Summary
Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.
Abstract
Los vectores lentivirales (LVs) son un poderoso medio de la entrega de material genético a muchos tipos de células. Debido a los problemas de seguridad asociados a estas VIH-1 vectores derivados, produciendo grandes cantidades de LV es un reto. En este trabajo se presenta un método para la producción de títulos elevados de LV libre inactivar. Nos retroviral transducir la Tet-Off productor estable la línea celular GPR para generar una línea celular, GPRS, que pueden expresar todos los componentes virales, incluyendo una glicoproteína específica de célula dendrítica, SVGmu. A continuación, utilizamos la transfección de ADN concatemeric para transfectar el plásmido que codifica la transferencia de LV un gen reportero GFP en combinación con un marcador seleccionable. Varios de los clones resultantes pueden producir LV a un título 10 veces mayor que lo que logramos con transfección transitoria. Además, estos virus transducen eficazmente células dendríticas in vitro y generan una fuerte respuesta inmune de células T a nuestra antígeno reportero. Este método puede ser una buena opción FOr produciendo fuertes LV vacunas basadas en los estudios clínicos de cáncer o enfermedades infecciosas.
Introduction
Muchos sistemas de vectores se han desarrollado para la entrega de genes. Los vectores basados en lentivirus han estado entre el sistema viral más comúnmente estudiada. Estos vectores son ventajosas, ya que pueden transducir eficientemente tanto que se dividen y no se dividen las células 1, conseguir la expresión a largo plazo debido a la integración en el genoma huésped, exhibir una baja inmunidad anti-vector natural en la mayoría de las poblaciones humanas 2, y tienen un bajo potencial de genotoxicidad de mutagénesis de inserción 3,4.
Producción de lentivirus siempre ha sido coloreado por las preocupaciones de seguridad. Los vectores lentivirales se derivan generalmente de VIH-1, el agente etiológico del SIDA. La transfección transitoria de los componentes individuales de la lentivirus (transferencia, sobre, y los plásmidos de embalaje) es un medio común y flexible de la entrega de material genético en el laboratorio. Sin embargo, la ampliación de las transfecciones transitorias para la aplicación clínica es engorroso y may conducir al desarrollo de lentivirus con capacidad de replicación 5,6. Para superar estos obstáculos, varios envases estable y líneas celulares productoras se han desarrollado 6-11. Una de estas líneas, la línea de envasado GPR 11, tiene la ventaja de ser atractivo regulado por tetraciclina. En este trabajo se demuestra cómo adaptar este sistema para producir auto-inactivación de vectores lentiviral que se dirigen específicamente a las células dendríticas (DC-LV) 12.
Las células dendríticas (DC) son las más robustas células presentadoras de antígenos del sistema inmune. Han sido objeto de gran interés en el desarrollo de vacuna contra el cáncer, ya que inician directamente, programa, y regulan las respuestas inmunes específicas de tumor 13. La incorporación de un protocolo de vacunación para incluir a los DC tiene el potencial de provocar una respuesta inmune antitumoral más fuerte que las vacunas de péptidos o ADN. Recientemente, se ha desarrollado un vector lentiviral que specifically dirige a las células dendríticas a través de una glicoproteína del virus de Sindbis modificado, SVGmu 14. Estos vectores son únicos en cuanto a que muestran una alta especificidad para células dendríticas y generan respuestas inmunes más fuertes que los vectores no específicos, VSVG-pseudotyped.
Aquí, se presenta un método para la producción de grandes cantidades de estos vectores lentiviral DC-dirigidos. Se demuestra que estos DC-LV puede infectar a los DC y generar fuertes T CD8 + respuestas inmunes celulares. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo con humanidad, en virtud de la aprobación de la USC Intitutional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Para llevar a cabo experimentos in vivo y clínica, es fundamental para crear una línea de células que pueden producir virus en una alta concentración. Realización de las etapas de transducción y transfección exactamente como se describe será maximizar las posibilidades de la generación de dicho clon.
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Protocol
DC-LV células productoras estables se construyen sobre la base de la línea de envasado 11 células GPR que contiene los componentes necesarios lentiviral gagpol, rev y el sistema tet-off. En primer lugar, la transducción retroviral se utiliza para generar una línea celular de empaquetamiento GPRS que codifica una glicoproteína SVGmu tet-dependiente. Entonces, concatemer array transfección se utilizó para transfectar la línea celular GPRS con un vector lentiviral transgén como GFP. Esta línea celular productora estable, designado como LV-MGFP, se puede probar in vitro e in vivo por su capacidad para producir una vacuna CC-LV frente a GFP.
1. Generación de una línea celular SVGmu Tet-dependiente
El plásmido PRX-SVGmu es un constructo en el que SVGmu glicoproteína DC-específica es clonado corriente abajo del promotor TTA-avanzada de plásmido retroviral pRetroX-Tet-Off 1 (Figura 1C). Cultura células 293T en D10 (medio de Eagle modificado de Dulbecco con10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina). Cultura GPR línea celular de empaquetamiento en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml). Todas las células se cultivan en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO 2.
- 16-18 h antes de la transfección transitoria, placa de 2 x 10 6 células 293T en 4 ml de D10 en una placa de cultivo tisular de 6 cm de tal manera que las células se acercan a 90% de confluencia en el momento de la transfección.
- La transfección de plásmidos retrovirales: mezcla 100 l 1,25 M CaCl2 solución, agua Milli-Q estéril y los siguientes plásmidos: 5 mg PRX-SVGmu, 2,5 g PGAG-Pol, 2,5 g pVSV-G. El volumen final es de 500 l. Para un tubo de poliestireno ml de fondo redondo de 5, añadir 500 l de 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM de KCl, 12 mM de Dextrosa, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7,05). Añadir gota a gota la mezcla de plásmido en el tampón HBS 2X mientras se burbujeaba el tampón vigorosamente con una pipeta Pasteur de vidrio. Después de añadir el mixture, continúe burbujeando durante otros 30 segundos. A continuación, añadir toda la mezcla sobre las células 293T en la placa de cultivo de 6 cm, y se incuba a 37 ° C.
- 4 horas después de la transfección, vuelva a colocar cuidadosamente el medio en la placa de cultivo con 4 ml de D10 precalentado.
- Girar la infección: 48 h después de la transfección, la cosecha SVGmu-que codifica partículas retrovirales en el sobrenadante por el que pasa el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras-. Placa de las células empaquetadoras GPR en una placa de 24 pocillos a 2 x 10 4 células / pocillo. Añadir filtró el sobrenadante a células de empaquetamiento GPR en el plato (2 ml / pocillo) y las células de centrifugación durante 90 min a 1050 x g y 25 º C. Cambio de medio en D10 fresco con doxiciclina (1 ng / ml) después de spin-infección (2 ml / pocillo).
- 72 horas después de la transfección, expandir el cultivo de las células transducidas de embalaje en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 ng / ml).
- Para confirmar la expresión de SVGmu, cultivar las células sin doxiciclina durante 48 horas. Mida ex superficiesión de SVGmu con citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-Sindbis suero. Estas células son designadas como línea celular de empaquetamiento GPRS.
2. Construir DC-LV células productoras de matriz concatemer Transfección
Lentiviral transferencia de plásmido TL20-GFP es un auto-inactivación lentiviral vector de transferencia de plásmido basado en pCL20c-MSCV-GFP con un sistema de Dox-regulable genoma viral ARN expresión y la sustitución del citomegalovirus (CMV), potenciador con 7 operadores tet (Figura 1C) 11 , 12,15. Plásmido PGK-ble es un resistente casete bleomicina (BLE), impulsados por la debilidad del promotor PGK 2.
- Resumen 20 g TL20-GFP plásmido con la enzima de restricción SfiI en 50 ° C. Resumen 20 g plásmido PGK-ble con PflMI a 37 ° C.
- Purificar los fragmentos de ADN (el casete PGK-ble de 1011 pb y el vector TL20-GFP es 6861 pb) mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Ligar el vector TL20-GFP y PGK-casete ble en una relación molar de 25:1 (NEB ADN ligasa de T4). Incubar toda la noche a temperatura ambiente.
- Después de la ligación durante la noche, purificar ADN a partir de la mezcla de ligación (Qiagen DNeasy Tissue Kit y sangre). Asegúrese de que la cantidad de ADN purificado es de alrededor de 5 g.
- 16-18 h antes de la transfección, las células de la placa de embalaje GPRS en una placa de cultivo tisular de 6 cm de tal manera que la confluencia será de aproximadamente 90% en el momento de la transfección.
- Usar el método de transfección con fosfato de calcio descrito en el paso 1.2 para transfectar 5 ug del ADN concatemeric purificada en las células de empaquetamiento GPRS en la 6 cm de placa de cultivo tisular. 4 horas después de la transfección, quitar cuidadosamente el medio y reemplazar con 4 ml de D10 precalentado con doxiciclina (1 ng / ml).
- 48 h después de la transfección, cambiar el medio en D10 con doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml). Seleccionar para clones transfectados mediante la adición de zeocina (50 g / ml) en el medio de cultivo. Cultivar las células durante aproximadamente 2 semanas hasta celular colonizaciónES se puede ver en la parte inferior de los platos.
- Etiquetar las colonias de células en la parte inferior de los platos. Tome placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, el número de los pocillos y añadir a cada pocillo 2 ml de D10 que contiene zeocina (50 g / ml), doxiciclina (1 ng / ml), y puromicina (2 g / ml). Aspirar el medio de las células transducidas, a continuación, añadir una gota de tripsina en cada una de las colonias por menos de un minuto. A continuación, añadir una o más gotas de D10 en las mismas colonias. Recoger las colonias una a una con una pipeta y transferirlos en pocillos separados de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
- Cultura y expandir todos los clones de células en D10 que contiene zeocina (50 g / ml), doxiciclina (1 ng / ml) y puromicina (2 g / ml) para la evaluación de la capacidad productora de viral.
3. Evaluar Viral producción de cada clon celular
- Tripsinizar las células productoras y la placa de alrededor de 4x10 6 células en 6 cm de placa de cultivo tisular de D10 sin doxiciclina tal que la confluenciaexcede 90%. Reemplazar el medio con D10 precalentado fresco todos los días y se recoge el medio para el ensayo de título de 72 horas después de la eliminación de DOX.
- Se recoge el sobrenadante viral por filtración el medio con un filtro de 0,45 micras-.
- Las células diana que expresan el receptor de placas DC-SIGN (por ejemplo, 293T.hDC-SIGN o de médula ósea de ratón derivados de células dendríticas 16) y 293T como control negativo en placas de cultivo de 96 pocillos, 1 x 10 4 células / pocillo. Añadir diluciones seriadas de 2 veces del sobrenadante viral a los pocillos (100 l / pocillo). Por lo general, 6-8 diluciones son suficientes para alcanzar el rango en el que las células transducidas GFP-positivas están en una relación lineal con la cantidad de virus añadido.
- Centrifugar las células y reemplazar el medio como se ha descrito en el paso 1.4. BMDCs deben ser cultivadas en medio RPMI con 10% de FBS y GM-CSF (01:20 J558L medio acondicionado).
- Medir la expresión de GFP en células transducidas por citometría de flujo de 4-6 días después de la transducción. El vecto lentiviralr título se calcula en el intervalo de dilución del vector cuando el porcentaje de células positivas para GFP y la cantidad de vectores están en una relación lineal. Elige el clon celular con la producción viral más alta para aplicaciones posteriores.
4. Producir y Concentrado vectores lentiviral
- Cultura de la línea celular productora (LV-MGFP) en 15 cm de placas de cultivo de tejidos.
- Tripsinizar las células productoras y las células de la placa en placas de cultivo tisular de 15 cm a más de 90% de confluencia en D10 fresco sin doxiciclina. Cambio medio con frescos D10, precalentado a diario.
- En el momento de la producción viral pico (según lo determinado por el usuario), cosechar el sobrenadante viral y filtrarla utilizando un filtro de 0,45 micras-. Cargar el sobrenadante filtrado de pared en tubos de ultracentrífuga 32,5 ml gruesas, sellar con parafilm y se centrifuga a 50.000 xg, 4 º C durante 90 min. A fondo resuspender el precipitado en 50 l o un volumen apropiado de PBS o HBSS dependiendo de la aplicación. </ Li>
5. Inmunizar ratones in vivo y analizar la respuesta inmune específica de antígeno
- Producir virus de alto título como se describe en la sección 4.
- Inyectar ratones BALB / c (6-8 semanas de edad, hembra) a través de una ruta almohadilla de la pata con la suspensión de vector (25 l por almohadilla de la pata).
- 2 semanas después de la inmunización, aislar esplenocitos del bazo y la cosecha. Esplenocitos de cultivo con GFP epítopo péptidos y analizar la presencia de GFP-específica linfocitos T CD8 utilizando tinción intracelular de citoquinas +, como se ha descrito anteriormente 17 (Figura 3B).
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Representative Results
La línea celular estable descrito en este método puede producir grandes cantidades de vectores lentivirales que están dirigidos específicamente a las células dendríticas. Como se muestra en la Figura 1B, el aislamiento de clones individuales produjo líneas celulares estables de calidad variable 12. Entre 26 clones ensayados, 8 produce partículas lentivirales a un título mayor de 10 6 unidades de transducción por ml (UT / ml), que es un punto de referencia típica para los vectores lentivirales SVG-pseudotyped producidas por transfección transitoria. Al mismo tiempo, varios clones produjeron menos de 10 4 TU / ml, es importante aislar múltiples clones con el fin de obtener un productor fuerte.
Un clon producido fiable vectores lentivirales en un título mayor de 10 7 TU / ml. La prueba adicional de este clon demostró que este nivel de producción viral fue estable durante varios días, no afectado por la presencia / ausencia de suero en el medio de cultivo, y unchievable en células cultivadas durante más de 3 meses (figura 2) 12.
Para confirmar que estos virus no sólo eran eficaces in vitro, que también se utilizaron para inmunizar ratones. Análisis de la respuesta inmune específica de GFP mediante tinción intracelular de citoquinas encontró que de forma estable producido DC-LV podría estimular la expansión de GFP-específica las células T CD8 + a casi el 4% de todos los esplenocitos CD8 + (Figura 3) 12.
Figura 1. Generación de células productoras de vector lentiviral regulado por tetraciclina. (A) Representación esquemática del procedimiento para la fabricación de células productoras de vectores lentivirales DC-específicas, incluyendo la transducción de líneas de GRP con un cont vector retroviralaining el gen de la envoltura SVGmu y la transfección del gen de interés (vector viral) mediante transfección concatemeric. (B) los clones individuales seleccionados por el tratamiento zeocina se ampliaron durante 1-2 semanas, y el título del sobrenadante viral se midió 3 días después de la eliminación de doxiciclina. Como se muestra, los títulos virales varían ampliamente según el clon. (C) Mapas plásmido. El vector viral plásmido, TL20-GFP, codifica proteína fluorescente verde bajo el control de un promotor de virus de células madre murina y el genoma del vector bajo el control de un promotor reprimible por tetraciclina. PGK-ble codifica el gen de resistencia a zeocina (Sh ble), bajo la fosfoglicerato quinasa constitutiva 1 promotor (PGK). Retro-SVGmu contiene la glicoproteína SVGmu bajo la estrecha elemento sensible a tet P. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Características de la producción de vectores virales. (A) Después de la eliminación de DOX, el vector de título viral de sobrenadantes de cultivo se midió cada día durante 7 días. La producción de virus alcanzó su punto máximo entre los 48 a 72 h después de la inducción. Las células cultivadas en medios libres de suero producidos casi tanto como los virus de la cultivaron con 10% de FBS. (B) Las células productoras se cultivaron más de 3 meses y se ensayaron alícuotas periódicamente para la producción de virus. No se observó ninguna pérdida significativa de la producción de virus.
Figura 3. Los vectores lentivirales producidos por las líneas celulares de DC-específicas estables pueden transducir selectivamente los DC in vitro y generar una respuesta inmune in vivo. <fuerte> (A) las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón fueron infectadas con LV-GFP y la expresión de GFP se midió con citometría de flujo. Expresión de GFP fue específico para las células CD11c +, que incluyen células dendríticas. (B) Se inmunizaron ratones con 2 x 10 7 unidades de formación de purificada y concentrada LV-GFP. Dos semanas más tarde, casi el 4% de todas las células T CD8 + se activaron y se expresa IFN en respuesta a la presentación del péptido dominante GFP.
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Discussion
Aquí, hemos esbozado un método para producir grandes cantidades de vectores lentiviral utilizando células 293T transducidas establemente con todos los componentes de lentivirus bajo el tet fuera del sistema regulatorio. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos para producir vectores lentivirales se basan en fosfato de calcio transfección transitoria estándar (ver 18, por ejemplo). Este enfoque ha tenido éxito a nivel clínico, pero puede sufrir de algunas limitaciones que no puedan estar presentes en la ampliación de la producción de líneas celulares estables. Por ejemplo, la co-transfección con grandes cantidades de plásmidos LV en teoría podría aumentar la posibilidad para el desarrollo de la replicación del lentivirus competente 19. Además, las transfecciones transitorias son más propensos a producir resultados variables a gran escala de la utilización de una línea de productor estable debido a las grandes cantidades de entradas de ADN requeridas 12. Bajo las condiciones adecuadas, estas líneas de producción se han utilizado para generar otros γ-retrovectores virales en grandes escalas 20,21. Sin embargo, los estudios que utilizan líneas de productores lentiviral se limitan, y por lo tanto la inclusión de ensayos robustas 22 para detectar la replicación del lentivirus competente serán críticos en el desarrollo de cualquier línea celular para uso clínico.
Otros grupos han publicado descripciones para lentivirus productoras de líneas celulares estables 6-11,23. Sin embargo, una limitación común de estos informes es que muchos de ellos se basan en la transducción de las células productoras con vectores lentivirales que codifican el gen de interés, lo que puede reducir su seguridad para el uso clínico. Aquí, utilizamos el método de transfección matriz concatemeric 11 para la transducción de células que pueden producir lentivirus libre inactivar. Por otra parte, el uso del sistema de tet mejora la aptitud del método para el uso clínico. Este sistema de regulación impide la toxicidad de SVGmu durante el mantenimiento del cultivo celular y permite la colección de vectores lentivirales bajo Antibiotcondiciones ic-libres.
Durante el procedimiento, es importante que el personal de laboratorio tomando las precauciones adecuadas al manipular los vectores lentiviral. Lentiviral vectores se derivan de VIH-1, un patógeno humano, y todos los procedimientos deben realizarse bajo la supervisión de un comité de bioseguridad institución. De acuerdo con el NIH, BL2 contención es generalmente apropiado para trabajar con sistemas avanzados de lentivirus tales como el que se describe aquí, aunque mejorada contención BL2 puede estar indicado si experimentos se escalan para la práctica clínica 24.
Hay varios pasos críticos en el procedimiento que requieren un cuidado especial. En primer lugar, el cultivo celular se debe realizar con gran atención al detalle. Hemos encontrado que los títulos de virus disminuyen notablemente si las células de productores que no se someten a pasadas cada 24 horas. Del mismo modo, algunos lotes de FBS puede conducir a una disminución significativa en la producción de virus, por lo que es importante probar varios lotes de FBS befmineral de la ampliación de un experimento. La selección de un clon que pueden producir altos títulos de virus es esencial para las aplicaciones posteriores. De acuerdo con el trabajo previo 25, hemos encontrado que los clones que parecen dividirse más rápidamente tienden a producir más virus. Una vez que se ha encontrado un clon de alto título, estas células deben dividen en partes alícuotas y se congelaron en FBS + 10% de DMSO tan pronto como sea posible. Entonces, usando alícuotas recién descongeladas ayuda a generar el título más alto posible. Siguiendo esta regla, hemos tenido más éxito la producción de virus mediante transfecciones transitorias, y esperamos que el mantenimiento de la línea de células similares se beneficiará virus de las células productoras estables.
Principal limitación de este método es que requiere una cantidad significativa de esfuerzo hasta delante para generar una línea productora estable. Por lo tanto, no es probable que sea apropiada en situaciones en las que se probaron varios tipos de vectores lentivirales. Las transfecciones transitorias pueden ser más convenientes para thestipos de aplicaciones electrónicas. Prevemos generalmente el uso de este método para generar grandes cantidades de vector viral después el vector ya ha sido probado en un formato pequeño. Otra limitación de nuestra línea celular específica es que los vectores producidos por las células de GPRS sólo serán específicos para las células que expresan DC-SIGN porque la proteína de la envoltura, SVGmu, se une a este receptor. Para dirigirse a otros receptores celulares, el procedimiento puede ser modificado mediante la introducción de otros plásmidos de la glicoproteína en la línea celular original de GPR. Del mismo modo, otros genes de interés pueden ser transfectados en las líneas celulares productoras de modo que los vectores lentivirales pueden entregar las proteínas más relevantes de GFP.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Michael Chou, Bingbing Dai, y Liang Xiao para aportar datos de este manuscrito. También se agradece al Dr. John Gray por las generosas donaciones de los reactivos utilizados en este estudio. PB es apoyado por una beca postdoctoral del Centro Nacional del Cáncer. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01AI68978, P01CA132681 y RCA170820A), una subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates, una subvención aceleración traslacional del Centro Conjunto para la Medicina Traslacional y una subvención de la epidemia de VIH / SIDA de California Programa de Investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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