Summary
Her anvendes retroviral transduksjon og concatemeric transfeksjon for å skape en cellelinje som kan uttrykke komponentene i en lentiviral vektor (LV) i fravær av tetracyklin. Dette LV koder GFP og er pseudotyped med et glykoprotein, SVGmu, som er spesifikk for en reseptor på dendrittiske celler.
Abstract
Lentiviral vektorer (LVS) er et kraftig middel til å levere genetisk materiale til mange typer celler. På grunn av sikkerhetsmessige bekymringer knyttet til disse HIV-1 avledet vektorer, som produserer store mengder LVS er utfordrende. I denne artikkelen rapporterer vi en metode for å produsere høy titer av selv-inaktivere LVS. Vi retrovirally transduce Tet-off stabil produsent cellelinje GPR å generere en cellelinje, GPRS, som kan uttrykke alle de virale komponenter, inkludert en dendrittiske celle-spesifikk glykoprotein, SVGmu. Deretter bruker vi concatemeric DNA transfeksjon å transfektere LV overføring plasmid koding en reporter gen GFP i kombinasjon med en valgbar markør. Flere av de resulterende klonene kan produsere LV ved en titer 10 ganger høyere enn hva vi oppnå med forbigående transfeksjon. I tillegg er disse virusene effektivt transduce dendrittiske celler in vitro og generere en sterk T-celle immunrespons mot vår reporter antigen. Denne metoden kan være et godt alternativ for fremstilling av sterke LV-baserte vaksiner for kliniske studier av cancer eller smittsomme sykdommer.
Introduction
Mange vektor systemer har blitt utviklet for genet levering. Vektorer basert på lentiviruses har vært blant de mest studerte viral system. Disse vektorer er fordelaktig fordi de effektivt kan transduce både delende og ikke-delende celler 1, for å oppnå langvarig ekspresjon på grunn av integrering i vertsgenomet, utviser lav naturlig anti-vektor immunitet i de fleste humane populasjoner 2, og har et lavt potensial for gentoksisitet fra innsettingen mutagenese 3,4.
Produksjon av lentiviruses har alltid vært farget av sikkerhetsmessige hensyn. Lentiviral vektorer er generelt avledet fra HIV-1, det etiologiske middel for AIDS. Forbigående transfeksjon av enkelte komponentene i lentivector (overføring, konvolutt og emballasje plasmider) er en vanlig og fleksibel måte å levere genetisk materiale i laboratoriet. Imidlertid er oppskalering forbigående transfections for kliniske applikasjoner tungvint og may føre til utvikling av replikering-kompetente lentivirus 5,6. For å overvinne disse hindringene, har flere stabile emballasje og produsent cellelinjer blitt utviklet 6-11. En av disse linjene, GPR pakkelinjen 11, har den fordelen av å være attraktive regulert av tetracyklin. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan tilpasse dette systemet til å produsere selv-inaktivere lentiviral vektorer som er spesielt rettet mot dendrittiske celler (DC-LVS) 12.
Dendrittiske celler (DCS) er de mest robuste antigenpresenterende celler i immunsystemet. De har vært gjenstand for stor interesse i kreft vaksineutvikling fordi de direkte initiere, program og regulere tumor-spesifikke immunresponser 13. Består av et vaksinasjon protokollen til å inkludere DCs har potensial til å lokke fram en sterkere antitumor immunrespons enn peptid eller DNA-vaksiner. Nylig har vi utviklet en lentiviral vektor som specifically mål dendrittiske celler gjennom en modifisert sindbis virus glykoprotein, 14 SVGmu. Disse vektorer er unike ved at de viser høy spesifisitet til dendrittiske celler og generere sterkere immunresponser enn uspesifikke, VSVg-pseudotyped vektorer.
Her rapporterer en metode for fremstilling av store mengder av disse DC-målrettede lentiviral vektorer. Vi viser at disse DC-LVS kan infisere DCs og generere sterke CD8 + T-celle immunrespons. Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført humant, under godkjenning av USC Intitutional Animal Care og bruk Committee. For å utføre in vivo eksperimenter og klinisk, er det avgjørende for å skape en cellelinje som kan produsere virus i høy titer og. Utføre transduksjon og transfeksjon skritt nøyaktig som beskrevet vil maksimere sjansene for å generere en slik klone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC-LV stabile produsent-celler som er konstruert basert på den GPR emballasjen cellelinje 11 som inneholder de nødvendige komponenter lentiviral gagpol, Rev og Tet-off-system. Først blir retroviral transduksjon brukes til å generere en GPRS emballasje cellelinje som koder for et tet-avhengige SVGmu glykoprotein. Deretter er concatemer rekke transfeksjon brukes til transfektere GPRS cellelinje med en lentiviral vektor transgene som GFP. Denne stabile produsent-cellelinje, betegnet som LV-MGFP, kan testes in vitro og in vivo for sin evne til å produsere en DC-LV vaksine mot GFP.
En. Generere et Tet-avhengige SVGmu Cell Linje
Plasmid PRX-SVGmu er en konstruksjon der DC-spesifikk glykoprotein SVGmu er klonet nedstrøms for TTA-avansert formidler av retrovirale plasmid pRetroX-Tet-off 1 (figur 1C). Kultur 293T celler i D10 (Dulbecco modifiserte Eagle medium med10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin). Kultur GPR emballasje cellelinje i D10 med doksycyklin (1 ng / ml), og puromycin (2 ug / ml). Alle cellene blir dyrket i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- 16-18 timer før forbigående transfeksjon, plate 2 x 10 6 293T-celler i 4 ml av D10 i en 6 cm vevskultur fatet slik at cellene nærme seg 90% konfluens ved tidspunktet for transfeksjon.
- Transfeksjon av retrovirale plasmider: mix 100 mL 1,25 M CaCl 2 løsning, sterile Milli-Q vann og følgende plasmider: 5 mikrogram PRX-SVGmu, 2,5 mikrogram pGag-Pol, 2,5 mikrogram pVSV-G. Det endelige volum er 500 ul. Til en 5 ml polystyren rundbunnet rør, tilsett 500 mL 2X HBS (50 mMHEPES, 10 mM KCl, 12 mM druesukker, 280 mM NaCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Legg plasmidet blandingen dråpevis til 2X HBS buffer mens boblende bufferen kraftig med et glass Pasteur pipette. Etter å legge til mixture, fortsetter bobler for ytterligere 30 sek. Deretter legger hele blandingen på de 293T celler i 6-cm kultur tallerken, og ruge ved 37 ° C.
- 4 timer etter transfeksjon, omhyggelig erstatte mediet i kultur tallerken med 4 ml forvarmet D10.
- Spin infeksjon: 48 timer etter transfeksjon, høsting SVGmu-kodende retrovirale partikler i supernatanten ved føring av supernatanten gjennom et 0,45 mikrometer filter. Plate GPR emballasje celler i en 24-vel rett på 2 x 10 4 celler / brønn. Legg filtreres supernatanten til GPR emballasje celler i fatet (2 ml / brønn) og sentrifuger cellene i 90 min ved 1050 x g og 25 ° C. Skift medium inn i frisk D10 med doksycyklin (1 ng / ml) etter spinn-infeksjon (2 ml / brønn).
- 72 timer post-transfeksjon, utvides kulturen av transduserte celler emballasje i D10 med doksycyklin (1 ng / ml), og puromycin (2 ng / ml).
- For å bekrefte uttrykk for SVGmu, kultur cellene uten doxycycline i 48 timer. Måle overflaten expression av SVGmu med flowcytometri ved hjelp av anti-Sindbis serum. Disse cellene er utpekt som GPRS emballasje cellelinje.
2. Konstruer DC-LV Produsent Cells etter Concatemer Array Transfection
Lentiviral overføring plasmid TL20-GFP er en selv-inaktivere lentiviral overføring vektor plasmid basert på pCL20c-MSCV-GFP med en Dox-regulerbar viral RNA genomet uttrykk system og utskifting av cytomegalovirus (CMV) forsterker sammen med syv tet operatører (figur 1C) 11 , 12,15. Plasmid PGK-lig er en bleomycin resistente (kabel) for kassett drevet av en svak PGK promoter to.
- Digest 20 mikrogram plasmid TL20-GFP med restriksjonsenzymet SfiI ved 50 ° C. Digest 20 mikrogram plasmid PGK-lig med PflMI ved 37 ° C.
- Rense DNA-fragmenter (den PGK-lig kassett er 1011 bp og vektor TL20-GFP er 6861 bp) av agarose gel elektroforese.
- Ligate den TL20-GFP vektor og PGK-lig kassetten ved et molart forhold på 25:1 (NEB T4 DNA-ligase). Inkuber over natten ved romtemperatur.
- Etter overnatter ligation, rense DNA fra ligeringsblandingen (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Sørg for mengden av renset DNA er rundt 5 mikrogram.
- 16-18 timer før transfeksjon, plate GPRS emballasje celler i en 6 cm vevskultur-fatet slik at sammenflyting vil være omtrent 90% ved tidspunktet for transfeksjon.
- Bruk kalsiumfosfat transfeksjon metoden beskrevet i trinn 1.2 til å transfektere 5 mikrogram av det rensede concatemeric DNA inn GPRS emballasje cellene i seks-cm vevskultur-fatet. 4 timer etter transfeksjon, forsiktig fjerne mediet og erstatt med 4 ml forvarmet D10 med doksycyklin (1 ng / ml).
- 48 timer etter transfeksjon, bytter mediet inn i D10 med doksycyklin (1 ng / ml), og puromycin (2 ug / ml). Valg for transfekterte kloner ved å tilsette zeocin (50 ug / ml) i dyrkningsmedium. Kultur cellene i ca 2 uker før celle kolones kan sees på bunnen av rettene.
- Merke celle kolonier på bunnen av rettene. Ta 24-brønners vevkul-retter, antall brønner og legge til hver brønn 2 ml D10 inneholdende zeocin (50 ug / ml), doksycyklin (1 ng / ml), og puromycin (2 ug / ml). Aspirer mediet for de transduced celler, og deretter legge en dråpe trypsin på hver av koloniene i mindre enn ett minutt. Deretter legger en eller flere dråper D10 på de samme kolonier. Ta opp kolonier etter tur med en pipette og overføre dem i separate brønner på 24-brønners vevkulturplate.
- Kultur og utvide alle celleklonene i D10 inneholdende zeocin (50 ug / ml), doksycyklin (1 ng / ml), og puromycin (2 ug / ml) for evaluering av viral produserende evne.
3. Vurdere Viral Produksjon av hver celle Clone
- Trypsinize produsentlandene celler og plate rundt 4x10 6 celler i 6-cm vev kultur fatet i D10 uten doxycycline slik at confluencyoverstiger 90%. Erstatte medium med frisk forvarmet D10 daglig og samle medium for titer analysen 72 timer etter fjerning dox.
- Høste den virale supernatanten ved filtrering av mediet med et 0,45 mikrometer filter.
- Plate målceller uttrykker DC-SIGN reseptor (f.eks 293T.hDC-tegn eller mus benmarg avledet dendrittiske celler 16) og 293T som en negativ kontroll i 96-brønners kultur retter, en x 10 4 celler / brønn. Tilsett 2-ganger seriefortynninger av det virale supernatanten til brønnene (100 ul / brønn). Vanligvis 6-8 fortynninger er tilstrekkelig til å nå det område hvor transdusert GFP-positive celler som er i et lineært forhold til mengden av virus tilsatt.
- Sentrifuger cellene og erstatte mediet som beskrevet i trinn 1.4. BMDCs bør dyrkes i RPMI medium med 10% FBS og GM-CSF (1:20 J558L kondisjonerte medium).
- Mål GFP uttrykk i transduced celler ved flowcytometri 4-6 dager etter transduksjon. Den lentiviral Vetco Grayr titer beregnes i vektoren fortynningsområde når prosentandelen av GFP-positive celler og vektor mengde er i et lineært forhold. Velg celleklon med høyest virusproduksjonen for påfølgende anvendelser.
4. Produsere og Konsentrer lentiviral vektorer
- Kultur produsent cellelinje (LV-MGFP) i 15-cm vev kultur retter.
- Trypsinize produsentlandene celler og plate celler i 15-cm vev kultur retter på mer enn 90% confluency i frisk D10 uten doksycyklin. Endre medium med frisk, forvarmet D10 daglig.
- På tidspunktet for peak virusproduksjonen (som bestemmes av brukeren), høste viral supernatanten og filtrere det ved hjelp av en 0.45-mikrometer filter. Laste filtrert supernatanten i tykke vegg 32,5 ml Ultrasentrifuger rør, forsegle med parafilm og sentrifuger ved 50.000 xg, 4 ° C i 90 min. Grundig resuspender pellet i 50 mL eller en passende volum av PBS eller HBSS avhengig av programmet. </ Li>
5. Immunisere mus in vivo og Analyser antigen-spesifikk immunrespons
- Produsere høy titer virus som beskrevet i § 4.
- Injisere BALB / c mus (6-8 uker gammel, kvinne) via en footpad rute med vektoren suspensjon (25 ul per footpad).
- 2 uker etter vaksinasjon, isolere milt og høste splenocytes. Kultur splenocytter med GFP epitop peptider og analysere tilstedeværelsen av GFP-spesifikke CD8 + T-celler ved hjelp av intracellulær cytokin flekker, som tidligere beskrevet 17 (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den stabile cellelinje som er beskrevet i denne fremgangsmåte kan produsere store mengder lentiviral vektorer som er spesielt rettet til dendrittiske celler. Som vist i figur 1B, ga isolasjon av individuelle kloner stabile cellelinjer av varierende kvalitet 12. Blant de 26 kloner som ble testet, produserte 8 lentiviral partikler ved en titer på mer enn 10 6 transduksjon enheter pr ml (TU / ml), noe som er en typisk standard for SVG-pseudotyped lentiviral vektorer produsert ved forbigående transfeksjon. På samme tid, produsert flere kloner mindre enn 10 4 TU / ml, det er viktig å isolere flere kloner for å oppnå en sterk produsent.
Én klon produseres rimelig lentiviral vektorer ved en titer på mer enn 10 7. TU / ml. Videre testing på denne klon viste at dette nivået av virus-produksjonen var stabil i flere dager, upåvirket av nærvær / fravær av serum i kulturmedium, og enchievable i celler dyrket i mer enn tre måneder (figur 2) 12.
For å bekrefte at disse virusene var ikke bare effektive in vitro, ble de også brukt til å immunisere mus. Analyse av GFP-spesifikk immunrespons ved intracellulær farging fant cytokin som stabilt-produsert DC-LV kan stimulere ekspansjonen av GFP-spesifikke CD8 + T-celler til nesten 4% av alle CD8 + Splenocytter (figur 3) 12.
Figur 1. Generasjon av tetracyklin-regulerte lentiviral vektor produsent celler. (A) Skjematisk oversikt over fremgangsmåten for å lage DC-målrettede lentiviral vektor produsent celler, inkludert transduksjon av GRP linjer med en retrovirusvektor fortsaining den SVGmu konvolutt-genet og transfeksjon av genet av interesse (viral vektor) ved concatemeric transfeksjon (B). Enkle kloner selektert av zeocin behandling ble utvidet i løpet av 1-2 uker, og titeren av viral supernatant ble målt 3 dager etter fjerning av doksycyklin. Som vist, varierte virale titere vidt av klonen. (C) Plasmidkart over. Den virale vektor-plasmid, TL20-GFP, koder for grønt fluorescerende protein under kontroll av en murin stamcelle viruspromotor og vektoren genomet under kontroll av en tetracyklin-repressible promotor. PGK-lig koder zeocin motstand genet (Sh kabel) under konstituerende phosphoglycerate kinase en promoter (PGK). Retro-SVGmu inneholder SVGmu glykoprotein under P stramt tet responsive element. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Karakteristika for viral vektor. Produksjon (A) Etter fjerning av DOX ble virusvektor titer av kultursupernatantene målt hver dag i 7 dager. Virus produksjon toppet seg mellom 48-72 timer etter induksjon. Celler dyrket i serum-frie medier produsert nesten like mye virus som de dyrket med 10% FBS. (B) Produsent celler ble dyrket over 3 måneder, og prøver ble testet regelmessig for virus produksjon. Ingen signifikant tap av virusproduksjon ble observert.
Figur 3. Lentiviral vektorer produsert av stabile DC-målrettede cellelinjer kan selektivt transduce DCs in vitro og generere en immunrespons in vivo. <strong> (A) Mus benmarg-avledet dendrittiske celler ble infisert med LV-GFP og GFP uttrykk ble målt med flowcytometri. GFP uttrykk var spesifikke for CD11c +-celler, som inkluderer dendrittiske celler. (B) Mus ble vaksinert med 2 x 10 7 TUs av renset og konsentrert LV-GFP. To uker senere ble nesten 4% av alle CD8 + T-celler aktiveres og uttrykt IFNγ som reaksjon på presentasjonen av GFP dominerende peptid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skissert en metode for å produsere store mengder lentiviral vektorer ved hjelp 293T celler stabilt transduced med alle lentiviral komponentene under tet utenfor regelverket. Til dags dato, de fleste protokoller for å produsere lentiviral vektorer stole på standard kalsiumfosfat transient transfeksjon (se 18, for eksempel). Denne tilnærmingen har vært vellykket på en klinisk skala, men det kan lide noen begrensninger ikke sannsynlig å være til stede i skalere opp produksjonen fra stabile cellelinjer. Eksempelvis kan co-transfeksjon med store mengder LV plasmider teoretisk øke sjansen for utvikling av replikasjonskompetente lentivirus 19.. Videre transiente transfeksjoner er mer sannsynlig å produsere varierende resultater i stor målestokk for å benytte et stabilt produsent linje på grunn av de store mengdene av DNA-inngangene som benyttes 12. Under de rette forholdene, har slike produsent linjer blitt brukt til å generere andre γ-retrovirale vektorer på store skalaer 20,21. Men studier utnytte lentiviral produsent linjer begrenset, og dermed inkludering av robuste analyser 22 å oppdage replikering kompetent lentivirus vil være avgjørende i å utvikle noen cellelinje for klinisk bruk.
Andre grupper har publisert beskrivelser for lentivirus-produserende stabile cellelinjer 6-11,23. Imidlertid er en felles begrensning av disse rapportene at mange av dem er avhengige transdusering av produsent-celler med lentiviral vektorer som koder for genet av interesse, noe som kan redusere deres sikkerhet for klinisk bruk. Her bruker vi den concatemeric rekke transfeksjon metode 11 til transduce celler som kan produsere selv-inaktivere lentivirus. Videre forbedrer bruk av vår Tet-off systemet metodens egnethet til klinisk bruk. Dette regelverket hindrer toksisitet fra SVGmu under cellekultur vedlikehold og gir mulighet for innsamling av lentiviral vektorer i henhold antibiotika,ic-frie forhold.
Under prosedyren, er det viktig at laboratoriet arbeidere ta nødvendige forholdsregler ved håndtering av lentiviral vektorer. Lentiviral vektorer er utledet fra HIV-1, en menneskelig patogen, og alle prosedyrer skal utføres under veiledning av en institusjon biosikkerhet komité. Ifølge NIH, er BL2 containment regel hensiktsmessig for å arbeide med avanserte lentiviral systemer som er beskrevet her, selv om forbedret BL2 containment kan være indisert hvis eksperimenter er skalert opp for klinisk praksis 24.
Det er flere viktige skritt i prosedyren som krever spesiell omsorg. Først må cellekultur utføres med stor oppmerksomhet på detaljer. Vi har funnet at virus-titere avta merkbart hvis produsent-celler som ikke passeres hver 24. time. På samme måte kan noen mange FBS føre til betydelige reduksjoner i virusproduksjon, så det er viktig å teste flere masse bef FBSmalm skalere opp et eksperiment. Valget av et klon som kan produsere høye virus-titere er avgjørende for nedstrøms applikasjoner. I overensstemmelse med tidligere arbeid 25, har vi funnet at kloner som synes å dele seg hurtigere tendens til å produsere mer viruset. Når en høy-titer klon er blitt funnet, bør disse cellene blir alikvotert og frosset i 10% FBS + DMSO så snart som mulig. Deretter, ved hjelp av ferskt aliquoter tint hjelper til å generere den høyeste titer mulig. Ved å følge denne tommelfingerregelen har vi hatt mest suksess produsere virus gjennom forbigående transfections, og vi forventer at lignende cellelinje vedlikehold vil gagne stabile virus-produserende celler.
Denne metode er vesentlig begrensning er at den krever en betydelig mengde forhånd innsats for å generere en stabil produsent linje. Dermed er det ikke sannsynlig å være hensiktsmessig i situasjoner hvor flere typer av lentiviral vektorer vil bli testet. Forbigående transfections kan være mer praktisk for these typer applikasjoner. Vi generelt forutse ved hjelp av denne metoden for å generere store mengder av viral vektor etter at vektoren har allerede blitt utprøvd i et lite format. En annen begrensning av vår spesifikk cellelinje er at vektorer produsert av GPRS-cellene bare vil være spesifikke for celler som uttrykker DC-tegn fordi konvolutten protein, SVGmu, binder seg til denne reseptoren. For å målrette andre cellulære reseptorer, kan fremgangsmåten modifiseres ved å innføre andre glykoprotein-plasmider inn i den opprinnelige GPR cellelinje. Likeledes kan andre gener av interesse bli tilført i produsentlandene cellelinjer slik at lentiviral vektorer kan levere mer relevante proteiner enn GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Michael Chou, Bingbing Dai, og Liang Xiao for å bidra data for dette manuskriptet. Vi erkjenner også Dr. John Gray for de sjenerøse gaver av reagenser som brukes i denne studien. PB er støttet av en postdoktorstilling fra National Cancer Center. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 og RCA170820A), et stipend fra Bill og Melinda Gates Foundation, en translasjonell akselerasjon stipend fra Joint Center for translasjonell medisin og et stipend fra California HIV / AIDS Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
