Summary
2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.
Abstract
2001 년에, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스의 연구자들은 초기 가공 Lipoaspirate 세포 또는 PLA 세포를 지칭 liposuctioned 지방 조직에서 성체 줄기 세포의 새로운 인구의 격리를 설명했다. 그 후,이 줄기 세포는 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC로 개명 된 줄기 세포 연구 및 재생 의학 분야에서 가장 인기있는 성체 줄기 세포 집단 중의 하나가되기 위하여 갔다. 기사의 수천은 지금 뼈 재생, 말초 신경 수리 및 심장 혈관 엔지니어링을 포함하여 재생 동물 모델의 다양한부터 ASC를 사용하는 방법을 설명합니다. 최근 기사는 병원에서부터 ASC를위한 용도의 무수한을 설명하기 시작했다. 이 문서에 나와있는 프로토콜을 수동 및 효소 화장품 절차에서 얻은 lipoaspirates 많은 양에서부터 ASC를 분리하기위한 기본 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 확대 또는 축소 accommod 아래로 할 수있다lipoaspirate의 볼륨을 먹고 복부 성형술 및 기타 유사한 절차를 통해 얻은 지방 조직에서부터 ASC를 분리하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
2001에서, 지방 조직에서 다 능성 줄기 세포의 추정 인구는 저널 조직 공학 1에 기재 하였다. 이 세포는 성형 수술을 통해 얻은 처리 lipoaspirate 조직에서 자신의 유도에 의한 이름 가공 Lipoaspirate 또는 PLA 세포를 부여했다. 이 문서에서 설명하는 분리 방법은 지방 조직 2의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리에 대한 기존의 효소 전략을 기반으로했다. SVF는 조직 배양 기판 (2, 3)에 밀착 아직 적혈구 세포, 섬유 아세포, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포와 전 지방 세포의 최소 처리 인구로서 정의되었다. 시간이 지남에 따라이 SVF의 배양은 이러한 오염 된 세포 집단의 대부분을 제거하고 부착 성, 섬유 아세포의 집단 발생하는 것이 제안된다. 이러한 섬유 아 세포는 미리 것으로 지난 40 년 동안 문헌에서 확인 된지방 세포. 그러나, 우리의 연구 그룹은이 세포가 중배엽 다 능성을 보유하고 PLA 세포로 부착 SVF 인구 이름 것을 보여 주었다. 많은 다른 연구 그룹에 의해 후속 연구 (리뷰가 4 참조) 내배엽과 외배엽의 잠재력을 모두 제안하고,이 잠재력을 추가했습니다. 그 이후로,이 세포에 대한 많은 추가적인 조건이 문헌에 등장했다. 컨센서스의 일부 유형을 제공하기 위하여, 용어 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC는 2 차 연례 IFATS 회의에서 채택되었다. 따라서, 용어 ASC는이 문서에서 사용됩니다.
이 문서에서 설명하는 프로토콜은 표준 실험실 장비를 필요로하고 포스 완충 식염수, 표준 조직 문화 미디어 시약 및 콜라게나 간단한 시약을 사용하는 비교적 간단한 절차입니다. 이것은 지방 조직 부피와 후속 C의 개시 량에 따라부터 ASC 다수 생성 할ulture 시간. 그러나, 지방 조직 등의 대량의 처리는이 프로토콜을 사용하는 정도로 완화 될 수있는 물리적 인 문제를 제시 할 수있다. 또한,이 프로토콜함으로써 승인 된 조직 문화 시설의 사용을 필요로 무균 조직 배양 시설과 승인 된 바이오 안전성 후드를 요구한다. 그들은 좋은 제조 연습 임상 사용의 분리 및 재료의 확장을위한 설계 (GMP) 승인 시설에서 격리하지 않은 경우,이 요구 사항은 임상 응용 프로그램에서 ASC 인구의 유용성을 감소시킬 수있다. 다른 방법으로 운영 극장에서 닫힌 시스템에서부터 ASC를 분리 할 수 있습니다 자동화 시스템은이 중요한 문제를 피할 것이다 이후 체외 확장에 대한 필요없이부터 ASC의 즉시 사용할 수 있습니다. 지금까지 인간의 조직에서 세포의 분리를 위해 상업적으로 이용 가능하다 여섯 자동화 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 가능하게 격리 할 수있다즉시 수확을 다음과 지방 조직의 양이 많은부터 ASC의 상당수. 이러한부터 ASC는 지금 수술실을 떠나지 환자없이 재생하는 다양한 목적을 위해 환자에 재 도입 될 수있다. 부터 ASC를 수동으로 분리를 설명하는이 프로토콜뿐만 아니라, Celution 시스템을 사용부터 ASC의 자동 분리를위한 프로토콜은 또한 동반자 문서에 나와있다.
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Protocol
여기에 표시된 프로토콜은 소화 효소 및 차등 원심 분리를 사용하여 화장 절차를 통해 얻은 lipoaspirates에서부터 ASC의 매뉴얼 격리를 설명합니다. 이 프로토콜은 먼저 2001에서 저널 조직 공학에 게시 된 위치 결과 세포 때문에 lipoaspirates에서 그들의 분리의 가공 Lipoaspirate 세포 또는 PLA 세포라고했다. 그러나, 용어 PLA 세포는 이제 용어의 지방 유래 줄기 세포 또는 필드에게 명명법 측면에서 적합성의 일종을 제공하기부터 ASC로 대체되었습니다. 이 프로토콜을 통해 고립 된 세포는 (검토를 위해 4 참조) 시험 관내 및 생체 내에서 모두 중배엽 잠재력을 가지고 많은 것으로 나타났다. 또한, ASC의 외배엽과 내배엽 잠재력도 4를 탐구하고 있습니다. 분리 기술은 단순하고 간단하고 완료하는 데 약 1 시간이 필요합니다. 그 결과 세포의 표준 조직 배양 조건에서 배양된다. 문화 시간에 ASC 인구는 더 균질 쉽게 확장 및 문화에 장기적으로 좋은 가능성을 보여 섬유 아세포의 세포로 구성되어 있습니다.
참고 : 필요한 장비의 다음 조각은이 문서의 끝 부분에 나와 있습니다. 모든 유리, 미디어 및 시약은 고압 증기 멸균을 통해 멸균 또는 0.22 μm의 필터를 통해 필터링해야합니다. 무균 조직 배양 기술은 항상 따라야한다. 이를 보장하기 위해, 바이오 안전성 캐비닛에 배치 된 모든 재료는 70 % 에탄올 용액을 분사하고 깨끗한 종이 타월로 닦아 소독해야한다.
1. 이전에 수확하려면 다음을 준비한다 :
- lipoaspirates의 세척 살균 1X의 포스 완충 식염수 (PBS). lipoaspirate의 각 100 ㎖에 1X PBS의 약 1 L를 준비합니다. PBS와 모든 압력솥사용하기 전에 실온으로 냉각 OW. 옵션으로, 항생제 / 항진균제는의 최종 농도로 첨가 될 수있다 : 100 IU / ml의 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신 및 2.50 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B는 PBS 냉각되면.
- lipoaspirate의 효소 소화 (클로스 트리 디움 histolyticum부터) 무균 0.075-0.1 % 콜라게나 제 유형 IA. 정제, 즉 원유 대 - 농도는 콜라게나 제의 품질과 소스에 따라 달라집니다. 기타 유형의 콜라게나 제 (예 : 콜라게나 제 유형 II 또는 IV) 유사한 농도로 사용될 수있다. 0.22 μm의 필터를 1,000 ml의 여과 시스템 (그림 1A)를 사용하여 1X PBS 및 살균 필터에 준비합니다. 그러나, 병의 상부 필터 장착 무균 유리 병이 또한 사용될 수있다. 준비하고 실온에서 사용합니다. 필요할 때까지 콜라게나 솔루션은 4 ° C에서 짧은 기간 동안 저장 될 수있다. 그것의 활동을 줄일 수 있으므로 콜라게나 솔루션을 동결하지 마십시오.
- 콜라게나 제의 불 활성화 및 ASC 인구의 배양을위한 살균 제어 중간 (CM). CM 500 ㎖를 들어, 결합 다음 50 ㎖ 소 태아 혈청 (열 불 활성화), 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 IU 페니실린, 10,000 ㎍ / ㎖를 500 ㎖의 DMEM (L-글루타민과 4.5 g / L의 포도당), 스트렙토 마이신). 옵션으로, 5 ㎖ 암포 테리 신 B (250 ㎍ / ㎖의의 암포 테리 신 B)도 추가 할 수 있습니다. 멸균되지 않은 시약이 사용되는 경우이 미디어의 무균 여과가 필요합니다. 매체를 따뜻하게하기 위해 사용하기 전에 37 ° C 물 목욕 30 분에 CM을 놓습니다.
- 격리를위한 멸균 유리 및 plasticware에가. 1,000 ㎖의 유리 비커를 압력솥 사용하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 또, 다음 plasticware에 준비해 : 무균 혈청 피펫 (5 ㎖, 10 ㎖ 및 25 ㎖), 50 ㎖ 원심 분리 튜브 및 조직 배양 - 처리 된 배양 접시를.
2. L에서부터 ASC의 분리ipoaspirates
대부분 lipoaspirates는 흡입 용기 (도 1b 참조)에서 수집되고 세 개의 서로 다른 층으로 구성 될 수있다 : 때문에 성숙한 지방 세포의 용해에 오일의 1) 상층, 지방 조직의 2) 중간층, 3) 바닥 액체 infranatant가 식염수를 포함하고 적혈구 (적혈구)와 같은 세포 유형을 오염. 위에 기름 층이 상당한 양으로 존재하지 않을 수 있습니다. 있을 경우 결과 ASC 문화의 기름 오염이 문화의 생존에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 흡입해야한다. 바닥 infranatant는 적혈구와 ASC 문화의 오염을 최소화하기 위해 처리 전에 제거해야합니다. 이 후 세척하고 효소의 세포, 기질 혈관 분획 (SVF)을 해방하기 위해 소화 할 중간, 지방 조직의 층을 떠날 것입니다.
- lipoaspirate 세척 : 조직 배양 시간에 lipoaspirate 컨테이너를 엽니 다짐 우드 조심스럽게 멸균 1 L 유리 비커에 lipoaspirate을 가만히 따르다. 지방 조직 층이 아니라 (그림 1B)로 분리 될 때까지 lipoaspirate 층이 분리 할 수 있습니다.
- 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 멸균, 유리 피펫 및 바닥 식염수 infranatant를 사용하여 기름 층 (있는 경우) 대기음. 이는 적혈구와 염분 오염의 큰 대부분을 제거합니다.
- 얻어진 지방 조직 층의 체적을 평가하고 동일 부피에서 멸균 1X PBS를 추가한다. PBS로 lipoaspirate를 혼합하기 위해 흡입에 사용되는 피펫 대기음을 저어. 두 층이 정착 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이, 1X PBS 항생제 / antimycotics로 보충 될 수있다.
- 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 infranatant를 대기음.
- 단계 2.1.2에 설명 된대로 지방 조직의 일부를 세척하는 것을 계속한다. 및 2.1.3. 지방 레이어는 노란색 / 골드 컬러가 될 때까지. 기음 일전자 유리 비커에 지방 조직의 일부를 떠나, 마지막으로 한 번 infranatant. infranatant의 적절한 제거를 보장하기 위해, lipoaspirate 층이 마지막 세척 후 최종 흡인하기 전에 5 분 동안 정착 할 수 있습니다.
- lipoaspirate의 소화 효소가 : 필터 유닛 위에서 설명 된대로 무균 콜라게나 제 1A 솔루션을 준비합니다. 지방 분획 및 살균 필터와 동일한 볼륨을 준비합니다.
- 콜라게나 제 용액의 여과 후, 상부 필터 유닛을 폐기 신중하게 콜라게나 제 용액에 세척 지방의 비율을 부어 단단히 병을 닫습니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 콜라게나 / 지방 혼합물을 놓고 30 분 동안 37 ° C에서 소화. 부드럽게 콜라게나 / 지방 혼합물마다 5 ~ 10 분을 소용돌이 물을 욕조에 다시 배치합니다. 지방 조직의 층은 "부드러운"모양 (Figur에해야전자 1B) 소화가 진행. 지방 조직의 계층은 여전히 내에서 지방의 단단한 조각이 나타나는 경우 추가 소화 시간 (즉, 2 시간까지) 사용할 수 있습니다.
- 부터 ASC의 분리 : 다시 바이오 안전성 캐비넷에 장소 소화 콜라게나 / 지방질의 혼합물. 이전 캐비닛에 다시 배치에 70 % 에탄올로 필터 장치를 소독해야합니다.
- 피펫 25 ㎖의 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 SVF를 함유 infranatant의 분취.
- 각 튜브에 CM의 25 ML을 추가합니다. CM은 5 분 동안 캐비닛에 실온에서 배양하여 콜라게나 제를 비활성화 할 수 있습니다.
- 펠릿으로 SVF를 수집하는 1,200 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 생물 안전 캐비닛에서 각 튜브에서 뜨는을 대기음. (위에 기름 층을 확보하고 부동 지방 세포는이 상층으로 흡입된다
- 30 ㎖의 CM을 사용하여 하나의 원심 분리 관에 SVF 알약을 결합하고 두 개의 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 똑같이 나눕니다. 단계 2.3.3에서와 같이 원심 분리기. 및 (도시되지 않음)이 SVF 펠렛으로부터 상등액을 흡인.
OPTIONAL : RBC 용해 원하는 경우, RBC 용해 완충액 (160 mM의 NH4Cl 등) 10 ㎖에 각각 SVF 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. 단계 2.3.3에서와 같이 원심 분리기. 및 (도시되지 않음) SVF 펠렛을 수득 한 상청액을 대기음.- 5 ~ 10 밀리리터 CM (그림 1B)를 사용하여 하나의 새로운 원심 분리기 튜브에 두 SVF 알약을 결합합니다.
- 큰 조직의 입자를 필터링하려면 새 50 ㎖ 원심 분리 관의 상단에 배치 100 μm의 메쉬 필터에 재현 탁 SVF 펠렛을 피펫과 중력 흐름에 의해 필터링 할 수 있습니다.
- 재현 탁의 피펫 분주(여과) 조직 문화 처리 된 배양 접시 위에부터 ASC를 포함 SVF 펠렛. CM의 적절한 볼륨으로 각 요리를 보충합니다.
- 문화 37 ° C, 미디어의 변화없이 5 % CO 2에서 3 ~ 4 일 CM에있는 세포.
- 30 ㎖의 CM을 사용하여 하나의 원심 분리 관에 SVF 알약을 결합하고 두 개의 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 똑같이 나눕니다. 단계 2.3.3에서와 같이 원심 분리기. 및 (도시되지 않음)이 SVF 펠렛으로부터 상등액을 흡인.
초기 배양 기간 후, 배양 배지를 흡인 할 수 있고, 어떤 오염 적혈구 부드럽게 멸균 1XPBS로 세척하여 제거 하였다. CM으로 교체하고 필요에 따라 문화부터 ASC를 계속합니다. 조직 배양 접시 및 사용 방법에 재현 탁 SVF 펠렛 접시들 사이에서 분할된다의 형식은 종래의 조직 배양 다음 원하는 세포의 수에 의존 할 것이다.
3. ASC 인구의 특성 : 유동 세포 계측법 및 multilineage의 차별화
일단 고립 된, ASC 인구의 특성을 수행해야합니다. 이것에 대한 기존의 접근 방식은 흐름 사이토 포함metry는 세포의 세포 표면 항원 CD 프로파일을 특성화하고 체외 분화 그들의 multilineage의 분화 능력을 확인하기 위하여. 여러 계보부터 ASC에서 평가 될 수 있지만,이 프로토콜은 multilineage의 중배엽 전위 5를 확인하는 수단으로 지방 형성, 골 형성과 연골 계통의 세포로부터 ASC의 분화를 설명합니다.
부터 ASC의 체외 멀티 혈통 분화
- 부터 ASC의 골 형성 분화는 다음과 같이 이전 유도로, 골 형성 매체 (OM)를 준비 : DMEM 중 하나를 500 ㎖ 병에 (4.5 ㎍ / ㎖ 당) 페니실린 / 스트렙토 마이신의 25.0 FBS (5.0 % 최종 농도)의 ㎖ 및 5.0 ㎖를 추가 (10,000 IU / 각각 ㎖ 및 10,000 ㎎ / ㎖ 최종 농도). 덱사메타손 (0.1 μM 최종), L-아스 코르 빈산 2 - 인산 (50.0 μM의 마지막이에 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 다음과 같은 골 형성 유도 요원을 추가) 및 β-글리세로 포스페이트 (최종 10.0 mm)입니다.
- 종래 유도 수확 및 약 50 %의 컨 플루가 달성되도록 원하는 조직 배양 접시에 배양부터 ASC를 플레이트. 모든 실험 접시 도금의 경우, 비에 의한 제어를위한 추가적인 요리를 접시. CM 문화의 하룻밤.
참고 : 50 %의 포화 상태는 그 유도 과정을 통해 발생할 수있는 지속적인 확산을 허용하기 위해 권장 - 유도의 날, 배지를 제거하고 다음과 같은 추가 컨트롤 우물에 원하는 골 형성 실험 우물과 CM에 OM을. 사용되는 매체의 부피는 조직 배양 접시의 크기에 의존 할 것이다. 12 잘 요리에 잘 당 미디어 1.0 ML 충분하다. 6 잘 요리에 잘 당 미디어 2.0 ML은 충분하다. 100mm 식기, 접시 당 미디어의 10.0 ㎖를 사용해야합니다.
- 해당 매체의 변화 때마다 3 ~ 4과 14 일의 최소 배양 세포일. 높은 골 형성 ASC 인구는 빠르면 7 일 유도와 같은 세포 외 미네랄 침착의 흔적을 표시 할 수 있습니다.
- 조골 세포의 분화 (즉, 세포 미네랄 증착) 인산 칼슘의 폰 Kossa의 조직 학적 염색을 사용하여 확인 할 수있다. 이 얼룩은 세포 외 칼슘 포스페이트 (도 2 참조)의 존재를 식별하는 검은 갈색 침전물을 생성 할 것이다.
폰 Kossa 시약 얼룩이 :- 제어 세포에서 실험 세포에서 OM 및 CM를 제거
- 1X PBS에서 제조 된 4.0 % 파라 포름 알데히드에 60 분 동안 세포를 고정합니다.
- 1X PBS로 세포를 두 번 씻으십시오.
- 30 분 동안 어둠 속에서 (물 제조) 2.0 % 질산은으로 세포를 품어.
- 질산은을 제거, 증류수 및 공기 건조 세포로 2 회 세척한다.
- CAL을 개발하기 위해 60 분 동안 UV 광에 노출 될 세포cium 포스페이트 침전물.
- 1XPBS로 세포를 여러 번 씻는다.
- 원하는 경우 헤 마톡 실린과 셀을 Counterstain.
- 종래 유도 수확 및 약 50 %의 컨 플루가 달성되도록 원하는 조직 배양 접시에 배양부터 ASC를 플레이트. 모든 실험 접시 도금의 경우, 비에 의한 제어를위한 추가적인 요리를 접시. CM 문화의 하룻밤.
- 부터 ASC의 지방 형성 차별화 : 이전 유도로, 다음과 같이 지방 형성 매체 (AM)을 준비한다 (4.5 ㎍ / ㎖ 당) (10.0 % 최종 농도) FBS의 50.0 mL를 DMEM 중 하나를 500 ㎖ 병에 페니실린 / 스트렙토 마이신 5.0 ㎖ (10,000 IU / 각각 ML 10,000 ㎍ / ㎖의 최종 농도). - 인도 메타 신 (최종 0.2 ㎜)과 인슐린 (10.0 μM 최종 덱사메타손 (1.0 μM 최종), 3 - 이소 부틸 -1 - 메틸 크 (최종 0.5 ㎜ IBMX) : 여기에, 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 다음과 같은 지방 형성 유도 요원을 추가 ).
- 종래 유도 수확 및 약 80 %의 컨 플루가 달성되도록 원하는 조직 배양 접시에 배양부터 ASC를 플레이트. 모든 실험 접시 도금의 경우, 추가 플레이트비에 의한 제어를위한 알 요리. . 문화 하룻밤 CM 참고 :부터 ASC의 지방 형성의 분화가 증가 자랄 때 더 효율적으로 나타납니다.
- 유도의 날, 배지를 제거하고 다음과 같은 추가 컨트롤 우물에 원하는 골 형성 실험 우물과 CM에 오전. 사용되는 매체의 부피는 조직 배양 접시의 크기에 의존 할 것이다. 12 잘 요리에 잘 당 미디어 1.0.ml 충분하다. 6 잘 요리에 잘 당 미디어 2.0 ML은 충분하다. 100mm 식기, 접시 당 미디어의 10.0 ㎖를 사용해야합니다.
- 문화 적절한 매체의 변화 모든 3-4일과 14 일의 최소 세포. 높은 지방 형성 ASC 인구는 초기 7 일 유도와 같은 지질 액포 형성의 징후를 표시 할 수 있습니다.
- 지방 형성 분화를 겪고부터 ASC 쉽게 광학 현미경으로 시각화 할 수있다 여러 지질 액포를 개발할 것입니다. 또한, 지방 형성 차별화 할 수있다(그림 2 참조)이 액포 내에 축적됩니다 오일 레드 O의 조직 학적 염색을 사용하여 확인.
오일 레드 O에 얼룩이 :- 실험 및 제어 세포에서 용지를 제거하고 10 % 공식적인 칼슘 정착액을 사용하여 60 분 동안 수정합니다. 이 정착액을 준비하려면 다음을 결합 : 염화칼슘 1.0 g, 25.0 ml의 16 % 파라 포름 알데히드 (4.0 % 최종) 및 75.0 ㎖의 증류수.
- 1X PBS로 세포를 두 번 씻으십시오.
- 70 % 에탄올로 간단히 세포를 씻으십시오.
- 오일 레드 O 용액으로 5 분 동안 실온에서 세포를 배양한다. 오일 레드 O 용액을 제조, 50.0 ml의 70 % 에탄올 중의 2.0 g 오일 레드 O 분말 및 50.0 ㎖의 아세톤에 녹여.
- 수돗물로 70 % 에탄올로 다음 세포를 씻으십시오.
- 곧 인해 시간과 얼룩의 퇴색으로 염색 한 후 세포를 시각화.
- 부터 ASC의 연골 세포로의 분화 : 연골 분화 "micromass 문화"라 고밀도 배양 기술을 통해 달성된다. 다음과 같이 이전에 문화, 연골 중간 (CHM)를 준비 : DMEM 중 하나를 500 ㎖ 병에 (4.5 ㎍ / ㎖ 당) FBS (1 % 최종 농도)의 5.0 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 5.0 ㎖ (10,000 IU / mL를 넣고 10,000 ㎍ / ㎖의 최종 농도, 각각). L-아스 코르 -2 - 포스페이트 (최종 50.0 ㎍ / ㎖), 인슐린 (최종 6.25 ㎍ / ㎖), 트랜스페린 (최종 6.25 ㎍ / ㎖) 및 TGFβ1 : 이로 나타낸 최종 농도를 제공하기 위해 다음과 같은 연골 감응 제를 추가 (10.0 NG / ㎖).
- 세포 펠렛 1,200 XG에서 5 분부터 ASC와 원심 분리기를 수확. 세포 현탁액의 농도를 결정하기 위하여 세포를 카운트.
- micromass의 펠렛을 제조하기 위해, 두 개의 세포 현탁액을 준비 : 1 X 10 7 세포의 밀도로 CHM에서 제조 한 실험 중단을S / ㎖ 및 1 × 10 7 세포 / ml의 밀도로 CM에서 제조 한 제어 서스펜션.
- 멀티 잘 접시의 각각의 우물에 세포 현탁액의 10.0 μL "물방울"을 놓습니다. 37 ℃에서 2 ~ 3 시간 동안 준수 할 수 있도록 허용
- 부드럽게 CHM 또는 CM 하나가 세포를 떼어 놓다하지 않도록주의하고있는 도금 방울을 오버레이.
- 문화 매체의 변화 모든 3-4일와 CHM 또는 CM에 최대 14 일 동안 세포. CHM에서 배양 된 세포는 주변 단층 없음 셀이 거의 고밀도 micromass 펠렛을 형성하기 위해 이번에 위에 응축한다. 배양 제어 셀이 응축을 일으키지 않음 많은 사람들이 단일 층으로 발견 될 것이다.
- 연골을 확인하려면, 실온에서 (1X PBS에서 준비) 4.0 % 파라 포름 알데히드의 15 분의 알약을 고정합니다. 알 시안 블루 조직 학적 염색을 사용하여 황산 프로테오글리칸의 존재를 얼룩.
알 시안 블루를 사용하여 얼룩하려면- PA 세척한 번 1X PBS에 raformaldehyde 고정 펠렛.
- 자신의 pH를 낮추기 위해 5 분 동안 0.1 N HCl을 (산도 1.0)에서 알약을 품어.
- 염산을 제거하고 (0.1 N 염산, pH를 1.0으로 제조) 1 % 알 시안 블루 시약을 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 알 시안 블루 시약을 제거하고 여분의 얼룩을 제거하기 위해 0.1 N 염산 (산도 1.0)으로 펠릿을 씻어.
- 수돗물을 이용한 추가 세척 배경 염색를 줄이기 위해 사용될 수있다.
- 대안으로, micromass 펠렛, 수확 할 수있다 10 % 포르말린에 밤새 고정, 파라핀 및 섹션 알 시안 블루 스테인드.
4. 부터 ASC의 유세포 특성
세포 표면 항원 CD 프로파일의 특성은 종래의 유동 세포 계측법을 통해 달성 될 수있다.
- 유동 세포 계측법에 대한부터 ASC의 준비 : 이전분석, 다음으로 구성된 유동 세포 계측법 버퍼 (FCB)을 준비한다 : 1.0 %의 BSA, 2.0 %의 FBS 및 1X PBS에서 제조 0.025 %의 사포닌을.
- 부터 ASC 수확 펠릿을 생산하기 위해 1,200 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기.
- 멸균 1XPBS로 세포를 재현 탁하고 혈구를 사용하여 세포를 센다. 현탁액의 세포 밀도를 결정합니다.
- 펠렛 총 원심 분리기 5 × 10 5 세포의 분취에 서스펜션을 나눈다.
- PBS의 상층 액을 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올의 과잉으로 -20 ° C에서 60 분 동안 세포를 고정합니다. 필요한 경우에 필요할 때까지,이 세포는 20 ° C 냉동실이 70 % 에탄올에 저장 될 수있다.
- 고정 후, 조심스럽게 에탄올을 대기음 부드럽게 FCB의 과잉으로 펠릿을 두 번 씻는다. 씻어 :
- FCB의 과잉을 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁.
- 세포를 수집하는 1,200 XG에서 5 분 동안 원심 분리SA 펠렛.
- 조심스럽게 FCB 뜨는을 대기음.
- 반복합니다.
- FCB 100 ㎕를 각각 나누어지는 및 재현 탁에서 최종 FCB 세척 뜨는을 제거합니다. 제조업체의 권장 희석을 사용하여 원하는 형광 색소 - 복합 일차 항체를 추가합니다. 30 분에 대한 항체와 얼음에 세포를 품어.
참고 : 형광 색소 공역 일차 항체를 사용할 수없는 경우, 비 공역 일차 항체가 사용될 수있다. - (예, FITC, PE)에 사용되는 각 형광 색소의 경우, 음성 대조군으로서 이소 타입 정합을 IgG를 함유하는 100 ㎖의 FCB와 세포의 분취 액을 배양한다.
- 추가 컨트롤로 더 항체를 포함하지 않는 100 ㎖의 FCB 한 나누어지는 알을 품다.
- 단계 4.1.5에 설명 된대로 FCB와 셀의 각 나누어지는 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, FCB 100 ㎖의 분액을 재현 탁 및 흐름 분석을 진행합니다.
참고 : 비공 차 항체가 사용 된 경우 : FCB 제조업체의 권장 희석을 사용하여 적절한 형광 색소 - 복합 이차 항체와 보충과 함께이 세척 단계는 20 분 동안 얼음에 분주을 품어 다음과 같습니다. 단계 4.1.5에 설명 된대로 두 번 씻으십시오.
- 부터 ASC 분석 교류 : 유동 분석을 위해, 10,000의 최소값은 계산되어야한다. 흠과 이소 - 대조군 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC)에 의해 게이트를 설정하는 데 사용되어야한다. 이 경우, 단계 4.1.8의 더 항체 컨트롤 (즉, 흠)는 파편과 죽은부터 ASC를 제거하기 위해 사용 될 수 없습니다. 단계 4.1.7의 이소 일치 IgG를 제어합니다. 양의 형광 영역을 설정하기 위해 사용되어야한다.
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Representative Results
프로토콜의 개요는 위의 큰 볼륨 lipoaspirate 샘플에서 SVF의 분리에 대한 설명서, 효소 방법에 대해 설명합니다. 이 SVF 내에서 ASC 등 다양한 세포 집단이 있습니다. 많은 연구는 표준 조직 배양 조건이 SVF를 배양하는 ASC 형식으로 주로 구성 될 가능성이 접착 섬유 아세포 인구 선택 것이라고 제안한다. 이과 일치, 우리는 배양 SVF 펠릿의 주요 오염 세포 유형, 즉 적혈구, 평활근 세포와 내피 계통 (1)의 세포의 본질적 될 것을, 유동 세포 계측법 및 면역 형광 사용하여 보여 주었다. 그 결과 ASC 인구는 (그림 2) 상대적으로 외관 동질 및 섬유 아세포와 같은 세포로 구성되어 있습니다. 이 자기편부터 ASC 표준 조직 배양 조건에서 배양에서 잘 성장하고 수많은 분자 및 세포 B에 적합하다 시간 1을 두 배로 적당한 인구를 전시생체 내 시험 관내 및 재생 연구에 iology 연구. 그러나 고립 된 SVF의 이질적인 성격에 비추어, ASC 인구의 확인이 필요합니다. 수많은 연구는 체외 생체 ~ 9의 두 가지 셀을 식별하는 잠재적 인 수단으로 교양부터 ASC의 CD 항원 프로파일을 특성화하기 위해 유량 계측법 이용했습니다. Table 1은이 연구의 많은에서 결과를 요약. 이 CD 항원의 일부 표현이 논란이 남아 있지만, 일반적 배양부터 ASC는 CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d의 발현을 측정, CD54, CD90과 긍정적 CD140a 것을 동의합니다. CD34 같은 구체적인 조혈 마커의 발현이 시간에 해결되지 않지만 예컨대 CD31 및 CD45와 같은 수많은 조혈 CD 항원의 부재는, 중배엽부터 ASC의 원점과 일치한다. 최근 ASC 항원 프로파일, 유동 세포 계측법에 의해 결정되는 특정 subpop을 위해 선택하는 데 사용되었습니다같은 법규 강화 차별화 용량으로부터 ASC를 생산하는 희망의 10-12.
중배엽, 외배엽과 내배엽 계통으로 분화에 정의 된 배양 조건의 결과를 사용하여 ASC 인구의 체외 유도 유효성 검사의 가장 인기있는 수단으로 (그림 2) (검토를 위해 4 참조). 체외 트라이 배아 층 전위가 골 형성에 회생 모델 시스템, 분화의 광범위한부터 ASC의 사용을 초래하였으나, 지방 형성 및 연골 세포는 ASC를 식별하고 그것의 다 능성을 확인하는 것이 일반적으로 충분하다. 우리 손에, 오일 레드 O 5를 사용하여 얼룩 밝은 지질 액포를 포함하는 세포에서부터 ASC 결과의 지방 형성 차별화. 골 형성 분화 알칼리 포스파타제 양성 세포의 결과와 인산 칼슘 폰 Kossa 스테인 5를 사용하여 얼룩 세포 미네랄 축적.고밀도 micromass 조건에서 연골 세포로 분화 (알 시안 블루 염색을 이용하여 검출) 황산 프로테오글리칸을 포함하고 콜라겐 타입 5를 표현 펠릿을 생산하고 있습니다. 골격근 및 평활근 분화 모두 골격 근육 마이 오신과 MyoD1 평활근 액틴 5, 13, 14에 염색부터 ASC로 볼 수 있습니다. 외배엽 계통으로의 분화를 유도부터 ASC 및 노이 앤, 신경 세포 전사 인자 5의 등 다양한 신경 세포 마커의 발현에 의한 신경 세포와 같은 형태의 가정을 제안한다. 마지막으로, 세포의 설립 조건 (15) 결과에 따라 간 / 내배엽 계통쪽으로부터 ASC를 유도하는 식의 알파 태아 단백, 간 간세포의 잘 알려진 마커. 함께 지난 10 년 동안 출판 된 수많은 다른 사람들과 이러한 마커는 강하게 ASC 쉽게 관리 할 수있는 다 능성 줄기 세포 인구와 제안체외에서 전파와 세 개의 배아 생식 계통의 세포를 향해 유도. 생체 내에서의 재생 가능성 (검토를 위해 4 참조)에 결합, ASC는 재생 연구하는 과학자 또는 임상의 도구에 강력한 보탬이 될 수 있습니다.
그림 1. lipoaspirate 샘플에서 인간부터 ASC의 수동, 효소 격리. 격리를위한 A. 준비 : 이전에 격리에 다음과 같은 구성 요소가 준비되어야한다 : 1) () 칼슘 또는 마그네슘없이 PBS를 1 배 고압 증기 멸균을 통해 살균, 2) 1X PBS에서 제조 및 살균 0.075-0.1 % 콜라게나 제 타입 IA의 솔루션 0.22 μm의 필터 장치를 이용하여 여과를 통해, AS의 3) ASC 인구의 후속 문화에 대한 제어 보통 (CM). B. 격리CS는 : lipoaspirates의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리를위한 단계별 가이드가 표시됩니다. 단계 멸균 1X PBS와 lipoaspirate의 세척을 포함, 콜라게나 유형 IA, 원심 분리하여 SVF의 수집 및 SVF 여과를 사용하여 소화. SVF의 연속 배양은 ASC 인구를 포함하는 접착 섬유 아세포의 인구가 발생합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 부착 ASC 인구의 멀티 혈통 분화 가능성. 배양 SVF 세포 부착, 섬유 모세포부터 ASC의 상대적으로 동질적인 집단에서 발생합니다. 지방 형성, 골 세포, 연골 세포, 골격 근육 조직과 부드러운 근육 조직 계통의 세포에 정의 된 조건의 결과에 따라 ASC 인구의 유도.또한,부터 ASC는 노이 앤, 신경 세포의 마커 및 알파 태아 단백 (AFP) 내배엽 / 간 세포 계보의 설립 마커를 표현, 외배엽 계통의 세포로 분화 할 수있다. 일부 조직학 및 면역 형광 이미지는 이전에 발행 된 결과 1,5,6,7,8,9에서 가져옵니다. 함께 조직 학적, immunohistologic 형광 얼룩 차별화 계보가 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 발현 양상 | ||
| 긍정적 인 표현 | 부정적인 표현 | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d의 발현을 측정, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b를,의 CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| 부터 ASC의 제안 표현형 (2 개 이상의 연구 간의 공통) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d의 발현을 측정, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b를,의 CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| 부터 ASC 논란 마커 (여러 연구를 통해 차등 결과) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| 기질 CELL 마커 | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| 조혈 마커 | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| 굵게 표시된 2 또는 더 많은 연구 사이에 공통점 마커 SMA는 = 평활근 액틴 HLA = 인간 백혈구 항원 ABCG2 = 다중 약물 수송 단백질 G2 | ||
표 1. 인간부터 ASC의 세포 표면 발현 프로파일.
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Discussion
부터 ASC의 절연을위한 지방 조직은 여러 가지 형태가 있습니다 : 주사기 추출 또는 흡입 보조 lipoplasty (즉, 지방 흡입) 중 하나를 통해 얻은 작은 조각으로 절제 또는 lipoplasty을 통해 얻은 조직의 단단한 조각에서. 충돌하는 연구는 16, 17를 제시 한 것처럼 더 SVF 세포 (이에부터 ASC)가 절제된 또는 흡입 지방 샘플에서 얻을 수 있는지 여부는 불분명하다. 그것은 지방 조직의 형태 중 하나는 한 운전자가 자신의 분리 기술에 실력으로 SVF 세포부터 ASC의 분리에 적합한보다 더 많은 것을 할 수있다. 그러나, 지방 흡입이 점에서 절제를 통해 이점을 보유하고 있는가 덜 침습적이며, 훨씬 적은 수술 치료가 필요합니다. 지방 흡입술의 유형과 같은 기술을 포함하여, 지난 십년 동안 증가하고 있지만, 초음파를 이용한 전력 보조 레이저를 이용한 지방 흡입 (18)은, 가장 일반적인 부어 오르는 지방 흡입 유지하는 지방 구획 (19)을 열망하기 전에 멸균 식염수, 마취제와 혈관 수 축제의 많은 양의 홍수입니다. 기술의 선택은 외과에서 외과 의사에 따라 다를 수 있습니다. 추출 수단은 연구원에 중요 보이지만 그러나, 기술은 ASC 번호 및 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 예를 들어, 증가 지방 흡입 진공 압력에 부정적인 SVF 세포 수율 (20)에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, ASC 증식의 감소는 초음파를 이용한 지방 흡입 17에 측정되었다.
저장 온도는 SVF 생존과 최종 ASC 수율에 영향을 미칠 수 그러나 얻은 대기음 신속하게 처리해야한다. 마츠모토 등. 연구에 의하면이 대기음이보다 긴 24 시간 21 상온에서 저장되어있는 경우 ASC 수율이 감소하는 것으로 나타났습니다. 필요한 경우, 4 ° C에서 24 시간 저장은 해로운 효과없이 사용할 수있다이 저장 시간이 그 시점 이상으로 증가되는 경우 ASC 인구의 생물학적 특성에 관련된하지만, 다시, 세포 생존 능력이 감소 할 수 있습니다. lipoaspirate 가공의 용이성은 직접 전체적인 부피와 관련된다. 주사 추출을 통해 얻어진 작아 볼륨은, 가공이 비교적 용이하다. 그러나 지방 흡입을 통해 얻은 큰 볼륨 흡인은 실제 도전을 제시 할 수 있습니다. 대기음 볼륨이 크면 예를 들어, 세척 할 수 있도록 흡입 용기로부터 지방을 전사 같은 간단한 문제를 제시 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 이러한 문제 중 일부를 완화하기위한 것입니다.
전반적으로,이 문서에서 설명하는 효소의 방법을 사용하여 lipoaspirates에서 ASC 인구의 분리는 지난 10 년 동안 크게 변경되지 않았습니다. lipoaspirates에서부터 ASC의 격리 자신의 설명에 우수 PubMed를 통해 사용할 수있는 다수의 프로토콜이 있습니다. 엠그 중 ost는 약간의 수정과 매우 유사한 프로토콜을 설명합니다. 기본적으로, lipoaspirate는 오염 물질의 세척, ASC 인구를 포함, SVF와 SVF를 해제하는 효소 분해, 원심 분리를 통해 수집된다. 대부분의 큰 볼륨 lipoaspirates는 진공 용기의 일부 유형에 도착 -의 구성은 외과에서 외과 의사에 따라 다를 수 있습니다. 제대로 바이오 안전성 후드에 배치하기 전에 청소를하지 않을 경우 컨테이너 자체가 오염의 원인이 될 수 있기 때문에이 프로토콜은, 세척하기 전에 큰 멸균 비이커에 대기음의 제거를 권장합니다. 성숙한 지방 세포의 용해, 중간 지방 층과 식염수 및 적혈구 오염의 하부층의 결과 베스트, 유층 일단 전사 및 중력 침강, 흡 인물은 세 개의 층으로 분리된다. 우리가 그 결과 세포 배양 (게시되지 않은 관찰)에 독성이있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다과 오일 층이 제거되어야한다. 또한이 프로토COL은 생리 식염수와 적혈구의 infranatant 이전부터 ASC가 배양되면 적혈구 오염의 잠재적 인 수를 감소하기 위해 처음 세탁을 제거 할 것을 권장합니다. 그러나 프란시스 등.의 연구는이 infranatant도부터 ASC (22)의 원천이 될 수 있다는 것을 제안했다. 10 ㎖ 혈청 피펫의 사용이 infranatant의 제거가 상대적으로 쉽습니다. 남는 것은 다음 쉽게 멸균 PBS를 사용하여 세정하거나, 필요한 경우, 멸균 PBS 23-25 오염의 가능성을 줄이기 위하여 항생제 및 항진균제로 보충 될 수 지방층이다. 세탁 후, 지방 조직은 효소 콜라게나 형식 IA의 살균 용액을 사용하여 소화한다. 이러한 동영상에 도시 밀리 포어 부로서 여과 장치의 사용은 무균 세척하고 지방 조직이 37 ℃에서 후속 수조 소화를 위해 첨가 될 수있는 밀폐 용기에 콜라게나 제를 필터링하는 편리한 수단을 결합한
사용 콜라게나 제의 유형은 콜라 형 IA 25, 24, 1 더욱 확산 될 수 겉으로으로 그룹에 그룹에서 변화하고있다. 그러나, 상업적으로 콜라게나 제의 11 개 이상의 서로 다른 종류의 제공, 특정 조직에 대한 소화 친화 각이있다. 지방 조직의 분해를 들어, 시그마 알드리치와 같은 회사는 콜라게나 유형 I 및 II를 추천하고 두 가지 유형이 아니라 오늘날의 문학 1, 24 ~ 27으로 표시됩니다. 원래 기사에서는 ZUK 등은. 0.075 % 1의 농도로 소 매체에서 콜라게나 유형 IA를 사용합니다. 그러나, 콜라게나 형식 IA의 대부분의 상용 소스는 이제 혐기성 박테리아 클로 스트 리듐 histolyticum 또는 E.에서 얻을 수 있습니다 대장균 유전자 C.로 수정 유전자를 histolyticum. 많은 기업들이 원유에서 황산 암모늄 침전으로 제조 된 것과 콜라게나 형식 IA의 수많은 준비를 제안한다.이 조브 문서에서 설명하는 프로토콜은 원유 유형뿐만 아니라 콜라게나 활동을 포함 IA 콜라게나 제의 준비뿐만 아니라 비 특정 단백질 분해 효소, clostripain 및 트립신 효소 활동을 사용합니다. 이러한 추가 효소가 소화 효율 28에 중요하지만, 거기에 원유 콜라게나 유형 IA 28, 29과 관련된 많은 가변성을 많이보고들이다 효율적인 소화 23을 얻기 위해 0.2 %까지 콜라게나 자신의 농도를 증가시킨다. 조질 콜라게나 분류 IA를 사용하는 그룹은 효소의 성능을 개선하고 지방 매트릭스 내 세포의 안정성을 증가시키기 위해 소 혈청 알부민 (0.1 ~ 1.0 %의 BSA)과의 보완을 추천한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 소화 효율에 불리한 효과를 보완하지 않고 콜라게나 제를 사용 그러나, 이것은 필요하지 않을 수 있습니다.
이상의 정의 된 콜라게나 샘플을 사용하고자하는 사람들을 위해osition는 단백질 분해 효소의 정확한 조화와 함께 고순도 콜라게나 제를 포함하는 상용 소스를 사용할 수 있습니다. 이 제제는 클로스 트리 디움 콜라게나 유형 I 및 II 높은 활동과 같은 디스 파제와 서모으로 알려진 중성 프로테아제의 활동,와 조합을 정화. 콜라와 서모를 사용하여 효율적인 지방 소화 자카 등. (27)에 의해보고되었다. 이 작품과 일치, Pilgaard 등. (30)는 콜라와 서모 여러 혼합을 사용하여 뛰어난 소화 효율을보고합니다. 그러나, 그들은 콜라게나 제와 디스 파제의 준비를 사용하여 더 나은 소화 효율을 관찰 않습니다.
지방 조직에서 세포의 분리를위한 소화 시간이 연구에서 연구 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 발표 된 많은 프로토콜은 1 ~ 2 시간 27, 30의 소화 시간을 권장합니다. 그러나, 과도한 분해 시간은 궁극적 가능한 AS의 개수에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다CS 자신의 줄기 세포 표현형. Pilgaard와 동료는 37 ° C에서 2 시간의 소화는 소화, 과거 45 분을 소화으로, 매 15 분까지 2 시간의 최대 값을 관찰 할 것을 추천. 자카 등으로, 조직 분리 및 ASC 기능 (30) 사이의 최적의 균형을 제공하는 것을 확인할 지방 조직은보다 균일 한 모양 (27)을 취하면 정지된다. 우리는이 의견에 동의합니다. 그러나, 0.075-0.1 % 많아야 콜라게나 분류 IA 제제는 30-45 분에 lipoaspirates 대량의 소화 능력이 이들 배 세포의 충분한 수를 해방하기에 적절 있다는 것이 우리의 경험이다. 따라서,이 프로토콜은 30 분의 소화 시간을 권장합니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 lipoaspirate의 일관성을 모니터링해야하고 lipoaspirate은 "크림"또는 "짙은"모양 (도 1)를 가정하면 소화 멈췄다.
일 회전자 소화 발표 SVF의 분리가 단순히 원심 분리를 사용하여 수행, 완료됩니다. 그러나, 흡인 압력처럼, 원심 분리의 실제 효과는 SVF 생존과 문화에 사용할 수부터 ASC의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 쿠 리타와 동료 (31)의 연구에 3,000 XG를 초과하는 속도는 ASC를 손상시킬 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 속도는 SVF의 적절한 펠렛을 보장 할만큼 중요 할 수 있어야합니다. 일반적으로,이 하나를 포함하여 대부분의 프로토콜은 1,200-1,500 × g으로의 원심 분리 속도를 권장합니다. 케어는 관계가 특정 원심 분리기 회 전자에 의존 한대로, 원심력 (G 측정) 및 (분당 회전 수로 측정) 원심 분리 속도 사이의 관계를 이해하기 위해 연구자가주의해야한다. 그러나, 원칙적으로, 예컨대 1200 XG 저급 원심력 종종 원심 분리 속도에 상당하고 안전하게 상호 교환 적으로 사용될 수있다.
다음 회전, 여러 디오일 및 "무성"백색 지방 세포, 중간 콜라게나 층과 세포 펠렛의 상부층 : stinct 층을 원심 분리 튜브 (도 1)에서 관찰된다. 부터 ASC를 포함하는, 적혈구의 상부 층과 하부 백색 SVF 펠릿 : 펠릿 자체는 두 개의 별개의 층을 가질 수있다. 오일이 세포 배양에 독성이있을 수 있으며, 지방 세포가 다시 원시적 인 세포 유형 32 탈분화 할 수있는 것으로 표시되었습니다으로이 프로토콜은, 석유와 지방 세포의주의 열망을 권장합니다. 그러나 이러한 지방 세포는 필요한 경우이 시점에서 수확 할 수있다. 때문에 이러한 오염 물질이 프로토콜은 적절한 제거를 보장하기 위해 별도의 세척 단계를 권장합니다. 이 단계는 연구자가 여과 이후의 편의를 위해 여러 SVF 알약을 결합 할 수 있습니다. 여과에 의한 섬유 성 물질의 큰 조각 소화 다음 세포 응집체의 존재를 필요가있을 가능성이 높다. 이러한 자료는 쉽게 제거된다70 또는 100 μm의 메쉬 필터를 통해 간단한 중력 기반 여과를 통해. 여액의 분취 원한다면 유핵 세포의 수와 ASC 부착 및 확장 도금 남은 여액을 계산하기 위해 취해질 수있다.
가능한 한 많은 적혈구를 제거하는 근면 한 시도에도 불구하고, 더 ASC 준비 RBC 오염없이 완전히되지 않습니다. 우리의 원래 기사에서는, 우리는 160 밀리미터 NH 4 망할 CIA의 저장성 용액에 펠릿의 재 부유를 통해 이러한 적혈구의 제거를 제안했다. 이후 격리 기사의 대부분은이 단계를 포함 손질 멸균 물을 사용하는 경우주의해야하지만 SVF 세포가 노출되는 시간을 최소화하기 위해, NH 4 CL-기반 솔루션 또는 멸균 22 ~ 24, 27, 33의 사용을 권장 저장성 용액 27. 적혈구는 비 부착 세포 집단이며 쉽게의 하룻밤 배양 다음 제거 될 수있다 그러나,이 단계는 필요하지 않을 수도ASC 인구. 기껏 일화 동안 또한, 이러한 적혈구는 결과 자기편 세포 (ZUK, 게시되지 않은 관찰)의 초기 확장을 개선하기 위해 나타납니다. 이와 같이,이 프로토콜은 RBC 용해 단계를 제거하고 초기 ASC 배양은 배양 배지의 변경없이 제 3 ~ 4 일이 적혈구의 존재 하에서 확장하도록 허용 할 것을 제안한다. 이 관찰에 대한 이유는 혈액 세포를 오염시키는 주변 분비 신호의 일부 유형에 의한 수 있거나 단순히 인해 RBC 용해 공정의 배제와보다 나은 생존 능력 일 수있다. 이 후, 온화 멸균 1X PBS로 플레이트를 세척하여 배양 배지를 흡인 할 수 있고, 적혈구의 대부분이 제거. 시간이 지남에 따라, 남아있는 적혈구는 결국 죽게되고 문화에서 제거 될 수있다.
자카와 Boquest에 의한 연구는 재 부유 SVF 펠렛 25-50 %의 조직 문화에 플라스틱 23, 27를 준수 것으로 추정했다. 그 결과 "통로 0"ASC 세제곱ltures 기원에서 내피로 제안부터 ASC 더 불규칙한 모양의 세포로 생각 작고 둥근 세포로 구성된 이기종입니다. 우리 등 많은 연구 그룹에 의해 그러한 SMCS, 조혈 세포 및 ASC 배양 한 섬유 아세포 등의 세포 유형을 오염의 부재를 확인하는 동안, 부가적인 세포 유형의 존재를 배제 할 수 없다. . 사실, Tallone는 등 통로 0 문화를 특징으로하고 뚜렷한 인구 관찰 : 1) 작고 둥근 빠르게 갱신 세포를, 2) ASC 것으로 생각 스핀들 모양의 섬유 아세포의 세포는, 3) 천천히 대형 세포를 복제하는 것은 더욱 제한 가능성 (즉, 사전에 지방 세포) 및 통로 (34)와 함께 손실됩니다 4) 입방 내피 세포. 후속 연구는 라운드 빠르게 경신 세포 집단이 높은 multipotentiality을 가지고 있다는 것을 보여 전형적인 줄기 세포 마커 (35, 36)을 표현 하였다. 또한, 그들은 인해 "상체"를 형성 할 수있다자신의 빠른 증식과 자주 스핀들 모양의 섬유 아 세포에 의해 둘러싸여있다. 따라서, 그것은 위의 제안 스핀들 모양의 ASC 인구가 이들 세포에서 발생한 수있다. 이러한 통로 0 ASC 문화의 초기 확장에 따라, 그것은 결과 문화가 더 섬유 아세포, 균일 한 성분을 가정으로, 시간이 지남에 따라 계속 배양은 ASC를위한 선택이라고 생각합니다. 그러나, 오염 세포의 잔재가 완전히 따라서 ASC 인구는 여전히 이질적인 고려되어야한다, 배제 할 수 없습니다.
이 문서에서 설명하는 프로토콜은 저렴하고 간단하며 일반적으로 조직 문화 시설에없는 장비의 조각을 필요로하지 않지만, 이러한 시설을 필요로하는 단점을 가지고있다. 많은 연구가 동물 모델을 통해부터 ASC의 번역 응용 프로그램을 조사하고 ASC를 사용하여 임상 연구가 나타나기 시작했다 (검토를 위해 4 참조
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Disclosures
이 논문의 저자는 캘리포니아 대학의 리젠트과 Cytori 치료학 허가가 소유 한 특허의 공동 발명자이다.
Acknowledgments
저자는 인정하고자하는 등 기술 된 프로토콜 및부터 ASC의 그 분리의 발전에 기여하는 추가 연구 인력 감사 : 박사 H. 피터 로렌스, MD, 박사 히로시 Muzuno, MD, 박사 제리 황, MD를 박사 아담 카츠, MD, 박사 윌리엄 푸트 렐, MD, 박사 룽 장, DDS, 박사, 박사 라리사로드 리 게스, MD, 박사 제니 알폰소, 박사, 박사 존 프레이저, 박사. 발표 결과는 NIAMS와 NIDCR 연구소를 포함하여 건강의 국립 연구소에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
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