Summary
여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.
Abstract
렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)는 세포의 여러 유형에 유전 물질을 전달하는 강력한 수단입니다. 정맥 주사의 대량 생산이 HIV-1 유래 벡터와 관련된 안전 문제 때문에하는 것은 도전이다. 본 논문에서, 우리는 자기 불활 정맥 주사의 높은 역가를 생산하는 방법을보고합니다. 우리는 retrovirally 돌기 세포 특정 당 단백질, SVGmu 포함한 모든 바이러스 구성 요소를 표현할 수있는 세포주, GPRS를, 생성하는 TET 오프 안정적인 생산 세포주 GPR를 형질 도입. 다음, 우리는 LV 전송 플라스미드 인코딩에게 선택 마커와 함께 리포터 유전자 GFP를 형질을 concatemeric DNA의 형질 전환을 사용합니다. 결과 클론 중 일부는 우리가 일시적인 형질로 얻을 수있는 것보다 10 배 더 큰 역가에 LV를 생성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 바이러스를 효율적으로 체외에서 수지상 세포를 형질 도입하고 기자 항원에 강한 T 세포 면역 반응을 생성합니다. 이 방법은 좋은 옵션을 구경 할 수 있습니다R 암 또는 감염성 질환의 임상 연구에 대한 강력한 LV-기반의 백신을 생산.
Introduction
많은 벡터 시스템은 유전자 전달을 위해 개발되었습니다. 렌티 바이러스에 기반 벡터는 가장 일반적으로 공부 바이러스 시스템 사이에 있었다. 그들이 효율적으로 세포 1 분할 및 비 나누어 모두 형질 도입으로 인해 호스트 게놈에 통합 장기적인 표현을 달성, 대부분의 인간 집단이 낮은 천연 안티 - 벡터 내성을 전시하고, 대한 낮은 가능성을 가질 수 있기 때문에 이러한 벡터 유익하다 insertional 돌연변이 3,4에서 유전 독성.
렌티 바이러스의 생산은 항상 안전에 대한 우려로 채색되어 있습니다. 렌티 바이러스 벡터는 일반적으로 HIV-1, AIDS의 원인균 에이전트에서 파생됩니다. lentivector의 개별 구성 요소 (전송, 봉투, 포장 플라스미드)의 일시적인 형질 실험실 설정에서 유전 물질을 전달하는 일반적이고 유연한 방법입니다. 그러나 임상 응용을위한 확장까지 과도의 transfections는 복잡하고 엄마입니다y를 복제 능력 렌티 5,6의 발전으로 이어질. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 몇몇 안정 포장 및 생산 세포주는 6-11 개발되었다. 이 라인 중 하나 GPR 포장 라인 (11)은 테트라 사이클린에 의해 규제되는 매력적인 장점이 있습니다. 본 논문에서, 우리는 구체적으로 돌기 세포 (DC-정맥 주사) 12를 대상으로하는 자체 운영을 중지시키지 렌티 바이러스 벡터를 생산하는이 시스템을 적용하는 방법을 보여줍니다.
돌기 세포 (DCS)는 면역 시스템의 가장 강력한 항원 제시 세포입니다. 그들이 직접 프로그램을 시작하고, 종양 특이 면역 반응하기 13 규제 때문에 그들은 암 백신 개발에 큰 관심의 대상이되고있다. DC의 펩타이드 또는 DNA 백신보다 더 강력한 항암 면역 반응을 유도 할 수있는 잠재력을 포함하는 예방 접종 프로토콜을 통합. 최근에, 우리는 렌티 바이러스 벡터를 개발 한 specifically를 수정 sindbis 바이러스 당 단백질, SVGmu 14을 통해 수지상 세포를 대상으로합니다. 그들은 돌기 세포에 높은 특이성을 보여 비특이적, VSVg-pseudotyped 벡터보다 강한 면역 반응을 생성하는 이러한 벡터는 고유합니다.
여기, 우리는이 DC-타겟 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을보고합니다. 우리는이 DC-LV를이 수지상 세포를 감염하고 강력한 CD8 + T 세포의 면역 반응을 생성 할 수 보여줍니다. 동물과 관련된 모든 절차는 USC Intitutional 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 인도적으로 수행되었다. 생체 및 임상 실험을 수행하기 위해서는, 그것은 높은 역가에 바이러스를 생성 할 수 세포 라인을 만드는 것이 중요합니다. 설명대로 전달과 형질 전환 단계를 수행하면 이러한 복제를 생성하는 기회를 극대화하는 것입니다.
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Protocol
DC-LV 안정적인 생산 세포는 필요한 렌티 바이러스 구성 요소 gagpol, 회전 및 TET 오프 시스템을 포함 GPR 포장 세포주 11에 따라 구성됩니다. 첫째, 레트로 바이러스 전달은 TET 의존 SVGmu 당 단백질을 인코딩 GPRS 포장 세포주를 생성하는 데 사용됩니다. 그런 다음, concatemer 배열 형질이 같은 GFP와 같은 렌티 바이러스 벡터 유전자와 GPRS 세포주를 형질하는 데 사용됩니다. LV-MGFP로 지정이 안정 생산 세포주는, GFP에 대한 DC-LV 백신 생산 능력에 대한 in vitro와 in vivo에서 테스트 할 수 있습니다.
1. Tet의 의존 SVGmu 세포 라인을 생성
플라스미드 PRX-SVGmu는 DC-특정 당 단백질 SVGmu 하류 레트로 바이러스 플라스미드 pRetroX-Tet의 오프 1 (그림 1C)의 TTA-고급 발기인 복제되는 구조이다. D10의 문화 293T 세포 (Dulbecco의 수정 이글의 중간에10 % 소 태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민). 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)와 D10의 문화 GPR 포장 세포주. 모든 세포는 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에서 배양된다.
- 16-18 시간 전에 일시적으로 형질 전환, 플레이트 2 × 10 세포를 형질 전환시 90 % confluency에 접근하는 등 6 cm 조직 문화 접시에있는 D10의 4 ML 6 293T 세포.
- 레트로 바이러스 플라스미드의 형질 : 혼합 100 μL 1.25 M 염화칼슘 용액, 멸균 밀리 Q 물과 같은 플라스미드 : 5 μg PRX-SVGmu, 2.5 μg pGag 폴, 2.5 μg pVSV-G. 최종 부피가 500 μL입니다. 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 튜브에 500 μL 2X HBS를 (50 MM의 HEPES, 10 mM의 KCl을 12 mM의 포도당, 280 mM의 NaCl을, 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH가 7.05 나 1.5 밀리미터)를 추가합니다. 유리 파스퇴르 피펫으로 적극적으로 버퍼를 버블 링하는 동안 2X HBS 버퍼에 플라스미드 혼합물 적하를 추가합니다. 마일을 추가 한 후xture는 또 다른 30 초 버블 링 계속합니다. 그런 다음, 6 cm 배양 접시에있는 293T 세포에 전체 혼합물을 추가하고, 37 품어 ° C.
- 4 시간 형질 전환 한 후, 조심스럽게 4 ML 예열 D10과 문화 접시에있는 매체를 교체하십시오.
- 감염 스핀 : 형질 전환 후 48 시간을, 수확 SVGmu - 인코딩 0.45 μm의 필터를 통해 상층 액을 통과하여 상층 액에서 레트로 바이러스 입자를. / 물론 2 × 10 4 세포의 24 잘 접시에 판 GPR 포장 세포. 1,050 XG에 90 분, 25 ° C.에 대한 접시에 GPR 포장 셀 (2 ㎖ /도)와 원심 분리기 세포 상층 액을 여과 추가 (2 ㎖ / 잘) 스핀 감염 후 독시사이클린 (1 NG / ML) 신선한 D10에 매체를 변경합니다.
- 포장 세포가 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 NG / ML)와 D10의 형질 72 시간 후 형질은 문화를 확장합니다.
- 48 시간 동안 독시사이클린없이 SVGmu, 문화, 세포의 발현을 확인합니다. 표면 EX를 측정안티 Sindbis 혈청을 사용하여 유동 세포 계측법에 SVGmu의 컴프레션. 이러한 세포는 GPRS 포장 세포주로 지정되어 있습니다.
2. Concatemer 배열 형질에 의해 DC-LV 생산자 세포를 생성
렌티 바이러스 전송 플라스미드 TL20-GFP는 자체 운영을 중지 렌티 바이러스 전달 벡터 플라스미드 독스 - 조절 가능한 바이러스 성 RNA 게놈 발현 시스템 7 TET 사업자 (그림 1C) 11와 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 증강의 교체와 pCL20c-MSCV-GFP를 기반으로 , 12,15. 플라스미드 PGK-BLE은 약한 PGK 프로 2에 의해 구동 블레오 마이신 내성 (BLE) 카세트 테이프입니다.
- 50에서 제한 효소 SfiI와 다이제스트 20 μg 플라스미드 TL20-GFP ° C. 37 PflMI와 다이제스트 20 μg 플라스미드 PGK-BLE ° C.
- 아가로 오스 겔 전기 영동하여 DNA 조각을 (PGK-BLE 카세트 1011 BP와 벡터이다 TL20-GFP는 6861 bp의 경우) 정화.
- TL20-GFP 벡터 및 PGK -을 결찰25:1의 몰비 (NEB T4 DNA ligase를)에서 BLE 카세트입니다. 실온에서 밤새 품어.
- 하룻밤 결찰 후 결찰 혼합물 (Qiagen의 DNeasy의 혈액 및 조직 키트)에서 DNA를 정화. 순화 한 DNA의 양을 확인 5 μg 정도입니다.
- 형질 전 16-18 시간, 자랄는 형질 전환시 약 90 %가 될 것 같은 6 cm 조직 문화 접시에 접시에 GPRS 포장 세포.
- 6 cm 조직 문화 접시에 GPRS 포장 세포로 정제 concatemeric DNA 5 μg을 형질하는 단계 1.2에서 설명한 인산 칼슘의 transfection 방법을 사용합니다. 4 시간 형질 전환 한 후, 신중하게 매체를 제거하고 독시 싸이클린 (1 NG / ML) 4 ML 예열 D10로 교체합니다.
- 48 시간 형질 전환 한 후, 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)를 D10에 매체를 변경합니다. 문화 매체 zeocin을 (50 ㎍ / ㎖) 첨가하여 형질 전환 클론을 선택합니다. 세포 coloni까지 약 2 주 동안 문화 세포ES는 요리의 하단에 볼 수 있습니다.
- 요리의 하단에있는 세포 식민지 레이블을 지정합니다. 24 잘 조직 배양 접시를 취할 수 우물과 각 well에 2 ㎖ D10 포함 zeocin (50 ㎍ / ㎖), 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ㎖)을 추가 할 수 있습니다. 형질 세포의 매체를 대기음, 그 분 미만의 식민지의 각각에 트립신 한 방울을 추가합니다. 그런 다음, 같은 식민지에 D10의 하나 또는 그 이상의 방울을 추가합니다. 피펫 하나의 식민지 하나를 선택하고 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 우물에 그들을 전송합니다.
- 문화와 바이러스 생산 능력 평가를위한 D10 포함 zeocin (50 ㎍ / ㎖), 독시사이클린 (1 NG / ML) 및 puromycin (2 ㎍ / ml)에있는 모든 세포 클론을 확장합니다.
3. 각 세포 클론의 바이러스 생산을 평가
- 독시사이클린없이 그 자랄 같은 D10에서 6 cm 조직 문화 요리에 4X10 6 세포 주변의 프로듀서 세포와 플레이트를 Trypsinize90 %를 초과합니다. 매일 신선한 예열 D10와 매체를 교체하고 DOX를 제거한 후 역가 분석 72 시간 동안 매체를 수집합니다.
- 0.45 μm의 필터 매체를 필터링하여 바이러스 상층 액을 수확.
- 플레이트 대상 세포 × 10 4 세포 / 물론 1, 96 - 웰 배양 접시에서 음성 대조군으로 DC-SIGN 수용체 (예 : 파생 293T.hDC 서명 또는 마우스 골수 수지상 세포 16)와 293T를 표현. 우물 (물론 100 μL /)로 바이러스 상층 액의 2 배 연속 희석을 추가합니다. 보통 6-8 희석는 GFP 양성 세포가 추가 된 바이러스의 양에 선형 관계에있는 형질하는 범위에 도달하기에 충분합니다.
- 세포를 원심 분리하고 단계 1.4에서 설명한 매체를 교체하십시오. BMDCs 10 % FBS와 GM-CSF (1시 20분 J558L 에어컨 매체)를 RPMI 배지에서 배양되어야한다.
- 유동 세포 계측법 4-6일 후 전달하여 세포를 형질에서 GFP 발현을 측정한다. 렌티 바이러스 vectoGFP 양성 세포와 벡터 금액의 비율이 선형 관계에있을 때 R 역가가 벡터 희석 범위에서 계산됩니다. 이후의 응용 프로그램에 대한 높은 바이러스 생산 세포 클론을 선택합니다.
4. 렌티 바이러스 벡터를 생성하고 집중
- 문화 15 cm 조직 문화 요리 생산자 세포주 (LV-MGFP).
- 독시사이클린없이 신선한 D10에서 자랄 때 90 % 이상에서 15 cm 조직 문화 요리에 생산자 세포와 플레이트 세포를 Trypsinize. 매일 신선한 예열 D10과 매체를 변경합니다.
- 피크 바이러스 생산 (같은 사용자에 의해 결정)시, 바이러스 상층 액을 수확하고 0.45 μm의 필터를 사용하여이를 필터링합니다. 90 분 동안 50,000 XG에 파라 필름 (parafilm) 및 원심 분리기, 4 ° C로 밀봉 두꺼운 벽 32.5 ML의 원심 분리기 튜브로 필터링 상층 액을로드합니다. 철저하게 50 μL 또는 응용 프로그램에 따라 PBS 또는 HBSS의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을. </ 리>
5. 생체 내 마우스를 면역 항원 특정 면역 반응을 분석
- 4 절에 설명 된대로 높은 titer의 바이러스를 생산하고 있습니다.
- 벡터 서스펜션 (발바닥 당 25 μL)와 노상 루트를 통해 BALB / C 마우스 (구, 여성 6-8주)을 주입.
- 이주 예방 접종 후 비장과 수확 비장 세포를 분리. GFP 에피토프 펩티드와 GFP 특정 CD8의 존재 + 세포 내 사이토 카인 염색법을 사용하여 T 세포를 분석 문화 비장은 앞에서 17 (그림 3B) 설명했다.
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Representative Results
이 방법에서 설명하는 안정적인 세포 라인은 특히 돌기 세포를 대상으로하는 렌티 바이러스 벡터의 대량 생성 할 수 있습니다. 그림 1B에서 보는 바와 같이, 각각의 클론의 분리 품질 12 변화의 안정적인 세포 라인을 굴복. 테스트 26 클론 중 8 일시적인 형질 전환에 의해 생산 SVG-pseudotyped 렌티 바이러스 벡터에 대한 일반적인 벤치 마크 ML (TU / ML), 당보다 큰 10 6 전달 단위의 역가에 렌티 바이러스 입자를 생산. 동시에 여러 클론 미만 10 4 TU / mL를 생산, 그것은 강력한 프로듀서를 얻기 위해 여러 클론을 분리하는 것이 중요합니다.
하나의 복제는 안정적보다 큰 10 7 TU / ML의 역가에 렌티 바이러스 벡터를 생산. 이 복제본에 대한 자세한 테스트는 바이러스 생산이 수준은 배양액에 혈청의 존재 / 부재에 의해 영향을받지 여러 일 동안 안정하고,라고 증명3 개월 이상 (그림 2) 12 배양 세포에서 chievable.
이 바이러스는 체외에서 효과가 없다는 사실을 확인하기 위해, 그들은 또한 쥐를 예방 접종을하는 데 사용되었습니다. 세포 내 사이토 카인 염색법에 의한 GFP 특정 면역 반응의 분석은 안정적으로 생산 된 DC-LV는 모든 CD8 + 비장의 약 4 % (그림 3) 12 GFP 특정 CD8의 확장 + T 세포를 자극 수있는 것으로 나타났습니다.
그림 1. 항생 물질의 규제 렌티 바이러스 벡터 생산 세포의 생성. 레트로 바이러스 벡터 연속으로 GRP 라인의 전달 등의 DC-타겟 렌티 바이러스 벡터 생산 세포를 만들기위한 절차의 (A) 도식 개요SVGmu 봉투 유전자 concatemeric 형질 전환하여 관심 (바이러스 벡터)의 유전자의 형질을 aining. (B) zeocin 처리에 의해 선택된 단일 클론 1~2주 이상 확장되었고, 바이러스 상층 액의 역가가 3 일 제거 후 측정 하였다 독시사이클린의. 같이 바이러스 역가가 복제에 의해 널리 다양. (C) 플라스미드 맵. 플라스미드 바이러스 벡터, TL20-GFP는 쥐 줄기 세포 바이러스 프로모터 및 테트라 사이클린 repressible 발기인의 통제하에 벡터 게놈의 통제하에 녹색 형광 단백질을 인코딩합니다. PGK-BLE가 제정 포스 포 키나제 1 프로모터 (PGK)에서 zeocin 저항 유전자 (SH BLE) 인코딩합니다. 레트로 SVGmu는 P 꽉 TET 반응 요소 아래 SVGmu 당 단백질이 포함되어 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 바이러스 벡터 생산의 특성. (A) DOX 제거 후 배양 상층 액의 바이러스 벡터 역가은 7 일을 위해 매일 측정 하였다. 72 시간 게시물 유도 - 바이러스 생산 48 사이의 정점. 혈청이없는 배지에서 배양 한 세포는 10 % FBS로 배양 한 것과 같은 거의 많은 바이러스를 생산했다. (B) 생산자 셀은 3 개월 동안 배양 및 씩을 바이러스 생산을 위해 정기적으로 테스트되었습니다. 바이러스 생산의 유의 한 감소가 관찰되지 않았다.
그림 3. 안정된 DC-표적 세포 라인에서 생산 렌티 바이러스 벡터를 선택적으로 체외에서 수지상 세포를 형질 도입하고 생체 내에서 면역 반응을 생성 할 수 있습니다. <강해> (A) 마우스 골수 유래 수지상 세포가 LV-GFP와 GFP 발현을 유세포 분석기로 측정 한에 감염되었습니다. GFP 발현은 수지상 세포를 포함 CD11c + 세포에 특정한이었다. (B) 마우스는 정제 및 농축 LV-GFP의 2 × 10 7 TUS과 함께 예방 접종을 하였다. 2 주 후에, 모든 CD8 + T 세포의 약 4 %는 GFP 지배적 인 펩타이드의 프레 젠 테이션에 대한 응답으로 IFNγ를 활성화하고 표시 하였다.
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Discussion
여기, 우리는 안정적으로 규제 시스템의 전원 TET 아래의 모든 렌티 바이러스 구성 요소와 형질 293T 세포를 사용하여 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을 설명했다. 지금까지, 렌티 바이러스 벡터를 생산하는 대부분의 프로토콜 (예를 들어, 18 참조) 표준 인산 칼슘 일시적인 형질 전환에 의존하고 있습니다. 이 방법은 임상 척도에 성공했습니다,하지만 안정적인 세포 라인에서 생산을 확장에있을 가능성이없는 몇 가지 제한 사항이 고통 수 있습니다. 예를 들어, LV 플라스미드를 대량으로와 공동 형질은 이론적으로 복제 능력 렌티 19의 개발을위한 기회를 증가시킬 수 있습니다. 또한, 과도 transfections에 12이 필요 DNA 입력의 대량 때문에 안정적인 생산 라인을 활용하여보다 큰 규모의 가변 결과를 생성 할 가능성이 높습니다. 오른쪽 조건에서, 같은 생산 라인은 생성하는 데 사용 된 γ-복고풍 기타큰 규모 20,21에 바이러스 성 벡터. 하지만, 렌티 바이러스 생산 라인을 활용 한 연구는 제한되어 있으며, 따라서 복제 능력 렌티을 감지하는 강력한 분석 (22)의 포함은 임상 사용에 대한 세포주 개발에 중요합니다.
다른 그룹의 Lentivirus - 생산 안정 세포주 6-11,23에 대한 설명을 발표했다. 그러나이 보고서의 일반적인 한계는 그들 중 많은 임상 사용을위한 그들의 안전을 줄일 수 있습니다 관심의 유전자를 인코딩 렌티 바이러스 벡터를 생산 세포를 transducing에 의존한다는 것입니다. 여기, 우리는 자기 불활 렌티를 생성 할 수 세포를 형질 도입하는 concatemeric 배열 형질 전환 방법 11를 사용합니다. 또한, TET 오프 시스템을 우리의 사용은 임상 사용하는 방법의 적합성을 향상시킵니다. 이 규제 시스템은 세포 배양 유지 보수 기간 동안 SVGmu에서 독성을 방지하고 항생제에 따라 렌티 바이러스 벡터의 컬렉션을 수 있습니다IC없는 상태.
절차를 수행하는 동안, 그것은 렌티 바이러스 벡터를 처리 할 때 실험실 근로자가 적절한 예방 조치를 사용하는 것이 중요합니다. 렌티 바이러스 벡터는 HIV-1, 인간의 병원체에서 파생 된, 모든 절차는 기관 생물 안전위원회의지도하에 수행되어야한다. 실험은 임상 실습 24 시간 동안 최대 크기를 조정하는 경우 향상된 BL2 봉쇄가 표시 될 수 있지만, NIH에 따르면, BL2 억제는 일반적으로 여기에 설명 된 것과 같은 고급 렌티 바이러스 시스템 작업에 적합합니다.
특별한주의를 요구하는 절차에 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 세포 배양은 세부 사항에 중대한 관심으로 수행해야합니다. 우리는 생산 세포가 매 24 시간을 계대하지 않은 경우 바이러스 역가가 눈에 띄게 감소 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, FBS의 일부 많은 바이러스 생산에 상당한 감소로 이어질 수 있으므로 FBS BEF 여러 많은 테스트하는 것이 중요합니다광석 실험을 확장. 높은 바이러스 역가를 생산할 수있는 복제의 선택은 다운 스트림 애플리케이션에 필수적이다. 이전의 연구 25와 계약에, 우리는 빠르게 분열하는 것처럼 클론 더 많은 바이러스를 생산하는 경향이 나타났습니다. 일단 높은 역가 클론이 발견되면,이 세포는 분주하고 FBS에 냉동 + 10 % DMSO 가능한 한 빨리해야한다. 그런 다음, 갓 해동 분주을 사용하여 가장 높은 역가를 생성하는 데 도움이됩니다. 엄지 손가락이 규칙에 따라, 우리는 과도의 transfections을 통해 바이러스를 생산하는 대부분의 성공이 있고, 우리는 유사한 세포 라인의 유지 보수가 안정 바이러스 생산 세포 혜택을 것으로 예상.
이 방법의 주요 한계는 안정적인 생산 라인을 생성하도록 프런트 상당한 노력을 필요로한다는 것입니다. 따라서, 렌티 바이러스 벡터의 여러 유형을 테스트 할 상황에 적합하지 않을 수 있습니다. 과도의 transfections는 살전에 더 편리 할 수 있습니다응용 프로그램의 E 타입. 우리는 일반적으로 벡터가 이미 작은 형식으로 테스트 한 후 바이러스 벡터의 대량 생성하려면이 방법을 사용하여 예측. 우리의 특정 세포 라인의 또 다른 한계는 봉투 단백질 SVGmu,이 수용체에 결합하기 때문에 GPRS 세포에 의해 생성 된 벡터는 DC-SIGN을 표현 세포에 대한 구체적인 것입니다. 다른 세포 수용체를 표적으로하는 절차는 원래의 GPR 세포 라인에 다른 당 단백질 플라스미드를 도입하여 수정할 수 있습니다. 렌티 바이러스 벡터가 GFP보다 더 중요한 단백질을 제공 할 수 있도록 마찬가지로 관심의 다른 유전자가 생산 세포주에 형질 전환 할 수 있습니다.
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Acknowledgments
저자는이 원고에 대한 데이터를 기여 마이클 추, 빙빙 다이, 그리고 리앙 샤오를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 연구에 사용 된 시약의 관대 선물 닥터 존 그레이을 인정합니다. PB는 국립 암 센터에서 박사 친교에 의해 지원됩니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소 (R01AI68978, P01CA132681 및 RCA170820A), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 번역 의학 합동 센터에서 번역 가속 그랜트와 캘리포니아 HIV / AIDS에서 부여에서 부여에서 교부금에 의해 지원되었다 연구 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
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