Artigo de método

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

DOI:

10.3791/50772

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23 de setembro de 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Resumo

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Métodos para a rápida imobilização superfície de pequenas moléculas bioativas com controle sobre orientação e densidade de imobilização são altamente desejáveis ​​para aplicações de biossensores e microarray. Neste estudo, nós usamos um covalente bioorthogonal altamente eficiente [4 +2] reação de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir a imobilização microfluídicos de moléculas TCO / Tz-derivados . Nós monitoramos o processo em tempo real, em condições de fluxo contínuo, utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Para permitir a imobilização reversível e estender o intervalo experimental de a superfície do sensor, que combinam um componente de captura de antígeno-anticorpo não-covalente com a reacção de cicloadição. Ao apresentar alternadamente TCO ou Tz metades à superfície do sensor, vários processos de captura de cicloadição são agora possíveis em uma superfície do sensor para montagem on-chip e interação estudos de uma variedade de estruturas multi-componentes. Nós illustrate este método com duas experiências diferentes de imobilização sobre um chip de biossensor; uma molécula pequena, AP1497, que liga a proteína de ligação de FK506 12 (FKBP12), e a mesma molécula pequena, como parte de uma nanopartícula funcionalizado situ imobilizada e em.

Introdução

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Reações de conjugação eficientes são ferramentas valiosas para a fixação de moléculas bioativas em superfícies para uma variedade de aplicações biotecnológicas. Recentemente, o bioorthogonal muito rápido [4 +2] de reacção de cicloadição entre trans-cicloocteno (TCO) e 1,2,4,5-tetrazina (Tz) tem sido utilizado para marcar as superfícies das células, estruturas subcelulares, anticorpos e nanopartículas 1. - 7 Aqui, usamos o [4 +2] reação de cicloadição em combinação com captura de antígeno / anticorpo (GST / anti-GST) para síntese reversível on-chip de estruturas multi-componentes para a superfície Plasmon Resonance (SPR) análise da interação e monitorar o processo em tempo real (Figura 1). 8,9 Notavelmente, a estratégia de captura de cicloadição permite a regeneração da superfície utilizando um protocolo estabelecido. 8 Consequentemente, a montagem de superfícies de sensores estáveis ​​com controlo sobre a orientação e densidade de ligando para a variedade de ensaio novo formatos é agora possível. Utilizaçãoesta estratégia que demonstram a imobilização de moléculas pequenas TCO / Tz derivatizados e caracterizar as taxas de cicloadição de uma variedade de condições de tampão. Escolhemos a interacção conhecida entre FKBP12 e AP1497 uma molécula que se liga a FKBP12 10-12 por exemplo, para verificar se a estratégia de captura de cicloadição preserva a capacidade da molécula pequena de interagir com o seu alvo, quer directamente, quando ligado a antigénios GST imobilizadas ou nanopartículas imobilizadas (NPS).

Este método proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, a imobilização reversível de pequenas moléculas em chips sensores agora é possível. Em segundo lugar, TCO / Tz imobilização de pequenas moléculas também permite estudos de interacção livre de rótulo que revertem a orientação de estudos SPR canônicas, e pode fornecer uma visão complementar de uma interação de ligação. Em terceiro lugar, este método permite a síntese de microfluidos de nanopartículas alvo, e a avaliação imediata da sua bindinpropriedades g. Este promete melhorar a eficiência da avaliação ou triagem nanopartículas alvo, e também diminuir as quantidades requeridas de nanopartículas. 13-15 Em quarto lugar, esta abordagem pode medir a cinética de reacção de reacções de cicloadição bioorthogonal em tempo real, sob fluxo contínuo. Finalmente, a imobilização química do TCO / Tz é robusta na presença de soro. Tomados em conjunto, prevemos que esta abordagem versátil amplamente facilitar a construção de superfícies estáveis ​​sensores para uma grande variedade de estudos microfluídicos com relevância para a in vitro e em aplicações celulares in vivo.

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Protocolo

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1. Preparação de GST e nanopartículas (NP) Conjugados

  1. GST-TCO preparação:
    1. Adicionar 8 mL de solução de TCO-NHS (50 mM em DMSO) a 100 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Retire o excesso de reagente, utilizando uma coluna de spin dessalinização Zeba. O filtrado recuperado contendo o conjugado de GST-TCO é armazenado a 4 ° C antes de usar.
  2. GST-Tz preparação:
    1. Adicionar 6 ml de solução-Tz-NHS (25 mM em DMF) a 75 ul de GST (1 mg / ml em PBS) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Dilui-se a mistura de reacção com 25 ul de PBS e purificar usando uma coluna de spin de dessalinização. O filtrado contendo o conjugado de GST-Tz é armazenado a 4 ° C antes de usar.
    Nota: análises Massa (MALDI-TOF) mostrou que, em média ~ 10 Tz ou TCO moléculas foram conjugado com GST.
  3. NP-TCO preparação:
    1. Adicione 100 ml de solução TCO-NHS (50 mM em DMSO) para150 ul de nanopartículas aminada (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml, em PBS, 3 nm núcleo de ferro Fe ~ 8000 / NP) e agitar a mistura temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Remover o excesso de reagente por filtração em gel utilizando uma coluna NAP-10 eluída com tampão PBS. Recolher o faixa colorida que contém o produto NP-TCO.
    3. Concentra-se o filtrado para um volume final de ~ 150 ul usando um dispositivo de filtro de centrífuga (100 k MWCO).
    4. Adicionar 50 ul de anidrido succínico, (0,1 M em DMSO) para a solução de NP-TCO e agitar à TA durante 1 hora (anidrido reage com quaisquer aminas restantes para formar ácidos carboxílicos terminais. Isto evita interacções não específicas com a superfície de dextrano).
    5. Purifica-se o produto NP-TCO utilizando uma coluna NAP-10, efectuando a eluição com PBS. Armazene a solução de NP-TCO a 4 ° C antes de usar.

2. Preparação da superfície

Todos os ensaios de ressonância de plasma de superfície são realizados num instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a25 ° C, utilizando um chip sensor CM5 e PBS-P como o tampão de corrida a menos que indicado de outra forma. Software de avaliação Biacore Controle e fornecido com o instrumento são empregados para a criação de experimentos e análise de dados. Dois modos de operação, assistentes de aplicativo e executar o manual será utilizado para elaboração e acompanhamento de superfície on-chip de captura de cicloadição. O modo de método construtor será usado para a criação de experiências de orientação de ligação inversa e para medir as taxas de reação de cicloadição. Os dados são o dobro referência subtraído e análises cinéticas são realizadas utilizando um modelo de ligação 01:01 Langmuir.

  1. Use o modelo assistente amina imobilização e selecione a imobilização das células de fluxo 1 (referência) e 2 (detecção). Modificar método amina para activar os grupos carboxílicos na superfície por injecção de uma solução 1:1 de EDC 0,4 M: 0,1 M de NHS para 480 segundos a uma taxa de fluxo de 10 mL / min. Definir a injeção de etanolamina para saciar restantes ésteres activados a 420 seg tempo de contato emuma taxa de fluxo de 10 mL / min.
  2. Nome de entrada ligando, anti-GST (18 mg / ml em tampão acetato, pH 5,0) e ajustado para injectar para um tempo de contacto de 420 seg a uma taxa de fluxo de 10 mL / min.
  3. Coloque os frascos de soluções exigidas em reagente cremalheira 2 certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salvar e iniciar a imobilização.
    Nota: Executar o assistente de imobilização dessa maneira resulta em níveis de imobilização anti-GST na faixa de ~ 14.000 a 17.000 RU.
  4. Edite o assistente de imobilização apenas injetar GST ligante solução (20 mg / ml) para 420 segundos a 5 mL / min ao longo da célula de fluxo de referência 1.

3. Monitoramento On-chip Capture-cicloadição de funcionalizados Moléculas

  1. Monitoramento on-chip de captura de cicloadição em tempo real (Figura 2).
    1. Coloque GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o homemmétodo run ual, defina a taxa de fluxo de 5 mL / min e fluxo caminho para célula de fluxo 2.
    2. Injectar solução de GST-TCO para 420 seg.
    3. Injectar solução de Tz-BnNH 2 para 600 seg.
    4. Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração.
  2. Monitorização de montagem no chip de estruturas multi-componentes em tempo real (Figura 3):
    1. Coloque GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 uM) e regeneração (glicina 10 mM, pH = 2,0) em frascos de solução reagente prateleira 2. Selecione o instrumento método de execução manual, definir a taxa de fluxo de 5 mL / min eo caminho do fluxo de célula de fluxo 2.
    2. Injetar uma solução de GST-Tz para 60 seg.
    3. Injetar uma solução de NP-TCO para 60 seg.
    4. Injetar uma solução de Tz-BnNH 2 para 60 seg.
    5. Regenerar a superfície com duas injecções de 30 seg de solução de regeneração.

4. MCOMPANHAMENTO Densidade Imobilização e Determinação de Preços Cycloaddition

  1. Caracterização de pequenas taxas de reação de cicloadição molécula (Figura 4).
    1. Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel passos de ensaio criar um novo passo e nomeie-Sample. Defina o Objetivo e Conecte configurações de base para amostra.
    2. No painel Tipos Ciclo Crie uma nova etapa do ciclo e inserir os seguintes comandos; Capture, Sample, Regeneração 1 e Regeneração 2.
    3. Seleccione o comando de captura; nome ligando de entrada (GST-TCO, 20 ug / ml), o tempo de contacto de 120 s a 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o comando Amostra; entrada 180 seg Tempo de contato, 60 seg tempo de dissociação, a taxa de fluxo de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos. Selecione o comando Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para Regeneração 2 de comando.
    4. Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado e preencha lista de amostras com solução de analito (Tz-BnNH 2) e uma série de concentração (0,3-10 mM, 1:2 diluição). Selecione ao lado de rack painel posição. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4.
  2. Caracterização das taxas de reação de cicloadição NP (Figura 4).
    1. Abra o modelo de método salva por cima e alterar os seguintes parâmetros. Selecione o painel de captura; mudança de nome ligante para GST-Tz, 20 mg / ml. Selecione o painel Amostra; mudança tempo de contato de 120 segundos de tempo de contato e tempo de dissociação a 120 seg.
    2. Selecione a lista de amostra; mudar analito a NP-TCO e séries concentração (7-224 nM, 1:2 diluição). Local frascos de solução em rack de reagente2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Os dados de ligação e análise cinética são apresentados na Figura 4.

5. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Imobilizado

Os estudos de ligação de inversão de orientação empregar FKBP12 como o analito e AP1497 composto como ligando imobilizado (Figura 5). O método geral para este ensaio está configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor:

  1. Selecione o método de entrada e novos parâmetros gerais. No painel etapas de ensaio e criar nome de captura, de amostra e regeneração passos. Selecione Finalidade correspondente e Conecte configurações de base.
  2. Selecione o painel Tipos de ciclo e criar três etapas do ciclo: Capture, Sample e regeneração.
  3. Insira o comando de captura duas vezes na etapa do ciclo de captura. Selecione a captura 1 painel e selecione solução de captura como variablE, o tempo de contacto definido para 300 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Segunda. Selecione o painel de Captura 2 e selecione solução de captura como variáveis, definir o tempo de contato de 250 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second.
  4. Insira o comando da Amostra segundo a etapa do ciclo de amostra. Selecione o painel Amostra; conjunto tempo de contato de 60 segundos, o tempo de dissociação a 200 segundos a uma vazão de 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Ambos.
  5. Insira o comando Regeneração duas vezes sob a etapa do ciclo de regeneração. Selecione o painel Regeneração 1; nome solução de regeneração de entrada (10 mM de glicina-HCl pH 2,0), tempo de contato de 30 segundos a 30 mL / min e definir o caminho de fluxo para: Second. Repita o mesmo para o painel de Regeneração 2.
  6. Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione nomes de soluções de captura de próximos e de entrada (GST-TCO e AP1497-Tz), nome da amostra (FKBP12), série de concentração (0,020 a 5 mg / ml, 1:2 diluição) e MW (13.000). Local frascos de solução em reagent cremalheira 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5.

6. Medir o Binding of FKBP12 para AP1497 Anexado ao Imobilizado PN

O método geral para a imobilização de nanopartículas, pequena molécula derivação e FKBP12 ensaio de ligação é configurado da seguinte forma utilizando a ferramenta método construtor:

  1. Abra o modelo de método salvou de cima e modificar. Insira um comando adicional de captura na etapa do ciclo de captura. Selecione um painel de captação; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 1 (GST-Tz). Conjunto de tempo de contacto de 60 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda. Selecione o painel de Captura 2; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 2 (NP-TCO). Tempo conjunto de contacto de 90 segundos a uma taxa de fluxo de 5 mL / min edefinir o caminho de escoamento para o segundo. Selecione o painel de Captura 3; desmarcar solução de captura como solução de captura variável e nome 3 (AP1497-Tz). Tempo conjunto de contacto de 180 seg a uma taxa de fluxo de 5 mL / min e definir o caminho de fluxo de Segunda.
  2. Selecione Executar Setup e definir o caminho de fluxo para: 2-1. Selecione ao lado duas vezes. Local frascos de solução reagente em rack de 2 e série de diluição em placa de 96 poços certificando-se de combinar os cargos com a lista de conteúdos. Salve modelo método e começar a análise de ligação. Dados da análise cinética são apresentados na Figura 5.

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Resultados

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Os dados e valores foram adaptados de referência 8.

Imobilização reversível eficiente de moléculas pequenas bioactivos com controlo sobre a orientação e densidade desempenha um papel chave no desenvolvimento de novas aplicações de biossensores. Utilizando a reacção bioorthogonal rápido entre TCO e Tz, nós descrevemos um processo para a montagem de forma gradual e, a regeneração da superfície de ligandos, com retenção da actividade biológica. Figura 2 mostra a monitorização e...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método de captura-cicloadição descrita aqui permite a rápida imobilização, reversível de nanopartículas modificadas e pequenas moléculas para a interação baseada em chip sem rótulo e estudos cinéticos. O protocolo de imobilização pode ser realizada em minutos, que requerem <10 uM concentrações de ligandos de pequenas moléculas. Modulando concentração de ligante e densidades de imobilização tempo de contato pode ser rigorosamente controlado. Nossos dados mostram que no chip reações bioorthogonal preservar a capacida...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos financiamento do NIH (NHLBI Contrato n º HHSN268201000044C a RW, SH e SYS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
Chip Sensor CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Kit de acoplamento de aminaGE HealthcareBR-1000-50;
Kit de captura de GSTGE HealthcareBR-1002-23 
Colunas NAP-10GE Healthcare17-0854-01 
GST, liofilizado em 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R& D Systems3777-FK 
Surfactante P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glicina 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Coluna de dessalinização giratória ZebaThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4Filtro centrífugoFisher UFC810096
TCO-OHRef. 8Sintetizado internamente
TCO-NHSRef. 8Sintetizado internamente, *Disponível comercialmente na Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Sintetizado internamente
Tz-NHSRef. 8764701Sintetizado internamente, *Disponível comercialmente na Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Sintetizado internamente
AP1497, AP1497-TzRef. 8Sintetizado internamente
Equipment
SPR BiosensorGE BiacoreT100
100 K de saúde

Referências

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