Summary
Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.
Abstract
Lentivirais (VEs) são um poderoso meio de entrega de material genético para muitos tipos de células. Devido a questões de segurança associadas a esses HIV-1 vetores derivados, produzindo grandes quantidades de VEs é um desafio. Neste artigo, apresentamos um método para a produção de altos títulos de LVs auto-inativação. Nós retroviralmente transduzir o produtor estável tet-off linha celular de GPR para gerar uma linha celular, GPRS, que pode expressar todos os componentes virais, incluindo uma glicoproteína específica de células dendríticas, SVGmu. Então, usamos concatemeric transfecção de ADN para transfectar o LV transferência plasmídeo que codifica um gene repórter GFP, em combinação com um marcador seleccionável. Vários dos clones resultantes podem produzir LV com um título de 10 vezes maior do que aquilo que conseguir com transfecção transitória. Além disso, estes vírus eficiente transduzir células dendríticas in vitro e geração de uma forte resposta imunitária das células T ao antigénio a repórter. Este método pode ser uma boa opção for produção de vacinas fortes baseados em LV para os estudos clínicos de câncer ou doenças infecciosas.
Introduction
Muitos sistemas de vectores têm sido desenvolvidos para entrega de genes. Vetores baseados em lentivírus têm estado entre o sistema viral mais comumente estudada. Estes vetores são vantajosos porque podem eficientemente transdução tanto dividindo e não dividindo células 1, alcançar expressão a longo prazo, devido à integração no genoma do hospedeiro, apresentam baixa imunidade natural anti-vector na maioria das populações humanas 2, e têm um baixo potencial de genotoxicidade de mutagénese insercional 3,4.
Produção de lentivírus sempre foi colorida por questões de segurança. Lentivirais são geralmente derivados de HIV-1, o agente etiológico da AIDS. Transfecção transiente de componentes individuais do lentivector (transferência, o envelope, e os plasmídeos de empacotamento) é um meio comum e flexível de fornecimento de material genético em laboratório. No entanto, a ampliação dos transfections transitórios para aplicações clínicas é pesado e may levar ao desenvolvimento de lentivírus replicação competente 5,6. Para ultrapassar estas dificuldades, várias embalagens estáveis e linhas celulares produtoras foram desenvolvidos 6-11. Uma destas linhas, a linha de embalagem de GPR 11, tem a vantagem de ser atraente regulada por tetraciclina. Neste artigo, vamos demonstrar como adaptar este sistema para produzir auto-inativando lentivirais que são especificamente voltados para as células dendríticas (DC-VEs) 12.
As células dendríticas (CDs) são o antigene mais robustas que apresentam as células do sistema imunitário. Eles têm sido objecto de grande interesse no desenvolvimento de vacinas contra o cancro, porque eles iniciam directamente, programa e regular as respostas imunológicas específicas do tumor 13. A incorporação de um protocolo de vacinação de incluir DCs tem o potencial para provocar uma resposta imune antitumoral mais forte do que as vacinas de ADN ou de péptidos. Recentemente, desenvolvemos um vetor lentivírus que specifically como alvo as células dendríticas através de uma glicoproteína do vírus Sindbis modificado, SVGmu 14. Estes vetores são os únicos que mostram alta especificidade para as células dendríticas e gerar respostas imunes mais fortes do que inespecíficos, vetores VSVG-pseudotipado.
Aqui, apresentamos um método para a produção de grandes quantidades desses lentivirais DC-alvo. Nós demonstramos que estas DC-VEs podem infectar DC e gerar fortes de células T CD8 + respostas imunes. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de forma humana, sob a aprovação do USC Intitutional Animal Care e do Comitê Use. A fim de realizar experiências in vivo e clínica, que é crítico para criar uma linha de células que podem produzir o vírus a um título elevado. Executar as etapas de transdução e transfecção exatamente como descrito irá maximizar as chances de gerar um tal clone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Células produtoras estáveis DC-LV são construídos com base na GPR embalagens da linha 11 célula que contém o necessário lentiviral componentes gagpol, rev e do sistema tet-off. Em primeiro lugar, a transdução retroviral, é utilizado para gerar uma linha celular de empacotamento GPRS, que codifica uma glicoproteína SVGmu tet-dependente. Em seguida, concatemer transfecção matriz é utilizado para transfectar a linha celular com um transgene GPRS vetor lentiviral como GFP. Esta linha celular estável produtora, designado como LV-mGFP, pode ser testado in vitro e in vivo pela sua capacidade para produzir uma vacina contra DC-LV GFP.
1. Geração de uma linhagem de células dependente de SVGmu Tet
O plasmídeo PRX-SVGmu é uma construção na qual a glicoproteína específica SVGmu-DC é clonado a jusante do promotor tTA avançado de plasmídeo retroviral pRetroX-Tet-off 1 (Figura 1C). Culturas de células 293T em D10 (meio de Eagle modificado por Dulbecco com10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina). Cultura GPR linha celular de empacotamento em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Todas as células são cultivadas num humidif 37 ° C incubadora com 5% de CO 2.
- 16-18 h antes da transfecção transiente, placa de 2 x 10 6 células 293T em 4 ml de D10 em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que as células se aproximam de 90% de confluência no momento da transfecção.
- Transfecção de plasmídeos retrovirais: misture 100 mL de 1,25 M de CaCl2 solução estéril de água Milli-Q e os seguintes plasmídeos: 5 mg PRX-SVGmu, 2,5 mg pGag-Pol, 2,5 mg pVSV-G. O volume final é de 500 uL. Para um tubo de poliestireno ml de fundo redondo de 5, adicionar 500 ul de 2X HBS (HEPES 50 mM, KCl 10 mM, dextrose 12 mM, NaCl 280 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Adicionar gota a gota, a mistura de plasmídeo em tampão HBS a 2X do tampão enquanto se faz borbulhar vigorosamente com uma pipeta Pasteur de vidro. Depois de adicionar o mixture, continuam borbulhando por mais 30 segundos. Em seguida, adicione a mistura total sobre as células 293T em placas de cultura de 6 cm, e incubar a 37 ° C.
- 4 h após a transfecção, substitua cuidadosamente o meio em placas de cultura com 4 ml D10 pré-aquecido.
- Girar infecção: 48 h após a transfecção, a colheita SVGmu codifica partículas retrovirais no sobrenadante por passagem do sobrenadante através de um filtro de 0,45 mícrons. Placa de células de empacotamento de GPR em um prato de 24 poços a 2 x 4 10 células / poço. Adicionar sobrenadante filtrado para células de empacotamento GPR no prato (2 ml / poço) e as células de centrifugação durante 90 min a 1050 xg e 25 ° C. Mudar médio em D10 fresco com doxiciclina (1 ng / ml) após spin-infecção (2 mL / poço).
- 72 horas após a transfecção, a expansão da cultura de células de empacotamento transduzidas com doxiciclina em D10 (1 ng / ml) e puromicina (2 ng / ml).
- Para confirmar a expressão da SVGmu, a cultura das células sem doxiciclina durante 48 h. Meça ex superfíciepressão de SVGmu com a citometria de fluxo, utilizando soro anti-Sindbis. Estas células são designadas como GPRS linha celular de empacotamento.
2. Construir DC-LV células produtoras de matriz Concatemer transfecção
Lentivirus plasmídeo de transferência TL20-GFP é uma auto-inactivação lentiviral vector de transferência de plasmídeo baseado em pCL20c-MSCV-GFP com um sistema de Dox regulável genoma de ARN viral e expressão substituição do citomegalovírus (CMV) com o intensificador de operadores tet 7 (Figura 1C) 11 , 12,15. O plasmídeo PGK-vel é resistente (ble) cassete bleomicina conduzido por um promotor PGK fraco 2.
- Digest 20 ug de plasmídeo TL20-GFP com a enzima de restrição Sfil, a 50 ° C. Digest 20 ug de plasmídeo PGK-vel com PflMI a 37 ° C.
- Purifica-se os fragmentos de ADN (a cassete PGK-vel é 1011 pb e o vector TL20-GFP é 6861 pb) por electroforese em gel de agarose.
- Ligar o vector TL20-GFP e PGK-cassete vel a uma razão molar de 25:1 (NEB ligase do DNA de T4). Incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Após a ligação durante a noite, purificar DNA a partir da mistura de ligação (Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit). Assegurar a quantidade de ADN purificado é de cerca de 5 jig.
- 16-18 horas antes da transfecção, as células da placa de embalagem de GPRS em um prato de cultura de tecidos de 6 cm de tal modo que a confluência será de cerca de 90% no momento da transfecção.
- Usar o método de transfecção com fosfato de cálcio descrito na etapa 1.2 para transfectar 5 ug do ADN concatemeric purificada em células de empacotamento do GPRS 6 cm de prato de cultura de tecidos. 4 h após a transfecção, o meio cuidadosamente remover e substituir com 4 ml D10 pré-aquecida com doxiciclina (1 ng / mL).
- 48 horas após a transfecção, mudar o meio em D10 com doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Escolha de clones transfectados adicionando zeocina (50 ug / ml) no meio de cultura. Cultura de células para cerca de 2 semanas até pilha colonizaçãoes pode ser visto, na parte inferior dos pratos.
- Rotular as colônias de células na parte inferior dos pratos. Aqui pratos de cultura de tecidos de 24 poços, o número de cavidades e adicionar a cada poço 2 ml de D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml). Aspirar o meio das células transduzidas, em seguida, adicionar uma gota de tripsina em cada uma das colónias durante menos de um minuto. Em seguida, adicionar uma ou mais gotas de D10 no mesmo colónias. Pegar colónias, um por um, com uma pipeta, e transferi-los para diferentes poços da placa de cultura de tecidos de 24 cavidades.
- Cultura e expandir em todos os clones de células D10 contendo zeocina (50 ug / ml) e doxiciclina (1 ng / ml) e puromicina (2 ug / ml) para a avaliação da capacidade de produção viral.
3. Avaliar a produção viral de cada clone celular
- Tripsinizar as células produtoras e prato em torno de 4x10 6 células em 6 cm de prato de cultura de tecido em D10 sem doxiciclina tal que a confluênciasuperior a 90%. Substituir o meio fresco com D10 pré-aquecido diariamente e recolher o meio para o ensaio de titulação de 72 horas após a remoção dox.
- Colheita do sobrenadante virai por filtragem por meio de um filtro de 0,45 ^ m.
- As células alvo placa que expressa o receptor DC-SIGN (por exemplo 293T.hDC-SIGN ou na medula óssea do rato derivadas de células dendríticas, 16) e 293T como um controlo negativo em pratos de cultura de 96 poços, 1 x 4 10 células / poço. Adicionar duas diluições em série do sobrenadante viral aos poços (100 ul / poço). Geralmente, 6-8 diluições são suficientes para atingir a gama em que as células transduzidas GFP positivas estão em uma relação linear com a quantidade de vírus adicionado.
- Centrifugar as células e substituir o meio, tal como descrito na etapa 1.4. BMDCs devem ser cultivadas em meio RPMI com 10% de FBS e GM-CSF (1:20 J558L meio condicionado).
- Medir a expressão da GFP em células transduzidas por citometria de fluxo de 4-6 dias pós-transdução. A vecto lentiviralr título é calculado na gama de diluição vector quando a percentagem de células GFP positivas e quantidade do vetor estão em uma relação linear. Escolha o clone celular com a maior produção viral para aplicações subseqüentes.
4. Produzir e concentrado Vetores Lentivirus
- Culturas da linha de célula produtora (LV-mGFP) em 15 cm de pratos de cultura de tecidos.
- Tripsinizar as células produtoras e de células em pratos de placas de cultura de tecidos de 15 cm a mais do que 90% de confluência em D10 fresco sem doxiciclina. Alterar médio com frescos, D10 pré-aquecido por dia.
- No momento da produção de pico viral (conforme determinado pelo utilizador), a colheita do sobrenadante viral e filtrá-la utilizando um filtro de 0,45 mícrons. Carrega-se o sobrenadante filtrado para 32,5 ml de tubos de parede grossa ultracentrífuga, selar com parafilme e centrifugar a 50.000 xg, a 4 ° C durante 90 min. Ressuspender cuidadosamente o sedimento em 50 mL ou um volume adequado de PBS ou HBSS, dependendo da aplicação. </ Li>
5. Imunização de camundongos in vivo e análise da resposta imune antígeno-específica
- Produzir vírus de alto título, conforme descrito na seção 4.
- Injectar ratinhos BALB / c (6-8 semanas de idade, fêmea) através de uma via da almofada da pata com a suspensão do vetor (25 ul por pata).
- 2 semanas após a imunização, o baço e isolar os esplenócitos de colheita. Culturas esplenócitos com GFP epitopos peptídeos e análise da presença da GFP específica de células T CD8 +, utilizando a coloração de citocinas intracelulares, conforme descrito anteriormente 17 (Figura 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A linha celular estável descrito no presente método pode produzir grandes quantidades de vectores lentivirais que são especificamente orientadas para as células dendríticas. Como mostrado na Figura 1B, o isolamento de clones individuais proporcionou linhas de qualidade variável 12 celulares estáveis. Dos 26 clones testados, 8 produzida partículas lentivirais com um título superior a 10 6 unidades de transdução por ml (TU / ml), que é um ponto de referência comum para lentivirais SVG pseudotipado produzidas por transfecção transitória. Ao mesmo tempo, vários clones produziam menos do que 4 10 TU / ml, que é importante para isolar clones múltiplos, a fim de obter um forte produtor.
Um clone produzido fiável lentivirais com um título maior do que 7 10 TU / ml. Testes adicionais sobre este clone demonstrou que este nível de produção virai foi estável durante vários dias, afectada pela presença / ausência de soro no meio de cultura, e umachievable em células cultivadas por mais de 3 meses (Figura 2) 12.
Para confirmar que estes vírus não foram eficazes apenas in vitro, foram também utilizados para imunizar ratinhos. Análise da resposta imunitária específica para o GFP por coloração de citocinas intracelulares descobriram que estavelmente produzido DC-LV poderia estimular a expansão da GFP específica de células T CD8 + para cerca de 4% de todos os esplenócitos CD8 + (Figura 3) 12.
Figura 1. A geração de células produtoras de vector lentiviral tetraciclina-regulados. (A) esboço esquemático do processo de fazer células produtoras de vector lentiviral DC-alvo, incluindo a transdução de linhas de GRP com um vector retroviral containing o gene do envelope SVGmu e transfecção do gene de interesse (vector viral) por transfecção concatemeric. (B), os clones individuais seleccionados por tratamento zeocina foram expandidas ao longo de 1-2 semanas, e o título do sobrenadante viral foi medida 3 dias após a remoção de doxiciclina. Como mostrado, os títulos virais variaram amplamente pelo clone. (C) mapas plasmídicos. O vector virai do plasmídeo, TL20-GFP, codifica para a proteína fluorescente verde, sob o controlo de um promotor do vírus de murino em células estaminais e o genoma do vector sob o controlo de um promotor reprimível da tetraciclina. PGK-ble codifica o gene de resistência zeocina (Sh ble), sob a constitutivo fosfoglicerato quinase um promotor (PGK). Retro-SVGmu contém a glicoproteína SVGmu sob o apertado elemento responsivo tet P. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Características de produção de vector viral. (D) Após a remoção da DOX, o vector título viral de sobrenadantes de cultura foi medida a cada dia durante 7 dias. Produção de vírus chegou entre 48-72 horas após a indução. As células cultivadas em meio isento de soro produziu quase tanto como os vírus cultivados com 10% de FBS. (B) células produtoras foram cultivadas ao longo de 3 meses, e as alíquotas foram testadas periodicamente para a produção de vírus. Não foi observada nenhuma perda significativa da produção de vírus.
Figura 3. Lentivirais produzidos por linhas celulares de DC-alvo estáveis podem selectivamente transduzir DC in vitro e para gerar uma resposta imunitária in vivo. <strong> (A), células dendríticas rato derivadas de medula óssea foram infectadas com VE-GFP e expressão da GFP foi medida por citometria de fluxo. A expressão da GFP era específico para células CD11c +, que incluem as células dendríticas. (B) Os ratinhos foram imunizados com 2 x 10 7 de TUs purificado e concentrado LV-GFP. Duas semanas mais tarde, cerca de 4% de todas as células T CD8 + foram activadas e expresso de IFN-y em resposta à apresentação do péptido dominante GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, nós descrevemos um processo para a produção de grandes quantidades de vectores lentivirais que utilizam células 293T transduzidas estavelmente com todos os componentes sob a lentivirais tet off sistema regulador. Até à data, a maioria dos protocolos para a produção de vectores lentivirais dependem de fosfato de cálcio padrão de transfecção transiente (ver 18, por exemplo). Esta abordagem tem sido bem sucedida em escala clínica, mas pode sofrer de algumas limitações que não possam estar presentes em intensificação de produção a partir de linhas celulares estáveis. Por exemplo, a co-transfecção com uma grande quantidade de plasmídeos LV teoricamente poderia aumentar a probabilidade para o desenvolvimento de replicação competente lentivírus 19. Além disso, as transfecções transientes são mais propensos a produzir resultados variáveis em grande escala do que a utilização de uma linha produtora estável devido às grandes quantidades de entradas de ADN necessárias 12. Sob as condições corretas, tais linhas de produção têm sido usados para gerar outra γ-retrovetores virais em grandes escalas 20,21. No entanto, estudos utilizando linhas de produtores lentivirais são limitados, e, portanto, a inclusão de 22 ensaios robustos para detectar a replicação de lentivírus competente será crítico para o desenvolvimento de qualquer linha de células para utilização clínica.
Outros grupos têm publicado descrições das linhagens estáveis produtoras de lentivírus 6-11,23. No entanto, uma limitação comum desses relatórios é que muitos deles dependem de transdução das células produtoras com lentivirais que codificam o gene de interesse, o que pode reduzir a sua segurança para uso clínico. Aqui, utilizamos o método de transfecção variedade concatemeric 11 a transdução de células que podem produzir lentivírus auto-inativação. Além disso, a utilização do sistema de desconto tet melhora a adequação do método para a utilização clínica. Este sistema de regulamentação impede que a toxicidade de SVGmu durante a manutenção da cultura celular e permite a recolha de lentivirais sob Antibiotcondições ic-livres.
Durante o procedimento, é importante que os trabalhadores de laboratório utilizar as precauções adequadas ao manusear os vetores lentivírus. Lentivirais são derivados de HIV-1, um patógeno humano, e todos os procedimentos devem ser realizados sob a orientação de uma comissão de biossegurança instituição. De acordo com o NIH, BL2 contenção é geralmente apropriada para trabalhar com sistemas de lentivírus avançadas, tais como a descrita aqui, apesar de maior contenção BL2 pode ser indicada se os experimentos são ampliados para a prática clínica 24.
Existem várias etapas críticas do processo que necessitam de cuidados especiais. Primeiro, a cultura de células deve ser realizada com grande atenção aos detalhes. Descobrimos que os títulos de vírus diminuir visivelmente se células produtoras não são repicadas a cada 24 horas. Da mesma forma, alguns lotes de FBS pode levar a quedas significativas na produção de vírus, por isso é importante testar vários lotes de FBS befminério de ampliação de um experimento. A selecção de um clone que pode produzir títulos elevados de vírus é essencial para as aplicações a jusante. De acordo com o trabalho anterior de 25, verificou-se que os clones que parecem dividem mais rapidamente tendem a produzir mais vírus. Uma vez que um clone de título elevado foi encontrado, essas células devem ser aliquotada e congelada em FBS + DMSO a 10% o mais rapidamente possível. Em seguida, utilizando aliquotas recentemente descongelados ajuda a gerar o título mais elevado possível. Seguindo esta regra, temos tido o maior sucesso produzindo vírus através transfections transitórios, e esperamos que a manutenção semelhante linha celular irá beneficiar as células produtoras de vírus estáveis.
Principal limitação deste método é que ele exige uma quantidade significativa de esforço da frente para cima para gerar uma linha produtora estável. Assim, não é susceptível de ser apropriado em situações em que vários tipos de vectores lentivirais será testado. Transfections transitórios pode ser mais conveniente para thesde e tipos de aplicações. Em geral, prevê a utilização deste método para gerar grandes quantidades de vector virai após o vector já foi testada num formato pequeno. Outra limitação da nossa linha celular específica é que os vectores produzidos pelas células de GPRS só será específica para células que expressam DC-SIGN, porque a proteína do envelope, SVGmu, liga-se a este receptor. Para atingir outros receptores celulares, o procedimento pode ser modificado através da introdução de outros plasmídeos de glicoproteínas para a linha celular original é GPR. Da mesma forma, outros genes de interesse pode ser transfectado nas linhas celulares produtoras de modo que os vectores lentivirais podem administrar proteínas mais relevantes do que a GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao para contribuir com dados para este manuscrito. Também reconhecemos Dr. John Gray para os generosos presentes de reagentes utilizados neste estudo. PB é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Centro Nacional do Câncer. Esta pesquisa foi suportada por concessões do National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), uma bolsa da Fundação Bill e Melinda Gates, uma bolsa de aceleração translacional do Centro Conjunto de Medicina Translacional e uma bolsa da Califórnia HIV / AIDS Programa de Pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
