כתם) של צעד 4.1.8 כדי לחסל פסולת וASCs המת. פקדי IgG בהתאמה אלוטיפ של צעד 4.1.7. יש להשתמש כדי לקבוע אזורים של הקרינה חיובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המתווה הפרוטוקול לעיל מתארת שיטה ידנית, אנזימטיים לבידודה של SVF ממדגם lipoaspirate נפח גדול. בתוך SVF זה הן אוכלוסיות תאים רבות, כוללים ASC. מחקרים רבים מציעים כי culturing SVF זה בתנאי תרבות תקן רקמות יבחר עבור אוכלוסיית פיברובלסטים חסיד עשויה להיות מורכבים בעיקר מסוג ASC. עולה בקנה אחד עם זה, שהראינו, באמצעות cytometry זרימה וimmunofluorescence, שכדורי SVF התרבותיים הפכו למעשה ללא סוגים העיקריים מזהמים תאים, כלומר RBCs, תאי שריר חלק ותאים של שושלת אנדותל 1. אוכלוסיית ASC המתקבלת היא הומוגני יחסית במראה ומורכב מתאים דמוי פיברובלסט (איור 2). ASCs חסיד אלה לגדול היטב בתרבות בתנאי תרבית רקמה סטנדרטיות ולהציג אוכלוסייה מתונה זמן הכפלת 1 מה שהופך אותם מתאימים לב מולקולרי של תא רבמחקרי iology במבחנה ומחקרי משובי in vivo. עם זאת, לאור האופי הטרוגניים של SVF המבודד, אימות של אוכלוסיית ASC היא הכרחית. מחקרים רבים המשמשים cytometry זרימה כדי לאפיין את פרופיל אנטיגני התקליטור של ASCs התרבותי כאמצעי פוטנציאלי של זיהוי תאים אלה הן במבחנה in vivo 5-9. טבלת 1 מסכמת את התוצאות ממספר רבים של מחקרים אלה. בעוד הביטוי של כמה אנטיגנים CD אלה נותר שנוי במחלוקת, זה יש הסכמה כללית כי ASCs התרבותי הוא CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 וCD140a חיובי. היעדרם של אנטיגנים רבים hematopoietic תקליטור, כגון CD31 וCD45, עולה בקנה אחד עם מקור mesodermal של ASCs, למרות שהביטוי של סמני hematopoietic ספציפיים כמו CD34 נשאר בלתי פתור בשלב זה. לאחרונה, פרופילי אנטיגני ASC, כפי שנקבעו על ידי cytometry זרימה, היו בשימוש כדי לבחור עבור subpop הספציפיulations 10-12 בתקווה לייצר ASCs עם יכולות הבחנה משופרות.
כאמצעי הפופולרי ביותר של אימות, באינדוקצית מבחנה של אוכלוסיית ASC באמצעות תוצאות תנאי התרבות מוגדרות בבידול שלהם לשושלות mesodermal, ectodermal וendodermal (לסקירה ראה 4) (איור 2). בעוד שבמבחנת פוטנציאל שכבה תלת נבט הביא את השימוש בASCs למגוון רחב של מערכות מודל משובי, בידול לosteogenic, adipogenic ותאי chondrogenic הוא בדרך כלל מספיק כדי לזהות את ASC ולאשר multipotency. בידיים שלנו, בידול adipogenic של תוצאות ASCs תאים המכילים שומנים וקואולות בהירה שכתם באמצעות שמן האדום O 5. תוצאות osteogenic התמיינות בתאי phosphatase החיובי בסיסיים וההצטברות של מינרלים תאיים כי כתמים באמצעות סידן זרחה פון Kossa כתם 5.בידול Chondrogenic בתנאי micromass צפיפות גבוהה מייצר כדורים המכילים proteoglycans sulfated (זוהה באמצעות כתם Alcian הכחול) ולהביע קולגן מסוג 2 5. שני שרירי שלד ושריר חלק בידול ניתן לראות עם ASCs מכתים את שרירן שלד שריר וMyoD1 ויקטינו שריר חלק 5, 13, 14. בידול לשושלת ectodermal הוא הציע דרך ההנחה של מורפולוגיה כמו עצבית אחר ASCs המושרה והביטוי של סמנים עצביים רבים, כולל זה של NeuN, גורם שעתוק עצבי 5. לבסוף, אינדוקציה של ASCs כלפי שושלת הכבד / endodermal מבוסס על תנאים שנקבעו 15 תוצאות בתאים שאלפא fetoprotein ביטוי, סמן ידוע של hepatocytes כבד. סמנים אלה, יחד עם רבים אחרים שפורסמו בשנים האחרונות 10 מראים כי ASC הוא אוכלוסיית תאי גזע pluripotent שאפשר לקיים בקלות ובמופצות במבחנה הנגרם לתאים של שלוש שושלות הנבט עוברית. מצמידים את פוטנציאל ההתחדשות שלהם in vivo (לסקירה ראה 4), ASC יכול להיות תוספת רבת עוצמה לכלים של מדען מחקר משובי או מטפל.
איור 1. בידוד ידני, האנזימטית של ASCs אדם מדגימות lipoaspirate. א 'הכנה לבידוד: לפני הבידוד צריכים להיות מוכנים, את המרכיבים הבאים: 1) 1x PBS (ללא סידן או מגנזיום), מעוקר באמצעות מעוקר, 2) פתרון של .075-0.1% collagenase הסוג IA, שהוכן ב 1x PBS והמעוקר באמצעות סינון באמצעות יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר, 3) בקרה בינונית (CM) לתרבות הבאה של אוכלוסיית ASC. בידוד ב 'של ASCs: מדריך צעד אחר צעד לבידוד של החלק של כלי דם סטרומה (SVF) מlipoaspirates מוצג. צעדים כוללים שטיפת lipoaspirate עם סטרילי 1X PBS, עיכול באמצעות collagenase סוג IA, אוסף של SVF ידי צנטריפוגה, סינון SVF. culturing הבא של SVF יגרום לאוכלוסיית פיברובלסטים חסיד המכילה אוכלוסיית ASC. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. פוטנציאל רב שושלת בידול של אוכלוסיית ASC חסיד. תאי SVF מתורבתים לגרום לאוכלוסייה הומוגני יחסית של ASCs חסיד, fibroblastic. אינדוקציה של אוכלוסיית ASC תחת תוצאות תנאים מוגדרות בתאים של adipogenic, osteogenic, chondrogenic, myogenic שלד ושושלות myogenic חלקים.בנוסף, ASCs עשוי גם להיות מובחן לתוך תאים של שושלת ectodermal, להביע NeuN, סמן של תאי עצב ואלפא fetoprotein סמן הוקם משושלת תא endodermal / כבד (AFP). תמונות היסטולוגיה וimmunofluorescent חלקם נלקחו מ1,5,6,7,8,9 תוצאות שפורסמו בעבר. שושלת בידול, יחד עם היסטולוגית, immunohistologic או כתם ניאון מוצגת. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
| פרופיל ביטוי | ||
| ביטוי חיובי | ביטוי שלילי | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, stro-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| פנוטיפ המוצע של ASCs (נפוץ בין שניים או יותר מחקרים) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, stro-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| סמנים שנויים במחלוקת בASCs (תוצאות ההפרש על מחקרים מרובים) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| ce סטרומהסמני ll | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| סמני hematopoietic | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| סמנים משותפים בין 2 או יותר מחקרים מודגשים SMA = אקטין שריר חלק HLA = אנטיגן ויקוציטים אנושיים ABCG2 = G2 חלבון טרנספורטר סמים רב | ||
טבלת 1. פרופילי ביטוי פני תא של ASCs האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקמת שומן לבידודה של ASCs יכולה לבוא בצורות רבות: מחתיכות מוצקות של רקמה המתקבלות באמצעות כריתה או lipoplasty לחתיכות קטנות יותר שהושגו באמצעות שני חילוץ מזרק או lipoplasty בסיוע יניקה (כלומר שאיבת שומן). האם ניתן להשיג יותר תאי SVF (ובכך ASCs) מדגימות שומן resected או להישאף לא ברור מחקרים סותרים הוצגו 16, 17. יתכן כי גם צורה של רקמת שומן היא יותר ממתאים לבידוד של תאים וASCs SVF כל עוד המפעיל הוא בקיא בטכניקת הבידוד שלהם. עם זאת, שאיבת שומן עושה להחזיק יתרון על פני כריתה בכי זה פחות פולשני ודורש באופן משמעותי פחות שלאחר ניתוח טיפול. בעוד הסוגים של שאיבת שומן גדלו בעשור האחרון, כולל טכניקות, כגון בסיוע אולטרסאונד, כוח סיוע ושאיבת שומן בסיוע לייזר 18, הנפוצה ביותר נותרת שאיבת שומן תופח,שבתא השומן מוצף בכמויות גדולות של מלח סטרילית, הרדמה וvasoconstrictors לפני שאיפת 19. הבחירה של טכניקה יכולה להשתנות ממנתח למנתח. עם זאת, בעוד שאמצעי החילוץ עשוי להיראות חסר חשיבות לחוקר, חשוב להבין כי הטכניקה עשויה להיות השפעה על מספר ASC ויכולת קיום. לדוגמא, לחץ ואקום שאיבת שומן הגדלת יכול להשפיע לרעה על תשואת תא SVF 20. יתר על כן, הירידה בריבוי ASC נמדד על שאיבת שומן בסיוע אולטרסאונד 17.
עם זאת הושג, לשאוב צריך להיות מעובד מהר ככל טמפרטורות אחסון עשויות להשפיע על כדאיות SVF ותשואת ASC סופו של דבר. מחקרים על ידי מאטסומוטו et al. הראו כי תשואת ASC פוחתת אם לשאוב מאוחסנת בטמפרטורת חדר למשך זמן רב יותר מאשר 24 שעות 21. במידת צורך, אחסון 24 שעות ב 4 ° C ניתן להשתמש ללא כל השפעה מזיקהים על המאפיינים הביולוגיים של אוכלוסיית ASC אבל, שוב, כדאיות תא יכול להקטין אם זמן אחסון זה הוא גדל מעבר לנקודה זו. קל עיבוד lipoaspirate קשור באופן ישיר להיקף הכולל שלה. כמויות קטנות יותר, שהושגו באמצעות שאיבה במזרק, קלות יחסית לעיבוד. עם זאת, aspirates הגדול יותר נפח, שהושג באמצעות שאיבת שומן, יכול להציג אתגרים פיזיים. לדוגמא, משהו פשוט כמו העברת השומן מיכל השאיפה כך שניתן לכבס את זה יכול להציג בעיות כאשר לשאוב הנפח גדול. הפרוטוקול שתואר במאמר זה נועד להקל על חלק מהאתגרים הללו.
באופן כללי, הבידוד של אוכלוסיות ASC מlipoaspirates בשיטה האנזימטית המתוארת במאמר זה לא השתנה באופן משמעותי במהלך 10 השנים האחרונות. ישנם פרוטוקולים זמינים דרך PubMed רבים כי הם מצוינים בתיאורם של הבידוד של ASCs מlipoaspirates. MOST שלהם מתאר פרוטוקול דומה מאוד עם שינויים קלים. בעיקרון, lipoaspirate הוא שטף של מזהמים, מתעכל enzymatically לשחרר SVF וSVF, המכיל אוכלוסיית ASC, נאסף באמצעות צנטריפוגה. רוב lipoaspirates נפח הגדול מגיע בסוג כלשהו של מיכל ואקום - לתצורת שיכולה לנוע בין מנתח למנתח. פרוטוקול זה ממליץ הסרת לשאוב לתוך מבחנה גדולה, סטרילי לפני הכביסה, שכן את המכל עצמו עשוי להיות מקור לזיהום אם לא ניקה כראוי לפני ההכנסה למכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. ברגע שהועבר והרשה להם להתיישב על ידי כוח הכבידה, לשאוב יפריד לשלוש שכבות: עליון, שכבת שמן שנובע מתמוגה של adipocytes הבוגרת, שכבת שומן באמצע ושכבה תחתונה של תמיסת מלח ומזהם תאי דם אדומים. שכבת השמן יש להסירם כפי ששמנו לב שזה עלול להיות רעיל לתרבויות וכתוצאה מכך תא (תצפיות פורסמו). גם פרוטו זהcol ממליץ infranatant של תמיסת מלח וRBCs יהיה להסיר לפני הכביסה הראשונה על מנת להקטין את המספר הפוטנציאלי של זיהום RBCs פעם ASCs בתרבית. עם זאת, מחקר שנערך על ידי פרנסיס ואח'. הציע כי infranatant זה יכול להיות גם מקור לASCs 22. השימוש בפיפטה סרולוגיות מיליליטר 10 עושה הסרת infranatant זה קל יחסית. מה שנותר הוא שכבת השומן שלאחר מכן ניתן לכבס בקלות באמצעות PBS סטרילי, או אם תרצה בכך, סטרילי PBS בתוספת אנטיביוטיקה וantimycotic כדי להקטין את הסיכוי לזיהום 23-25. בעקבות כביסה, רקמת השומן היא אנזימים מתעכל באמצעות תמיסה סטרילית מסוג collagenase IA. השימוש של יחידת הסינון כגון יחידת Millipore שמוצגת בסרטון הזה משלב אמצעי נוח של הסביבה נקיה מחיידקי סינון collagenase לתוך מיכל סגור שבו לרקמת השומן שטפה ניתן להוסיף לעיכול במים אמבטיה שלאחר מכן ב 37 ° C.
הסוג של collagenase משמש השתנה מקבוצה לקבוצה עם IA סוג collagenase לכאורה להיות נפוץ יותר 1, 24, 25. עם זאת, ישנם מעל 11 סוגים שונים של collagenase זמין מסחרית, כל אחד עם זיקות עיכול לרקמות ספציפיות. לעיכול של רקמת שומן, חברות כגון סיגמא אולדריץ' ממליצים סוגי collagenase I ו-II ואת שני הסוגים מיוצגים היטב בספרות של היום 1, 24-27. במאמר המקורי שלהם, צוק ואח'. להשתמש בסוג collagenase IA המתקבל ממקורות שור בריכוז של 0.075% 1. עם זאת, רוב המקורות מסחריים מסוג collagenase IA כעת מתקבלים מhistolyticum החיידקים אנאירוביים Clostridium או E. coli מהונדס גנטי עם ג histolyticum גנים. חברות רבות מציעות מספר רב של תכשירים מסוג collagenase IA, מגולמי למי שהוכן באמצעות ממטרים אמוניום סולפט.פרוטוקול המתואר במאמר יופיטר זה משתמש בהכנה גולמי מסוג IA collagenase המכיל פעילויות collagenase לא רק, אלא גם פרוטאז שאינו ספציפי, clostripain ופעילות האנזימטית tryptic. בעוד האנזימים נוספים הללו הם קריטיים ליעילות עיכול 28, יש כאלה שמדווחים על הרבה לשונות הרבה הקשורים לסוג IA 28, 29 collagenase הגולמי ולהגדיל את ריכוזיהם של collagenase עד 0.2% להשיג עיכול יעיל 23. קבוצות אלה באמצעות סוג collagenase הגולמי IA ממליצים גם תוספת שלה עם אלבומין בסרום שור (BSA .1-1.0%) כדי לשפר את הביצועים של האנזים ולהגדיל את היציבות של התאים בתוך מטריצת השומן. עם זאת, זה לא יכול להיות נחוץ, שכן הפרוטוקול שתואר במאמר זה משתמש collagenase ללא תוספים אין כל השפעה שלילית על יעילות עיכול.
לכל מי שרוצה להשתמש בחינמון collagenase מוגדר יותרosition, מקורות מסחריים המכילים collagenase הנקי במיוחד ביחד עם שילוב מדויק של פרוטאזות זמינים כעת. הכנות אלה לטהר סוגי collagenase קלוסטרידיאל I ו-II לפעילות גבוהה ולשלב אותם עם פעילויות ידועות ניטרליות פרוטאז, כגון dispase וthermolysin. עיכול שומן יעיל באמצעות collagenase וthermolysin כבר דווח על ידי זכר et al. 27. בהסכם עם עבודה זו, Pilgaard et al. 30 גם לדווח על יעילות עיכול מצוינת באמצעות מספר תערובות של collagenase וthermolysin. עם זאת, הם עדיין צופים יעילות עיכול טובה יותר באמצעות הכנות של collagenase וdispase.
זמני עיכול לבידוד של תאים מרקמת שומן יכולים להשתנות ממחקר למחקר. פרוטוקולים שפורסמו פעמים רבות ממליצים עיכול של 1-2 שעות 27, 30. עם זאת, חשוב להבין כי פעמים עיכול מופרזות עלולות סופו של דבר משפיעות על מספר AS קיימאCs ופנוטיפ תאי גזע שלהם. Pilgaard ועמיתיו קבעו כי עיכול השעה 2 ב 37 ° C נותן את האיזון הטוב ביותר בין ניתוק רקמות ופונקציונליות ASC 30, עם זכרתי et al. ממליץ לעיכול, 45 דקות האחרונות, ניתן לצפות בכל 15 דקות עד 2 מקסימום שעות, עם עיכול שהפסיק ברגע שרקמת השומן לוקחת על מראה הומוגני יותר 27. אנו מסכימים עם המלצה זו. עם זאת, הניסיון שלנו שרוב IA הכנות סוג collagenase ב.075-.1% מסוגלות לעכל כמויות גדולות של lipoaspirates ב30-45 דקות ושזמנים אלה מספיקים כדי לשחרר כמות מספקת של תאים. לכן, פרוטוקול זה ממליץ זמן עיכול של 30 דקות. אם נדרש יותר זמן, העקביות של lipoaspirate צריכה להיות במעקב ועיכול נעצר כאשר lipoaspirate מניח "שמנת" או מראה "בוצי" (איור 1).
ברגע שהעיכול דואר יושלם, בידוד של SVF שוחרר הוא פשוט מושגת באמצעות צנטריפוגה. עם זאת, כמו לחץ שאיפה, ההשפעות פיזיות של צנטריפוגה עשויות להיות השפעה על כדאיות SVF ומספר ASCs זמין עבור תרבות. מחקר של Kurita והעמיתים ביום 31 הראה כי למהירות העולה על 3,000 XG יכולה לפגוע ASC. עם זאת, מהירויות צריכה להיות משמעותיות מספיק כדי להבטיח pelleting נאות של SVF. ככלל, רוב הפרוטוקולים, כולל זה, ממליצים מהירות צנטריפוגה של 1,200-1,500 x גרם. יש להקפיד על ידי החוקר, כדי להבטיח שהם מבינים את הקשר בין כוח הצנטריפוגלי (נמדד בגרם) ומהירויות צנטריפוגה (נמדדים כסל"ד), כמערכת היחסים תלויים בהרוטור צנטריפוגות הספציפי. עם זאת, ככלל, כוחות צנטריפוגליים נמוכים יותר, כגון 1,200 XG, הם לעתים קרובות שווי ערך למהירות צנטריפוגה ועשויים לשמש בבטחה לסירוגין.
ספינינג הבא, כמה diשכבות stinct הם נצפו בצינור צנטריפוגות (איור 1): שכבה עליונה של שמן וadipocytes הלבנה "רכה", שכבת collagenase אמצע ותא גלולה. גלולה עצמו עשויה להיות שתי שכבות נפרדות: שכבה עליונה של תאי דם אדומים וגלול SVF הלבן נמוך יותר, המכילה את ASCs. פרוטוקול זה ממליץ שאיפה זהירה של הנפט וadipocytes, כפי שהשמן עלול להיות רעיל לתא התרבות וadipocytes הוכחו להיות מסוגל טשטוש ההבדלים חזרה לסוג תא פרימיטיווי יותר 32. עם זאת, תאי שומן אלה עשויים להיות שנקטפו בשלב אם תרצה בזה. בגלל מזהמים אלה, פרוטוקול זה ממליץ שלב כביסה נוסף כדי להבטיח ההסרה נאותה שלהם. צעד זה גם מאפשר לחוקר לשלב כדורי SVF מרובים על מנת להקל הבא של סינון. סינון עשוי להיות נחוץ בשל נוכחותם של חלקים גדולים של חומר fibrotic ואגרגטים הסלולר הבא עיכול. חומרים אלה יוסרו בקלותבאמצעות סינון המבוסס על כוח משיכה פשוט דרך 70 או 100 מסנני רשת מיקרומטר. Aliquot של התסנין ניתן לנקוט על מנת לספור את מספר תאי בעלי הגרעין אם תרצה בכך והתסנין שנותר מצופה לדבקות ASC והתרחבות.
למרות ניסיונות חרוצים להסיר RBCs רבים ככל האפשר, ללא הכנת ASC תהיי לחלוטין ללא זיהום RBC. במאמר המקורי שלנו, שהצענו את ההסרה של תאי דם אדומים אלה באמצעות resuspension של גלולה בפתרון hypotonic של 160 מ"מ NH 4 Cl. רוב מאמרי בידוד לאחר מכן להכיל על שלב זה וממליץ על השימוש בNH 4 פתרונות או מים סטריליים 22-24, 27, 33 מבוססי Cl, אם כי יש לנקוט זהירות אם משתמש במים סטריליים, כדי למזער את זמן תאי SVF נחשפים לפתרון hypotonic 27. עם זאת, בשלב זה לא יכול להיות במידה צורך פני כדוריות דם אדומים הן אוכלוסיית תא שאינה חסיד ובקלות ניתן להסיר הבא תרבות לילה שלאוכלוסיית ASC. יתר על כן, בעוד אנקדוטלי במקרה הטוב, RBCs אלה מופיעים כדי לשפר את ההתרחבות הראשונית של תאים חסיד וכתוצאה מכך (צוק, תצפיות לא פורסמו). ככזה, פרוטוקול זה מבטל את צעד תמוגה RBC ומציע שתורשינה תרבויות ASC הראשוניות להרחיב בנוכחות תאי הדם אדום אלה ל3-4 הימים הראשונים ללא כל שינוי של מדיום התרבות. הסיבה להבחנה זו עשויה להיות בשל איזה סוג של איתות אוטוקריני את זיהום תאי דם או עשוי להיות פשוט בשל כדאיות טובה יותר עם ההרחקה של צעד תמוגה RBC. בעקבות זאת, התרבות בינונית יכולה להישאף ורוב RBCs הוסרו בעדינות על ידי שטיפת הצלחות עם סטרילי 1X PBS. במשך זמן, כל שנותר RBCs סופו של דבר למות ויוסר מהתרבות.
מחקרים על ידי זכרתי וBoquest העריכו כי 25-50% מגלולת SVF המושהה שומרת על תרבות רקמות פלסטיק 23, 27. מ"ק ASC כתוצאה מכך "מעבר 0"ltures הוא הטרוגנית, מורכב מתאים קטנים, עגולים חשבו להיות ASCs ותאים בצורה יותר סדירה הציע להיות אנדותל במקורם. בעוד שמחקרים על ידי קבוצות רבות, כולל שלנו אישרו את היעדר זיהום סוגי תאים כגון SMCs, תאי hematopoietic ו fibroblasts בתרבויות ASC 1, הנוכחות של סוגים נוספים של תאים לא ניתן לשלול. . אכן, Tallone אח' מאפיין את המעבר 0 תרבויות וציין ארבע אוכלוסיות מובחנות: 1) קטן, עגול תאים במהירות חידוש,, 2) תאי fibroblastic דמוי כישור חשבו להיות ASC, 3) המשכפלים לאט תאים גדולים עם מוגבלים יותר (כלומר מראש adipocytes) פוטנציאלית ו4) תאי אנדותל cuboidal שאבדו עם חלוף 34. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי האוכלוסייה העגולה, במהירות חידוש התא בעל multipotentiality הגבוה ביותר ולהביע סמנים אופייניים בתאי גזע 35, 36. יתר על כן, הם עלולים להיווצר "הספרואידים" בשלההתפשטות המהירה שלהם לעתים קרובות מוקפת fibroblasts דמוי כישור. ככזה, זה אפשרי, כי אוכלוסיית ASC הציר בצורה המוצעת לעיל עשויה לנבוע מהתאים אלה. בעקבות התרחבות ראשונית של תרבויות ASC אלה מעבר 0, הוא חשב כי culturing המשך לאורך הזמן בוחר לASC, עם התרבויות וכתוצאה מכך בהנחה יותר fibroblastic, קומפוזיציה הומוגנית. עם זאת, שרידים של תאים מזהמים לא ניתן לשלול לחלוטין את, ולכן אוכלוסיית ASC עדיין צריכה להיחשב הטרוגנית.
בעוד הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא פשוט, זול ואינו דורש כל חתיכות של ציוד לא נמצאו בדרך כלל במתקן בתרבית רקמה, אך יש לה החסרון של צורך במתקן כזה. מחקרים רבים חקרו את יישומי translational של ASCs באמצעות מודלים של בעלי חיים ומחקרים קליניים באמצעות ASC החלו להופיע (לסקירה ראה 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הסופרים של כתב היד הזה הם שיתוף ממציאים בפטנטים שבבעלות העוצרים של אוניברסיטת קליפורניה ומורשה לTherapeutics Cytori.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ולהודות לאנשי מחקר נוספים אלה שתרמו לפיתוח של הפרוטוקול המתואר ובידודה של ASCs, ביניהם: ד"ר ה 'פיטר לורנץ, MD, ד"ר הירושי Muzuno, MD, ד"ר ג'רי הואנג, MD , ד"ר האדם כץ, MD, ד"ר ויליאם פוטרל, MD, ד"ר רונג ג'אנג, DDS, PhD, ד"ר לריסה רודריגז, MD, ד"ר Zeni אלפונסו, PhD, וד"ר ג'ון פרייזר, PhD. התוצאות שהוצגו מומנו בחלקו על ידי מענקי מחקר מהמכון הלאומי לבריאות, כולל NIAMS ומכוני NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M.
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
