Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50585
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 3,5
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

Abstract

2001 yılında, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, araştırmacılar başlangıçta İşlenmiş Lipoaspirate Hücreleri veya PLA hücreleri adı liposuctioned adipoz dokudan erişkin kök hücrelerinin yeni bir nüfus izolasyonunu nitelendirdi. O zamandan beri, bu kök hücreler Yağ elde edilen kök hücreler ya da TSK olarak yeniden adlandırılmış ve kök hücre araştırma ve rejeneratif tıp alanında en popüler yetişkin kök hücreler nüfus biri olmaya gitti. Binlerce makale artık kemik rejenerasyonu, periferik sinir onarımı ve kardiyovasküler mühendisliği de dahil olmak üzere, rejeneratif hayvan modellerinde çeşitli TSK kullanımını tarif eder. Yeni makaleler klinikte TSK için kullandığı sayısız tarif başladı. Bu makalede gösterilen protokol elle ve enzimatik kozmetik işlemler elde lipoaspirates büyük miktarda gelen TSK izole etmek için temel prosedür özetliyor. Bu protokol kolayca ölçekli veya accommod aşağı olabilirlipoaspirate hacmini yedi ve abdominoplasties ve benzer prosedürler ile elde edilen yağ dokusundan TSK ve izole etmek için uyarlanabilir.

Introduction

2001 yılında, adipoz dokusundan multipotent kök hücrelerin farazi bir nüfus dergisinde Tissue Engineering 1 'de tarif edilmiştir. Bu hücreler kozmetik cerrahi yoluyla elde edilen işlenmiş lipoaspirate dokudan kendi türetme nedeniyle adı İşlenmiş Lipoaspirate ya da PLA hücreleri verildi. Bu makalede açıklanan izolasyon yöntemi yağ dokusu 2 stromal damar fraksiyon (SVF) izolasyonu için mevcut enzimatik stratejiler dayanıyordu. SVF, bir doku kültürü alt-tabaka 2, 3 uymak için henüz kırmızı kan hücreleri, fibroblastlar, endotelial hücreler, yumuşak kas hücreleri, perisitler ve ön adipositlerin minimal işleme nüfus olarak tanımlanmıştır. Zaman içinde bu SVF ekimi, bu kirletici hücre popülasyonlarının çok ortadan kaldırmak ve bir yapışkan, fibroblastik nüfus neden önerilmiştir. Bu fibroblastlar ön-varlık olarak son 40 yıldır literatürde tespit edilmiştiradipositleri. Ancak, araştırma grubu, bu hücrelerin mezodermal multipotency sahipti ve PLA hücreleri gibi yapışık SVF nüfusu adını gösterdi. Çok sayıda diğer araştırma grupları tarafından daha sonraki çalışmalar (yorum 4 görmek için) Endodermal ve ektodermal potansiyellerini hem düşündüren, bu potansiyeli ekledik. O zamandan beri, bu hücreler için çok sayıda ek şartlar literatürde ortaya çıktı. Uzlaşma çeşit sağlamak amacıyla, vadeli Yağ türetilmiş Kök Hücreler veya TSK 2. yıllık IFATS toplantısında kabul edildi. Bu nedenle, bu terim ASC bu makalede kullanılacaktır.

Bu makalede açıklanan protokol standart laboratuar ekipmanı gerektirir ve bu fosfo-tamponlu tuz çözeltisi, standart doku kültür ortamı reaktifler ve kolajenaz gibi basit bir reaktif kullanan bir nispeten basit bir işlemdir. Bu yağ dokusu hacim ve daha sonra c başlangıç ​​miktarına bağlı olarak TSK çok sayıda üretebilirulture zaman. Ancak, yağ dokusu gibi bir büyük miktarda işlem bu protokolü kullanarak bir dereceye kadar azaltılabilir bazı fiziksel sorunlar ortaya çıkabilir. Ayrıca, bu protokol bu şekilde onaylı bir doku kültürü imkan kullanımını gerektiren, steril doku kültürü tesisleri ve onaylanmış biyo-güvenlik davlumbaz gerektirir. Bunlar iyi üretim uygulamaları klinik kullanım için izolasyonu ve genleşme için tasarlanmış (GMP) onaylı tesisleri izole sürece Bu gereksinim, klinik uygulamalarda ASC nüfusun yarar azaltabilir. Alternatif olarak, işletme tiyatro, kapalı bir sistem içinde TSK ayırabilirsiniz otomatik sistemler bu tuş sorunu önleyeceğini ve sonraki in vitro genişlemesi için herhangi bir ihtiyaç olmaksızın TSK hemen kullanımı için izin verir. Bugüne kadar, insan dokusundan hücrelerinin izole edilmesi için ticari olarak temin edilen altı otomatik sistemleri vardır. Bu sistemler sayesinde izole etmek için yapabilirderhal hasadından sonra adipoz doku büyük miktarda gelen TSK önemli sayıda. Bunlar TSK her zamankinden çalışma odasını terk etmek zorunda hasta olmadan rejeneratif çeşitli amaçlar için hastaya geri olabilir. TSK manuel izole açıklayan bu protokol ek olarak, Celution Sistemi kullanılarak TSK otomatik izolasyonu için protokol, eşlik eden bir makalede verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada gösterilen protokol enzimatik sindirim ve diferansiyel santrifüj kullanılarak kozmetik prosedürler ile elde lipoaspirates gelen TSK manuel izole edilmesini tarif etmektedir. Bu protokol ilk olarak 2001 1'de dergi Doku Mühendisliği yayımlandı nerede çıkan hücreler nedeniyle lipoaspirates kendi tecrit İşlenmiş Lipoaspirate Hücreleri veya PLA hücreleri çağrıldı. Bununla birlikte, terim PLA hücre artık terimi Yağ türetilmiş Kök Hücreler veya saha isimlendirme açısından uygunluk çeşit vermek TSK ile değiştirilmiştir. Bu protokol ile izole hücreler (inceleme için bkz: 4) in vitro ve in vivo olarak mezodermal potansiyele sahip olduğu birçok kişi tarafından gösterilmiştir. Buna ek olarak, ASC ektodermal ve Endodermal potansiyelleri de 4 araştırılmıştır. Izolasyon tekniği basit ve kolaydır ve tamamlamak için yaklaşık bir saat gerektirir. Elde edilen hücres, standart doku kültür koşulları altında kültürlenir. Kültür Zamanla, ASC nüfusu daha homojen kolay genişletmek ve kültür uzun vadede iyi canlılığı göstermek fibroblastik hücrelerden oluşan olur.

Not: Gerekli olan ekipman aşağıdaki parçaları, bu makalenin sonunda listelenmiştir. Tüm cam, medya ve reaktifler otoklav yoluyla sterilize veya 0.22 mikron filtreler aracılığıyla filtre edilmelidir. Aseptik doku kültürü teknikleri her zaman takip edilmelidir. Bunu sağlamak için, biyo-güvenlik kabini içine yerleştirilmiştir tüm malzeme,% 70 etanol çözeltisi ile püskürtme ve temiz bir kağıt havlu ile silinerek sterilize edilmelidir.

1.. Hasattan önce, ardından hazırlayın:

  1. Lipoaspirates yıkama için steril 1X fosfo-tamponlu tuzlu su (PBS). Lipoaspirate her 100 ml için 1 x PBS içinde yaklaşık olarak 1 L hazırlayın. PBS ve otoklavkullanmadan önce oda sıcaklığına soğumaya ow. Bir seçenek olarak, antibiyotik / antimikotik lik bir son konsantrasyona kadar ilave edilebilir: 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2.50 ug / ml amfoterisin B PBS soğuduktan sonra.
  2. Lipoaspirate enzimatik sindirim için (Clostridium histolyticum'dan) Steril 0,075-0,1% kollajenaz tip IA. Arıtılmış, yani ham vs - Konsantrasyon kolajenaz kalitesine ve kaynak bağlıdır. Diğer kolajenaz türleri (örneğin kollajen tip II ya da IV) 'e benzer konsantrasyonlarda kullanılabilmektedir. 0.22 um bir filtre ile bir 1.000 ml filtreleme sistemi (Şekil 1 A) kullanılarak 1 x PBS ve steril filtre hazırlayın. Bununla birlikte, şişe üst filtre takılmış steril cam şişeler de kullanılabilir. Hazırlamak ve oda sıcaklığında kullanın. Kadar gerekli Kolajenaz çözümleri 4 ° C'de kısa süreli saklanabilir. Onun aktivitesini azaltmak olabilir kollajenaz çözüm donma yok.
  3. Kolajenaz inaktivasyonu ve ASC nüfusun kültür için steril kontrol ortamı (CM). CM 500 ml için, kombine aşağıdaki gibidir: 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 5 ml penisilin / streptomisin (10,000 IU penisilin, 10,000 ug / ml 500 ml DMEM (L-glutamin ile 4.5 g / L glukoz,), streptomisin). Bir seçenek olarak, 5 ml amfoterisin B (250 ug / ml amfoterisin B) de ilave edilebilir. Steril olmayan reaktifler kullanılır, bu ortamın steril filtrasyon gereklidir. Orta ısıtmak için kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu, 30 dakika içinde CM yerleştirin.
  4. Izolasyon için steril cam ve plasticware. 1000 ml'lik bir cam beher otoklav ve kullanılmadan önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Buna ek olarak, aşağıdaki plasticware hazır: aseptik serolojik pipetler (5 mi, 10 ml ve 25 mi), 50 ml santrifüj tüplerine ve doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kaplarına.

2. L TSK İzolasyonuipoaspirates

En lipoaspirates bir aspirasyon kabın (Şekil 1B'ye bakınız) toplanır ve üç ayrı tabakadan oluşmaktadır edilebilir: dolayı olgun adipositlerin lizis petrol 1) bir üst tabaka, yağ dokusunun 2), bir orta tabaka, ve 3) bir alt, sıvı infranatan tuzlu su ihtiva eden ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) gibi hücre tipleri kirletici. Üst yağ tabakası önemli miktarlarda mevcut olmayabilir. Mevcut olduğu takdirde, elde edilen ASC kültürün yağ kirlenmesi kültürünün canlılığı etkileyebilir gibi, aspire edilmelidir. Alt infranatan RBCs ile ASC kültürlerin kirlenmesini en aza indirmek için işlemeden önce çıkarılmalıdır. Bu daha sonra yıkanır ve enzimatik hücresel, stromal vasküler fraksiyonun (SVF) kurtarmak için sindirilmiş olacak orta, adipoz doku tabakası, bırakacaktır.

  1. Lipoaspirate Yıkama: doku kültürü h lipoaspirate kabı açınood ve dikkatli bir şekilde, steril 1 L cam behere lipoaspirate süzün. Adipoz doku tabakası da (Şekil 1 B) ayrılır kadar lipoaspirate tabakaları ayırmak için izin verin.
    1. 10 ml serolojik pipet kullanarak steril bir cam pipet ile, alt tuzlu infranatan kullanılarak yağ tabakasının (eğer varsa) aspire. Bu kırmızı kan hücreleri ve tuzlu su kirlenmesine büyük çoğunluğu kaldırmak olacaktır.
    2. Elde edilen yağ dokusu katmanının hacmi değerlendirmek ve eşit hacimde steril 1x PBS ilave edin. PBS ile lipoaspirate karıştırmak için aspirasyon için kullanılan bir pipet ile aspire karıştırın. Iki kat yerleşmek için izin verin. Yukarıda belirtildiği gibi, 1x PBS antibiyotik / antimikotik ile takviye edilebilir.
    3. 10 ml serolojik pipet kullanarak infranatan aspire.
    4. Adımda 2.1.2 'de belirtildiği gibi adipoz doku fraksiyonu yıkama devam edin. ve 2.1.3. yağ tabakası sarı / altın rengi alana kadar. Aspire incie cam beher içinde yağ dokusu fraksiyonun ayrılması, son bir kez infranatan. Infranatanların yeterli kaldırılmasını sağlamak için, lipoaspirate tabakalar Son yıkamadan sonra ve son aspirasyon önce 5 dakika için yerleşmesine izin.
  2. Lipoaspirate enzimatik sindirim: bir filtre ünitesi de, yukarıda belirtildiği gibi, steril kolajenaz 1A çözeltisi hazırlayın. Yağ fraksiyonu ve steril filtre eşit bir hacmini hazırlayın.
    1. Kolajenaz çözeltisi Süzüldükten sonra, üst filtre ünitesini atmak dikkatli bir kolajenaz çözeltisi içine yıkandı, yağ fraksiyonu dökün ve şişeyi sıkıca kapatın.
    2. Bir 37 ° C su banyosu içinde kolajenaz / yağ karışımı yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de özet. Yavaşça kollajenaz / yağ karışımını her 5-10 dk girdap ve su banyosunda geri yerleştirin. Adipoz doku tabakası "yumuşak" bir görünüm (Figür almalıdıre 1B) sindirim ilerledikçe. Adipoz doku tabakası hala içinde yağ katı parçaları var gibi görünüyor, ek sindirim süreleri (yani 2 saat kadar) kullanılabilir.
  3. TSK İzolasyonu: geri biyogüvenlik kabini içine yerleştirin sindirilmiş kollajenaz / yağ karışımı. Önceki kabinede geri yerleştirerek% 70 etanol ile filtre ünitesini sterilize etmek için emin olun.
    1. Pipet 25 ml steril bir 50 ml santrifüj tüplerine SVF içeren infranatanların alikotları.
    2. Her tüpe CM 25 ml ilave edilir. CM 5 dakika için kabininde oda sıcaklığında inkübe edilerek inaktive kolajenaz izin verin.
    3. Bir pelet gibi SVF toplamak için 1200 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Biyogüvenlik kabini, her tüpten aspire. (Üst yağ tabakası sağlamak ve herhangi bir kayan adipozitler bu yüzer ile aspire edilir
    5. 30 ml CM kullanılarak bir santrifüj tüpü içine SVF pelet birleştirin ve iki yeni bir 50 ml santrifüj tüplerine üzerinde eşit olarak bölünür. Adım 2.3.3 olarak santrifüj. ve (şekilde gösterilmemiş olan) iki SVF peletlerden süpernatantlar aspire.
      İSTEĞE BAĞLI: RBC parçalama arzu edilirse, bir RBC liziz tamponu (160 mM NH4CI), 10 ml her SVF pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Adım 2.3.3 olarak santrifüj. ve (şekilde gösterilmemiş olan) SVF granül elde etmek üzere üst fazlar aspire.
    6. 5-10 ml CM (Şekil 1B) kullanılarak yeni bir santrifüj tüpü içine, iki SVF granül birleştirin.
    7. Daha büyük partikülleri filtre doku için, yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne üstüne yerleştirilen bir 100 mikron gözenekli filtre üzerine yeniden süspansiyon haline SVF pelet pipet ve yerçekimi akışı ile filtre izin verir.
    8. Yeniden süspansiyon haline Pipet alikotları(Ve filtre) doku kültürü tedavi kültür yemekleri üzerine TSK içeren SVF pelet. CM uygun bir hacmi ile her yemeğin Supplement.
    9. Kültür, 37 ° C, ortam değişikliği olmadan% 5 CO2 3-4 gün boyunca CM hücreler.

Bu ilk kültür periyodu sonrasında, kültür ortamı aspire edilebilir ve herhangi bir kirletici kırmızı kan hücreleri yavaşça steril 1XPBS ile yıkanarak uzaklaştırılmıştır. CM ile değiştirin ve gerektiği gibi kültür TSK devam ediyor. Doku kültürü el çanak ve nasıl yeniden süspansiyon haline SVF topak bu yemekler arasında bölünür ve tip geleneksel doku kültürü, aşağıdaki arzu edilen hücre sayısına bağlıdır.

3. ASC Nüfus Karakterizasyonu: Sitometrisi ve multilineage Farklılaşma

Bir kez izole edilmiş, ASC nüfusun karakterizasyonu yapılmalıdır. Bunun için geleneksel yaklaşımlar akış sitokin içerirmetry hücrelerin hücre yüzeyi antijeni, CD profilini karakterize etmek için in vitro ve farklılaşmasında da multilineage farklılaşma kapasitesi teyit etmek için. Birden fazla soy TSK değerlendirilebilir birlikte, bu protokol multilineage mezodermal potansiyellerini teyit 5 bir aracı olarak adipogenic, osteojenik ve kondrojenik soy hücreleri içine TSK farklılaşmasını özetlenmektedir.

TSK vitro çoklu-soy Farklılaşma

  1. TSK osteojenik Farklılaşma aşağıdaki gibidir: Önceki indüksiyonuna, osteojenik Ortamını (OM) hazırlanması: DMEM, bir 500 ml şişe için, (4.5 g / ml glikoz) penisilin / streptomisin 25.0 FBS (% 5.0 son konsantrasyon) içinde ml ve 5.0 ml eklemek (10,000 IU / sırasıyla ml ve 10000 mg / ml nihai konsantrasyonlar). Deksametazon (0.1 uM nihai), L-askorbik asit 2-fosfat (50.0 uM nihai: Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki osteojenik indüksiyon maddeleri eklemek) Ve β-gliserofosfat (nihai 10.0 mM).
    1. Öncesinde, indüksiyon hasat ve yaklaşık% 50 bir katışma elde edilir ve böylece arzu edilen doku kültürü kabı içine kültürlü TSK plaka. Her deneysel yemeğin kaplama için, uyarılmamış kontrol için ilave bir çanak levha. CM Kültür gecede.
      Not:% 50 confluency bu indüksiyon boyunca oluşabilecek sürekli yayılması için izin vermek için önerilir
    2. Indüksiyon gününde, orta kaldırmak ve şunları ekleyin: kontrol oyuklarına istenen osteojenik deneysel kuyu ve CM OM. Kullanılan ortamın hacmi doku kültürü çanağı boyutuna bağlı olacaktır. 12 de yemekler için, oyuk başına ortam içinde 1.0 ml yeterlidir. 6 bölmeli tepsilerde için, oyuk başına 2.0 ml ortam yeterlidir. 100 mm yemekler için, çanak başına ortam içinde 10.0 ml kullanılmalıdır.
    3. Uygun ortam değişiklikleri her 3-4 ile 14 gün, en az Kültür hücrelergün. Yüksek osteojenik ASC popülasyonları gibi erken 7 gün indüksiyon gibi hücre dışı mineral birikimi belirtileri gösterebilir.
    4. Osteojenik farklılaşma (yani hücre dışı mineral birikimi) kalsiyum fosfat için bir von Kossa histolojik leke kullanılarak teyit edilebilir. Bu leke hücre dışı kalsiyum fosfat (Şekil 2 ye bakınız) varlığını belirleyen bir siyah-kahverengi bir çökelti üretecektir.
      Von Kossa bir reaktif ile leke için:
      1. Kontrol hücrelerinden deney hücrelerden OM ve CM kaldırma
      2. 1x PBS içinde hazırlanmış% 4.0 paraformaldehid içinde 60 dakika boyunca hücreleri saptamak.
      3. 1x PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
      4. 30 dakika boyunca karanlıkta (su içinde hazırlandı),% 2.0 gümüş nitrat ile hücreleri inkübe edin.
      5. Gümüş nitrat çıkarın, damıtılmış su ve hava ile kurumaya hücreleri ile iki kez yıkayın.
      6. CAL geliştirmek için 60 dakika boyunca UV ışığına hücreleri Açığakalsiyum veya magnezyum fosfat çökelti.
      7. 1XPBS ile hücreleri birkaç kez yıkayın.
      8. Arzu edildiği takdirde hematoksilin ile hücre Counterstain.
  1. TSK adipojenik Farklılaşması: Ön indüksiyon, aşağıdaki gibi adipojenik Ortamını (AM) hazırlanması: (4.5 g / ml glikoz) (% 10.0 nihai konsantrasyon) FBS 50.0 ml eklemek DMEM biri 500 ml şişe için, ve penisilin / streptomisin, 5.0 mi (10,000 IU / sırasıyla ml ve 10,000 ug / ml nihai konsantrasyonlar). -, Indometasin (nihai 0.2 mM) ve insülin (10.0 uM nihai deksametason (1.0 uM nihai), 3-izobutil-1-metilksantin (nihai 0.5 mM IBMX): Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki adipogenic indüksiyon maddeleri eklemek .)
    1. Öncesinde, indüksiyon hasat ve yaklaşık% 80 lik bir katışma elde edilir ve böylece arzu edilen doku kültürü kabı içine kültürlü TSK plaka. Her deneysel yemeğin kaplama için, bir ek plakaolmayan bir kaynaklı kontrolü için çanak al. . Kültür gecede CM Not: TSK adipogenic farklılaşma artan kaynaşması olan daha verimli olduğu görülmektedir.
    2. Indüksiyon gününde, orta kaldırmak ve şunları ekleyin: kontrol oyuklarına istenen osteojenik deneysel kuyu ve CM AM. Kullanılan ortamın hacmi doku kültürü çanağı boyutuna bağlı olacaktır. 12 de yemekler için, oyuk başına ortam 1.0.ml yeterlidir. 6 bölmeli tepsilerde için, oyuk başına 2.0 ml ortam yeterlidir. 100 mm yemekler için, çanak başına ortam içinde 10.0 ml kullanılmalıdır.
    3. Kültür uygun bir ortam değişiklikleri her 3-4 gün ile 14 gün arasında, en az hücreler. Son derece adipogenic ASC popülasyonları gibi erken 7 gün indüksiyon gibi lipit boşluk oluşumuna belirtileri gösterebilir.
    4. Adipogenic farklılaşma geçiren TSK kolayca ışık mikroskobu altında görüntülendi olabilir birden fazla lipit vakuollere gelişecektir. Buna ek olarak, adipojenik farklılaşma may(bkz. Şekil 2) Bu vakuollerde birikir bir Oil Red O histolojik leke kullanılarak teyit edilecektir.
      Oil Red O ile leke:
      1. Deney ve kontrol hücreleri ortamı çıkarın ve% 10 resmi kalsiyum Fiksatif kullanarak 60 dakika boyunca onları düzeltmek. Bu fiksatif hazırlamak için, aşağıdaki bir araya: CaCI2 1.0 g, 25.0 ml% 16 paraformaldehit (% 4.0 nihai) ve 75.0 ml damıtılmış su.
      2. 1x PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
      3. % 70 etanol ile kısa bir süre hücreleri yıkayın.
      4. Yağ Kırmızı O solüsyonu, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe hücreleri. Yağ Kırmızı O solüsyonu hazırlamak için, 50.0 ml% 70 etanol içinde 2.0 g, Yağ Kırmızı O toz ve 50.0 ml aseton içinde çözülür.
      5. Musluk suyu ile% 70 etanol ile ve daha sonra hücreleri yıkayın.
      6. Yakında nedeniyle zamanla leke solmaya boyandıktan sonra hücrelerin görselleştirmek.
  1. TSK kondrojenik Farklılaşması: kondrojenik türev "mikro-kültür" olarak adlandırılan bir yüksek yoğunluklu kültür tekniği ile elde edilir. Şöyle önce kültüre, kondrojenik Orta (ChM) hazırlanması: DMEM, bir 500 ml şişe için (4.5 g / ml glikoz) FBS (% 1 son konsantrasyon) 5.0 ml ve penisilin / streptomisin, 5.0 ml (10,000 IU / ml ekle ve 10,000 ug / ml nihai konsantrasyonlar, sırasıyla). L-askorbik-2-fosfat (nihai 50.0 ug / ml), insülin (nihai 6.25 mg / ml), transferin (nihai 6.25 mg / ml) ve TGFβ1: Bunun için, belirtilen son konsantrasyonları vermek üzere aşağıdaki kondrojenik indüksiyon maddeleri eklemek (10.0 ng / ml).
    1. Hücreleri peletlemek için 1200 x g'de 5 dakika boyunca TSK ve santrifüj hasat. Hücre süspansiyonunun yoğunluğunu belirlemek için hücre sayımı.
    2. Mikro-granül hazırlamak için, iki hücre süspansiyonları hazırlamak: 1 x 10 7 hücre yoğunluğunda CHM hazırlanan bir deney süspansiyonus / ml ve 1 x 10 7 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta CM hazırlanan bir kontrol süspansiyonu.
      1. Bir çok-yuvalı tabak bireysel kuyu hücre süspansiyonu 10.0 ul "damlacıkları" yerleştirin. 37 ° C'de 2-3 saat boyunca yapışmaya izin
      2. Yavaşça ChM veya CM ya hücreleri ayırmak için dikkatli olmak ile kaplı damlacıkların bindirmek.
      3. Kültür ortamı içinde değişiklik, her 3-4 günde bir ile CHM veya CM kadar 14 gün için hücreler. CHM içinde kültürlenen hücrelerden çevreleyen bir tek tabaka içinde herhangi bir hücre az olan, yüksek yoğunluklu bir mikro-topak elde etmek için, bu süre içinde yoğunlaşacaktır. Kültürlenmiştir Kontrol hücreleri, bu yoğunlaşma uğramaz ve birçok tek tabaka olarak tespit edilecektir.
      4. Kondorjenez teyit etmek için, oda sıcaklığında (1 x PBS içinde hazırlanmıştır)% 4.0 paraformaldehid içinde 15 dakika boyunca granül düzeltin. Bir Alcian Mavi histolojik leke kullanılarak sülfatlı proteoglikanların varlığı için leke.
        Alsiyan Blue kullanılarak leke için:
        1. Pa yıkayınbir kez 1 x PBS içinde raformaldehyde sabit peletler.
        2. Kendi pH değerini düşürmek için 5 dakika boyunca 0.1 N HCI (pH 1.0) 'de pelet inkübe edin.
        3. HCI çıkarın ve (0.1 N HCI, pH 1.0 içinde hazırlanmıştır)% 1 Alsiyan mavisi reaktif ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
        4. Alsiyan mavisi reaktif çıkarın ve Boya fazlasını uzaklaştırmak için, 0.1 N HCI (pH 1.0) ile granül yıkayın.
        5. Musluk suyu ile yıkama ek arka plan boyama azaltmak için kullanılabilir.
        6. Bir alternatif olarak, mikro-topaklar, hasat edilebilir% 10 formalin içinde gece boyunca sabitlenmiş, parafine gömülü ve bölümler Alcian Mavi için boyandı.

4. TSK Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Hücre yüzeyi antijeni, CD profili karakterizasyonu geleneksel akış sitometrisi yoluyla gerçekleştirilebilir.

  1. Akış sitometri için TSK hazırlanması: Önanalizine, aşağıdakilerden oluşan bir Flow Cytometry Tamponu (FCB) hazırlanması:% 1.0 BSA,% 2.0 FBS ve 1 x PBS içinde hazırlanmış% 0.025 saponin.
    1. TSK hasat ve pelet üretmek için 1.200 x g, 5 dakika için hücreler santrifüj.
    2. Steril 1XPBS hücrelerin tekrar ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirler.
    3. Pelet toplam ve santrifüj 5 x 10 5 hücre kısma süspansiyon bölmek.
    4. PBS Süpernatantı ve buz soğukluğundaki% 70 etanol fazlası ile, -20 ° C'de 60 dakika boyunca hücreleri gidermek. Eğer gerekli ise, gerekli olana kadar, bu hücreler, bir -20 ° C dondurucu içinde bu% 70 etanol içinde depolanabilir.
    5. Tespit sonra, dikkatli bir şekilde aspire etanol ve yavaşça FCB fazlası ile topak iki kez yıkayın. Yıkamak için:
      1. FCB aşırısı ekleyin ve hafifçe pelletini.
      2. Hücreleri toplamak için 1.200 x g'de 5 dakika santrifüj birsa pelet.
      3. Dikkatle FCB süpernatant aspire.
      4. Tekrarlayın.
    6. FCB 100 ul her kısım ve tekrar süspansiyon gelen son FCB yıkama süpernatantı. Üreticinin tavsiye edilen bir seyreltme kullanılarak istenen florokrom-eşlenik birincil antikor ekleyin. 30 dakika boyunca antikor ile buz üzerinde hücrelerin inkübe edin.
      Not: florokrom-eşlenik primer antikorlar mevcut değil ise, eşlenik olmayan primer antikorlar kullanılabilmektedir.
    7. (Örneğin, FITC, PE) kullanılan her florokrom, bir negatif kontrol olarak izotip-eşleştirilmiş IgG'leri ihtiva eden 100 mi FCB ile bir kısım hücreler inkübe edin.
    8. İlave bir kontrol olarak hiçbir antikor ihtiva eden 100 ml FCB bir kısım inkübe edin.
    9. Adım 4.1.5 ayrıntılı olarak FCB ile hücrenin Her eş pay, iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, FCB 100 ml hacimde tekrar süspansiyon ve akış analizi ile devam edin.
      Not: eşlenik olmayan primer antikorlar kullanılmışlarsa: FCB üreticinin tavsiye edilen bir seyreltme kullanılarak uygun florokrom-konjuge sekonder antikor ile takviye edilmiş olan bu yıkama aşaması 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe alikotları ardından. Adımda 4.1.5 de belirtildiği gibi iki kez yıkayın.
  2. TSK Akış analizi: akış analizi için, 10.000 olayların minimum sayılmalıdır. Lekesiz ve izotip-eşleştirilmiş kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan saçılma (SSC) kapıları ile ayarlamak için kullanılmalıdır. Bunun için, aşama 4.1.8 hiçbir kontrol antikoru (örneğin, lekesiz) artıkları ve ölü TSK ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır. Adım 4.1.7 izotip-eşleştirilmiş kontrol IgG. Pozitif floresan alanları oluşturmak için kullanılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol taslak üzerinde geniş hacimli lipoaspirate numuneden bir SVF izolasyonu için bir el enzimatik yöntem açıklanır. Bu SVF içinde, ASC de dahil olmak üzere pek çok hücre popülasyonları vardır. Çeşitli çalışmalar standart doku kültürü koşulları altında bu svf kültürleme ASC türü esas oluşacak muhtemel bir yapışık fibroblast nüfus için seçecektir öneriyorum. Bu uygun olarak, kültürlü SVF peletler önemli bulaşıcı hücreler, tür, yani RBCs, yumuşak kas hücreleri ve endotel soy 1 hücrelerinin esasen haline gelmesi, akış sitometrisi ve immun kullanarak göstermiştir. Elde edilen ASC nüfus (Şekil 2) göreceli olarak homojen bir görünüm ve fibroblast-benzeri hücrelerin oluşur. Bu yapışık TSK standart doku kültürü koşullarında kültürde de büyür ve çok sayıda moleküler ve hücre b için uygun hale süre 1 katına ılımlı bir nüfusa sergiin vivo, in vitro ve rejeneratif çalışmalarda iology çalışmaları. Bununla birlikte, izole edilmiş SVF heterojen doğası ışığında, ASC nüfusun doğrulama gereklidir. Çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo hem de 5-9, bu hücrelerin belirlenmesi potansiyel bir aracı olarak kültürlenmiş TSK CD antijenik profilini karakterize etmek için, akış sitometrisi kullanmıştır. Tablo 1 bu çalışmaların çoğu sonuçlarını özetlemektedir. Bu CD antijenleri bazılarının ifadesi tartışmalı olsa da, genellikle kültürlü TSK CD13, CD29, CD34, CD44, D49d, CD54, CD90 ve pozitif CD140a olduğu kabul edilmektedir. CD34 gibi özel hematopoietik markerlerinin ifadesi, şu anda henüz tam olarak verilmiş olsa da bu tür CD31 ve CD45 gibi çok sayıda hematopoietik CD antijenleri, yokluğu, TSK mezodermal kökenli ile tutarlıdır. Son zamanlarda, ASC antijenik profiller, akış sitometrisi ile tespit edildiği üzere, özel subpop seçmek için kullanılmaktadırulations gelişmiş farklılaşma kapasiteleri ile TSK üretme umuduyla 10-12.

Mezodermal, ektodermal ve endodermal soy içine onların farklılaşma tanımlanan kültür koşulları sonuçlarını kullanarak ASC nüfusun vitro indüksiyon doğrulama en popüler aracı olarak (Şekil 2) (inceleme için 4'e bakın). In vitro tri-germ katman potansiyel osteojenik rejeneratif model sistemlerinde, farklılaşma bir yelpazede TSK kullanımına neden olsa da, adipojenik ve kondrojenik hücreler ASC tanımlamak ve multipotency teyit etmek için genellikle yeterlidir. Bizim ellerde, Oil Red O 5 kullanılarak leke parlak lipit vakuoller içeren hücrelerde TSK sonuçlarının adipogenic farklılaşma. Osteojenik farklılaşma alkalin fosfataz-pozitif hücrelerindeki sonuçları ve bir kalsiyum fosfat Von Kossa Leke leke kullanılarak 5-dışı mineral birikimi.Yüksek yoğunluklu mikro-koşullarda kondrojenik farklılaşma (bir Alcian Mavi leke kullanılarak tespit) sülfatlı proteoglikanlan içeren ve kollajen tip 2 5 ifade granül üretmektedir. Iskelet kası ve yumuşak kas farklılaşma Her iki iskelet kası miyozin ve MyoD1 ve düz kas aktin 5, 13, 14 için boyama TSK ile görülebilir. Ektodermal soy içine Farklılaşma neden TSK ve Neun, nöronal bir transkripsiyon faktörünün 5 de dahil olmak üzere çok sayıda nöronal belirteçleri ekspresyonu ile benzeri bir nöronal morfoloji varsayımı üzerinden önerilmektedir. Son olarak, hücreler bilinen koşullar 15 results göre bir karaciğer / endodermal nesline doğru TSK indüksiyonu ekspresyonu alfa-fetoprotein, karaciğer hepatositlerin iyi bilinen bir işaretleyici. Birlikte son 10 yılda yayınlanan çok sayıda başkaları ile bu belirteçler, güçlü ASC kolayca korunabilir bir pluripotent kök hücre popülasyonu ve düşündürmektedirin vitro yayılır ve üç embriyonik germ soy hücrelere karşı uyardı. In vivo rejeneratif potansiyelleri (inceleme için 4'e bakın) birleştiğinde, ASC rejeneratif araştırma bilim adamı ya da klinisyen araçları güçlü bir ilave olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Lipoaspirate örnekleri insan TSK Manual, enzimatik izolasyonu. Izolasyonu için A. Ön izolasyon üzere aşağıdaki bileşenleri hazırlanmalıdır: 1) (), kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS 1x, otoklav yoluyla steril, 2), 1x PBS içinde hazırlanmış ve sterilize% 0,075-0,1 tipi kolajenaz IA, bir çözeltisi bir 0.22 mikron filtre birimi kullanılarak süzme yoluyla, AS 3) ASC nüfusun daha sonra kültür için kontrol Medium (CM). B. YalıtımCs: lipoaspirates arasındaki stromal damar fraksiyon (SVF) izolasyonu için bir adım adım kılavuz gösterilmiştir. Adım steril 1x PBS ile lipoaspirate yıkanmasını içerir, kolajenaz IA türü, santrifüjleme ile SVF toplanması ve SVF filtrasyon kullanılarak sindirim. SVF sonraki kültür ASC nüfusu içeren yapışkan fibroblast popülasyonunda neden olacaktır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. Yapışık ASC nüfusun Çok soy farklılaşma potansiyeli. SVF Kültürlenmiş hücreler yapışkan, fibroblastik TSK nispeten homojen bir popülasyonu ile sonuçlanmaktadır. Adipogenic, osteojenik, kondrojenik, iskelet miyojenik ve pürüzsüz miyojen soy hücrelerinde tanımlanan koşullar sonuçlarının altında ASC nüfus indüksiyon.Buna ek olarak, aynı zamanda TSK neun, bir nöron işaretleyici ve alfa-fetoprotein (AFP) endodermal / karaciğer hücre soyunun bir belirteçtir ifade ektodermal soy hücreleri içine ayırt edilebilir. Bazı histoloji ve immunofluorescent görüntüleri daha önce yayınlanan sonuçlar 1,5,6,7,8,9 alınır. Birlikte histolojik, imünohistolojik veya floresan boyası ile Farklılaşma soy gösterilmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

İfade profili
pozitif ekspresyon olumsuz ifadesi
CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, D49d, CD49e,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 		CD11a, CD11, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146,
HLA-DR, SMA, ABCG2
TSK önerilen fenotip
(Iki veya daha fazla çalışmaları arasında ortak) 		CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, D49d, CD54, CD90, CD140a,
HLA-ABC, STRO-1 		CD11a, CD11, CD11c, CD14,
CD31, CD45, CD106, CD144
TSK tartışmalı belirteçler
(Birden fazla çalışmalar üzerinde diferansiyel sonuçları) 		CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR
stromal cell belirteçler CD29, CD44, CD73, CD90, CD166
hematopoetik belirteçler CD31, CD34, CD45, ABCG2
kalın gösterilen 2 veya daha fazla çalışmalar arasındaki ortak belirteçler
SMA = düz kas aktini
HLA = insan lökosit antijeni
ABCG2 = çoklu ilaç taşıyıcı protein G2

Tablo 1. İnsan TSK hücre yüzey ifadesi profilleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TSK izolasyonu için yağ dokusu çeşitli biçimlerde gelebilir: şırınga çıkarma veya emme destekli lipoplasty (yani liposuction) ya aracılığıyla elde edilen küçük parçalar rezeksiyon veya lipoplasty yoluyla elde edilen doku katı parçalarından. Çelişkili çalışmalar 16, 17 sunulmuştur daha SVF hücreleri (ve dolayısıyla TSK) rezeke veya aspire yağ örneklerinden elde edilebilir belirsizdir. Bu yağ dokusu ya da bir şekilde sürece operatör kendi izolasyon tekniği yeterli olduğu SVF hücreleri ve TSK izolasyonu için uygun daha fazla olması mümkündür. Ancak, liposuction o rezeksiyon üzerinde bir avantaja sahip yapar bu daha az invaziv ve daha az post-operatif bakım gerektirir. Liposuction türleri gibi teknikleri de dahil olmak üzere, son on yılda artmış olsa da ultrason destekli, güç destekli ve lazer yardımlı liposuction 18, en sık şişen liposuction kalır,hangi yağ bölmesi 19 aspirasyon öncesinde steril tuzlu, anestezik ve vazokonstiktörlerin büyük miktarlarda ile doludur. Tekniğinin seçimi cerrah cerrah için değişebilir. Ekstraksiyon aracı araştırmacı için önemsiz görünebilir iken Ancak, bu teknik ASC sayısı ve canlılığı üzerinde bir etkiye sahip olabileceğini fark etmek önemlidir. Örneğin, artan liposuction vakum basıncı olumsuz SVF hücre verim 20 etkileyebilir. Ayrıca, ASC çoğalması azalır ultrason yardımlı liposuction 17 üzerinde ölçülmüştür.

Depolama sıcaklıkları SVF canlılığı ve nihai ASC verimini etkileyebilir Ancak elde edilen aspirat çabuk işlenmelidir. Matsumoto et al. Tarafından yürütülen çalışmalar, aspirat daha uzun bir süre, 24 saat 21 boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilir ise ASC verim azalır göstermiştir. Gerekirse, 4 ° C'de 24 saatlik saklama herhangi bir zararlı etki olmadan kullanılabilecektirBu depolama süresi bu noktadan ötesinde artış ise ASC nüfusun biyolojik özelliklerine s ama, yine, hücre canlılığı azaltabilir. Lipoaspirate işleme kolaylığı, doğrudan genel hacmi ile ilgilidir. Şırınga ekstraksiyonu ile elde edilen daha küçük miktarlar, işlem göreceli olarak kolaydır. Ancak, liposuction ile elde edilen büyük hacimli aspiratlarını, fiziksel zorluklar ortaya çıkabilir. Aspirat hacmi büyük olduğunda Örneğin, yıkanabilir, böylece emme kabından yağ aktarılması gibi basit bir problem olabilir. Bu makalede özetlenen protokolü bu bazı zorlukları hafifletmek içindir.

Tarafından ve büyük, bu makalede açıklanan enzimatik yöntem kullanılarak lipoaspirates ASC nüfus izolasyon son 10 yılda önemli ölçüde değişmedi. Lipoaspirates gelen TSK izolasyonu kendi açıklamasında mükemmel PubMed aracılığıyla mevcut çok sayıda protokol vardır. Most onları küçük değişiklikler ile çok benzer bir protokol özetlemektedir. Temel olarak, lipoaspirate kirleticilerin yıkanır, ASC nüfus içeren, SVF ve SVF serbest bırakmak için enzimatik olarak, santrifüj yoluyla toplanır. En büyük hacimli lipoaspirates vakum konteyner bazı tip gelmesi - yapılandırma cerrah cerrah değişebilir. Düzgün biyogüvenlik kaput yerleştirmeden önce temizlenmiş değilse konteyner kendisi bulaşma kaynağı olabilir çünkü bu protokol, yıkamadan önce büyük, steril bir beher içerisine aspiratı kaldırılmasını önerir. Olgun adipositlerin lizis, orta yağ katmanı ve tuzlu su ve kırmızı kan hücrelerini kirleten bir taban katmanından kaynaklanan bir top, yağ tabakası: kere aktarılır ve yerçekimi ile çökmeye bırakılır, aspirat üç tabaka halinde ayrı olacaktır. Bunun edilen hücre kültürleri (yayınlanmamış gözlemler) için toksik olabileceğini fark gibi yağ tabakası kaldırılması gerekir. Ayrıca, bu protocol tuzlu ve eritrosit infranatan önce TSK kültürlü kez RBCs kirletici potansiyel sayısını azaltmak için ilk yıkamada kaldırıldı olacaktır önerir. Ancak, Francis ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada bu infranatan da TSK 22 kaynağı olabileceğini ileri sürdü. 10 ml serolojik pipet kullanılması, bu infranatanların uzaklaştırılması nispeten kolay hale getirir. Geriye kalan sonra kolayca steril PBS ile yıkanmış ya da istenirse, steril PBS kirlenme 23-25 ​​şansını azaltmak için antibiyotik ve antimikotik ile takviye edilebilir yağ tabakasıdır. Yıkama sonrasında, adipoz doku, enzimatik tipi kolajenaz IA steril bir çözeltisi kullanılarak sindirilmiştir. Bunlar da bu video gösterilir Millipore birim olarak bir filtrasyon biriminin kullanımı aseptik yıkandı, yağ dokusu, 37 ° C'de daha sonra su-banyosu ile sindirim için eklenebilir etmek üzere kapalı bir kap içine kolajenaz filtrelenmesi için uygun bir araç birleştirir

Kullanılan kollajen tip kollajenaz tip IA 25, 24, 1 daha yaygın olması için görünen ile gruptan gruba değişmiştir. Bununla birlikte, ticari olarak kolajenaz 11 farklı tipleri kullanılabilir, belirli dokular için sindirim afinitelere sahip her vardır. Adipoz dokusunun sindirim için, örneğin Sigma Aldrich gibi şirketler kolajenaz tipleri I ve II tavsiye ve her iki tip de bugünkü literatürde 1, 24-27 temsil edilmektedir. Orijinal makalede, Zuk et al. 0.075,% 1 'lik bir konsantrasyonda sığır kaynaklarından elde edilen kolajenaz IA türü kullanın. Bununla birlikte, kolajenaz IA tipi çoğu ticari kaynakları hemen anaerobik bakteri, Clostridium histolyticum'dan veya E elde edilir coli genetik C ile değiştirilmiş genleri histolyticum. Birçok şirket, ham amonyum sülfat çökeltme ile hazırlanmış kişilerce kolajenaz IA tipi çok sayıda preparatlar bulunur.Bu JoVE makalede anlatılan protokol bir ham Çeşidi sadece kolajenaz etkinliği ihtiva kolajenaz IA hazırlanmasını değil, aynı zamanda non-spesifik proteaz, klostripain ve triptik enzimatik aktiviteleri kullanır. Bu ek enzimler, sindirim verim 28 için kritik olsa da, orada ham kolajenaz IA Çeşidi 28, 29 ile bağlantılı çok değişkenlik için çok rapor olanlardır ve etkili bir sindirim 23 elde etmek üzere% 0.2 'ye kadar kolajenaz kendi konsantrasyonlarını arttırmak. Ham tipi kolajenaz IA kullananlar gruplar da enzimin performansını artırmak ve yağ matriks içindeki hücrelerin stabilitesini artırmak amacıyla, sığır serum albümini (0.1-1.0% BSA) ile takviyesi önerilir. Bu makalede anlatılan protokol sindirim verimlilik üzerinde olumsuz etkisi ile takviyesi olmadan kolajenazı kullanır Ancak, bu gerekli olmayabilir.

Bir daha tanımlı kolagenaz comp kullanmak isteyenler içinağırlığı cinsinden, proteazlar kesin bir karışımı ile birlikte yüksek derecede arıtılmış kolajenaz ihtiva eden ticari kaynak mevcuttur. Bu preparatlar klostridiyal kollajenaz tip I ve II yüksek aktivite ve bu dispase ve termolizin olarak bilinen nötral proteaz aktiviteleri, onları birleştirmek arındırmak. Kolajenaz ve termolisin sindirimi kullanılarak verimli yağ Zachar et al. 27 tarafından bildirilmiştir. Bu çalışma ile anlaşarak, Pilgaard vd. 30 da kollajenaz ve termolizin çeşitli karışımları kullanarak mükemmel sindirim verimini rapor. Ancak, kollajenaz ve dispase hazırlıklarını kullanarak daha iyi sindirim etkinliğini gözlemlemek yok.

Adipoz dokudan hücrelerin izolasyonu için Sindirim kere çalışma araştırmaya değişebilir. Birçok yayınlanmış protokoller 1-2 saat 27, 30, sindirim kez öneririz. Ancak, aşırı sindirim kez sonuçta canlı A.Ş. sayısını etkileyebilir fark etmek önemlidirCs ve kök hücre fenotip. Pilgaard ve arkadaşları, 37 ° C'de 2 saat sindirim sindirim, son 45 dakika, sindirim ile, her 15 dakikada bir 2 saat kadar, en fazla dikkat edilmesi öneren. Zachar ve diğerleri ile, doku ayrışma ve ASC işlevsellik 30 arasında en iyi dengeyi vermektedir olduğunu tespit ettik adipoz doku daha homojen bir görünüm 27 alır kez durdu ediliyor. Biz bu öneriye katılıyorum. Bununla birlikte, en çok% 0,075-0,1 kolajenaz IA tip preparatlar 30-45 dakika içinde lipoaspirates büyük miktarda sindiren yeteneğine sahip olan ve bu zamanlar hücrelerin yeterli sayıda serbest bırakılması için yeterli olduğunu olduğu tecrübeyle sabittir. Bu nedenle, bu protokol, 30 dakikalık bir süre sindirim önerir. Daha fazla zaman gerekli ise, lipoaspirate kıvamı izlenmeli ve lipoaspirate bir "krem" ya da "sulu" görünümü (Şekil 1) varsayar sindirim durdu.

Inci keze sindirim serbest SVF izolasyonu sadece santrifüj kullanılarak gerçekleştirilir, tamamlanır. Ancak, aspirasyon basıncı gibi, santrifüj fiziksel etkileri SVF canlılığı ve kültür için kullanılabilir TSK sayısına bir etkisi olabilir. Kurita ve arkadaşları 31 tarafından yapılan bir çalışmada 3,000 xg aşan hızları ASC zarar olduğunu göstermiştir. Ancak, hızı SVF yeterli peletleme sağlamak kadar önemli olmalıdır. Kural olarak, bu da dahil olmak üzere en protokoller, 1,200-1,500 x g santrifüj hızı öneririz. Bakım ilişki özel santrifüj rotor bağlıdır onlar, merkezkaç kuvveti (g cinsinden ölçülür) ve (rpm olarak ölçülür) santrifüj hızları arasındaki ilişkiyi anlamalarını sağlamak için araştırmacı tarafından alınmalıdır. Bununla birlikte, bir kural olarak, bu tür 1200 x g gibi düşük merkezkaç kuvvetleri, çoğu zaman santrifüj hızına denktir ve güvenli bir şekilde birbirlerinin yerine kullanılabilir.

Ardından iplik, birçok dipetrol ve "kabarık" beyaz adipositlerden, bir orta tabaka ve kolajenaz bir hücre peleti bir üst tabaka: stinct katmanlar santrifüj tüpüne (Şekil 1) görülmektedir. TSK içeren, eritrositlerde, bir üst tabaka ve bir alt beyaz SVF pellet: pelet kendisi iki farklı tabaka olabilir. Yağ hücre kültürüne toksik olabilir ve adipositler geri daha ilkel bir hücre tipi için 32 farklılaşmanın giderilmesi yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir gibi bu protokol, yağ ve adipositlerin dikkat aspirasyon önerir. Bununla birlikte, bu adipositler istenirse bu noktada toplanabilir. Çünkü bu kirleticilerin, bu protokol bunların yeterli kaldırılmasını sağlamak için fazladan bir yıkama adımı önerir. Bu adım aynı zamanda araştırmacı filtrasyon sonraki kolaylığı için birden SVF pelet birleştirmek sağlar. Filtrasyon nedeniyle fibrotik malzemenin büyük parçaları ve sindirim aşağıdaki hücresel agregaların varlığı için gerekli olması muhtemeldir. Bu malzemeler kolaylıkla kaldırılır70 veya 100 mikron mesh filtreler aracılığıyla basit yerçekimine dayalı filtrasyon yoluyla. Süzüntünün bir miktarı arzu edildiği takdirde çekirdekli hücrelerin sayısını ve ASC yapışması ve genişleme için kaplama kalan filtrat saymak için alınabilir.

Mümkün olduğunca çok sayıda eritrositler kaldırmak için çalışkan girişimlerine rağmen, hiçbir ASC hazırlık RBC kirlenme olmadan tamamen olacaktır. Orijinal yazıda, 160 mM NH4CI hipotonik bir solüsyon içerisinde pelet yeniden süspansiyon haline getirilmesi yoluyla bu eritrosit kaldırılmasını önerdi. Sonraki izolasyon makalelerin çoğunluğu bu adımı içeren ve bakım steril su kullanılarak eğer alınmalıdır rağmen SVF hücreler maruz kaldığı süreyi en aza indirmek için, NH 4 Cl-tabanlı çözümler ya da steril su 22-24, 27, 33 kullanılmasını tavsiye hipotonik bir solüsyon 27. RBC bir yapışkan olmayan hücre popülasyonu ve kolayca bir gecelik kültürü için aşağıdaki kaldırılabilir Ancak bu adım gerekli olmayabilirASC nüfus. En iyi anektodal Dahası, bu eritrosit sonuçtaki yapışkan hücreler (Zuk, yayınlanmamış gözlemler) başlangıç ​​genişleme geliştirmek için görünür. Bu nedenle, bu protokol RBC parçalama adımı ortadan kaldırır ve ilk ASC kültürleri kültür ortamı herhangi bir değişiklik olmaksızın, ilk 3-4 gün için, bu eritrosit mevcudiyetinde genişletmek için izin verilmesini önermektedir. Bu gözlem için nedeni kan hücreleri karışmasını parakrin sinyallemesinin bir tür bağlı olabilir ya da sadece nedeniyle RBC parçalama adımı hariç daha canlılığı olabilir. Bunu takiben yavaşça steril 1 x PBS ile plakaların yıkanması ile kültür ortamı aspire edilebilir ve eritrosit çoğunluğu kaldırıldı. Zamanla, kalan herhangi bir eritrosit sonunda ölecek ve kültürden çıkarılabilir.

Zachar ve Boquest tarafından çalışmalar yeniden süspanse SVF pelet% 25-50 doku kültürü plastik 23, 27 yapışır tahmin etmektedir. Oluşan "pasaj 0" ASC cuboyandı kökenli endotel olmak önerdi TSK ve daha düzensiz şekilli hücreler olduğu düşünülen küçük, yuvarlak hücrelerden oluşan, heterojen. Bizim dahil olmak üzere birçok grup ile çalışmalar, SMC'ler, hematopoietik hücreler ve ASC kültürler 1 fibroblastlar gibi hücre tipleri kirletici yokluğunu teyit da, ek hücre tiplerinin varlığı göz ardı edilemez. . Nitekim, Tallone ark geçişini 0 kültürleri karakterize ve dört ayrı popülasyonlarını gözlemledi: 1) küçük, yuvarlak, hızla yenileyen hücreler, 2) ASC olduğu düşünülen iğ biçimli fibroblastik hücreler, 3) yavaşça büyük hücreler kopyalayan daha kısıtlı potansiyeli (yani pre-adiposit) ve geçit 34 ile kayıp 4) küboidal endotel hücreleri. Daha sonraki çalışmalar, yuvarlak, hızla yenileyen hücre popülasyonu yüksek multipotentiality sahip olduğunu göstermiştir ve tipik kök hücre belirteçleri 35, 36 ifade var. Ayrıca, nedeniyle "küremsilerin" oluşturabilmektedirkendi hızla çoğalması ve genellikle iğ şeklinde fibroblastlar ile çevrilidir. Bu nedenle, yukarıda önerilen iğsi ASC nüfus bu hücrelerden kaynaklanan olasıdır. Bu geçit 0 ASC kültürlerin başlangıçtaki genleşmeye ardından, elde edilen kültürler, daha fibroblastik, homojen bir bileşim alınması ile, zaman içinde sürekli kültürleme ASC için seçer düşünülmektedir. Ancak, kirletici hücre kalıntıları tamamen nedenle, ASC nüfusunun hala heterojen düşünülmelidir, dışladı ve olamaz.

Bu makalede açıklanan protokol ucuz, basit ve normal bir doku kültürü imkan bulunmayan ekipman parçaları varsa gerekli olmasa da, bu tür bir tesis edilmesi dezavantajını var. Sayısız çalışmalar hayvan modelleri ile TSK öteleme uygulamalarını araştırdık ve ASC kullanarak klinik çalışmalar ortaya çıkmaya başlamıştır (inceleme için bakınız 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu yazının yazarları California Üniversitesi Regents ve Cytori Tedavi için lisanslı ait bir patent üzerinde eş-mucitler vardır.

Acknowledgments

Yazarlar kabul etmek istiyoruz ve dahil açıklanan protokolü ve TSK kendi izolasyon gelişmesine katkıda bu ek araştırma personelini teşekkür: Dr H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, Doktora, ve Dr John Fraser, PhD. Sunulan sonuçlar NIAMS ve NIDCR Enstitüleri dahil olmak üzere Ulusal Sağlık Enstitüleri, araştırma hibe, kısmen finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) Mediatech Cellgro 10-013-CV with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin Mediatech Cellgro 30-002-CI 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B Mediatech Cellgro 30-003-CF 250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline) Mediatech Cellgro 25-053-CI without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA Mediatech Cellgro 20-031-CV 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) Sigma C2674 crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated Gemini Bioproducts 100106 USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104
25 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-106
100 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-202
150 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-203
500 ml Stericup Filter Units Millipore SCGPU05RE PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers FisherBrand 22-363-549 100 μm nylon mesh
dexamethasone - water soluble Sigma D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate disodium salt Sigma G-9422 also known as glycerophosphate
insulin Sigma I-6634 made from bovine pancreas
indomethacin Sigma I-7378
apo-transferrin Sigma T-4382
TGFβ1 R&D Systems 240-B-002 recombinant human
Oil Red O Sigma O-0625
Alcian Blue Sigma A-5268
Silver nitrate Sigma S-0319
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 supplied as a 16 % stock
Name Company Catalog Number Comments
Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood Thermo Scientific ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge Hermle Labnet Z383 Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg
Water bath Fisher Scientific Isotemp S52602Q 5-10L capacity, capable of 37C
Automated Pipette Aids Drummond Pipette Aid XL 4-000-105
CO2 Incubator Thermo Scientific Forma 310 direct heat or water jacketed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 79 Yağ Dokusu Stem Cells İnsanlar Hücre Biyolojisi biyoloji (genel) enzimatik sindirim kollajenaz hücre izolasyonu Stromal Vasküler Kesir (SVF) Yağ elde edilen kök hücreler TSK lipoaspirate liposuction
İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S.,… More

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. (79), e50585, doi:10.3791/50585 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter