Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Resumo

O RNA total de alta qualidade foi preparado a partir de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser após a coloração de seções da medula espinhal com Azure B em 70% de etanol. RNA suficiente (~40-60 ng) é recuperado de 3.000-4.000 neurônios motores para permitir a análise de RNA a jusante por RNA-seq e qRT-PCR.

Resumo

A preparação do RNA de alta qualidade a partir de células de interesse é fundamental para análise precisa e significativa das diferenças transcricionais entre os tipos celulares ou entre o mesmo tipo celular em saúde e doença ou seguindo tratamentos farmacológicos. Na medula espinhal, tal preparação a partir de neurônios motores, alvo de interesse em muitas doenças neurológicas e neurodegenerativas, é complicada pelo fato de que os neurônios motores representam <10% da população celular total. A microdisseção de captura a laser (LMD) foi desenvolvida para resolver esse problema. Aqui, descrevemos um protocolo para recuperar rapidamente, congelar e seção da medula espinhal do rato para evitar danos ao RNA por RNases endógenos e exógenos, seguido de coloração com Azure B em 70% de etanol para identificar os neurônios motores, mantendo a RNase endógena inibida. LMD é então usado para capturar os neurônios manchados diretamente no tampão de lise de tiocianato guanidine, mantendo a integridade do RNA. Técnicas padrão são usadas para recuperar o RNA total e medir sua integridade. Este material pode então ser usado para análise a jusante das transcrições por RNA-seq e qRT-PCR.

Introdução

Em tecidos mamíferos compostos por vários tipos de células diferentes, o advento da instrumentação de microdissecção de captura a laser (LMD) proporcionou a possibilidade de selecionar um tipo celular específico para análise no nível de RNA ou proteína. Atualmente, as técnicas de amplificação e sequenciamento de próxima geração permitem o uso de um pool de RNA total de alguns milhares de células para obter um inventário relativamente minucioso do transcriptome, incluindo avaliação dos níveis relativos de RNAs e identificação de várias formas emendadas. Até o momento, as análises proteômicas de alguns milhares de células chegarão apenas a espécies mais abundantes. Por exemplo, identificamos <1.000 das proteínas mais abundantes de 3.000-4.000 corpos de células de neurônios motores (não mostrados), e Zhu e colegas de trabalho relataram recentemente identificar 2.665 proteínas de ~15.000 células tumorais¹. Com mais desenvolvimentos da espectrometria de massa, no entanto, é provável que tais análises se estendam a uma profundidade muito maior.

Aqui, apresentamos um protocolo específico utilizado para LMD de corpos celulares neurônios motores da medula espinhal de camundongos, seguido pela preparação do RNA. Este protocolo foi utilizado no contexto da comparação de RNAs de neurônios motores de camundongos transgênicos pré-síndicos superóxido transgênicos (SOD)1 camundongos de esclerose lateral amiotrófica (ELA) com RNAs preparados a partir de uma cepa transgênica sod1 tipo selvagem tanto pela validação RNA-seq e qRT-PCR². Notavelmente, os neurônios motores, no chifre anterior da matéria cinzenta na medula espinhal, compreendem <10% da população celular total, cercado por um mar de astrócitos, e como tal, seu perfil transcricional não pode ser facilmente desconvolucido de estudos de toda a cordão. Uma abordagem de captura a laser é, portanto, ideal para analisar a expressão de RNA nessas células, com a fisiologia preservada por excisão rápida e congelamento do cabo após breve perfusão salina intracardiac. O neurônio motor somata é grande e, portanto, é facilmente detectável, aqui usando um corante que tem forte afinidade pelos neurônios³. Além disso, com esse tamanho, essas células fornecem uma quantidade relativamente grande de RNA por célula capturada. O procedimento utilizado, conforme detalhado abaixo, poderia ser prontamente ajustado para obter outros tipos de células neuronais, bem como potencialmente outros tipos celulares, especificamente identificados por técnicas de coloração de corantes ou por coloração de anticorpos.

Protocolo

Os procedimentos descritos aqui para anestesia, eutanásia e perfusão cardíaca de camundongos foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale.

1. Preparação de Instrumentos e Soluções sem RNase

1. RNase é um contaminante comum de todas as superfícies de laboratório, incluindo bancadas, micropipettos e o pesquisador.
   1. Troque as luvas com frequência ou limpeza regular com uma solução de descontaminação RNAse.
   2. As ferramentas de dissecção de aço inoxidável e os vidros podem ser disponibilizados sem RNase, aquecendo a > 200 °C por 1 hora ou mais. Nota: A esterilização a vapor não destrói o RNase. Alternativamente, limpe com uma solução de descontaminação RNase, depois com 70% de etanol sem RNase e ar seco.
   3. Limpe os topos de banco, outras superfícies de laboratório e micropipettores com solução de descontaminação RNase, depois com 70% de etanol sem RNase. Designar um banco de laboratório específico ou área de trabalho para recuperação e análise de RNA. Nota: Remova os ejetores de ponta antes de limpar os eixos dos pipettors e deixe-os desligados, se possível.
   4. Use tubos, tubos de microcentrifuuge, pipetas e dicas de micropipette que são certificados pelo seu fabricante para serem livres de RNase. Recomenda-se o uso de dicas de ligação muito baixas e microtubos. Se possível, use caixas ou sacos recém-abertos desses componentes e mantenha-os separados do suprimento geral do laboratório.
   5. Obtenha soluções livres de RNase [PBS livre de cálcio e magnésio (PBS) de Dulbecco de fontes comerciais. Use garrafas recém-abertas para cada experimento.
2. A fonte do corante Azure B é fundamental para a recuperação bem sucedida do RNA intacto. Teste cada lote de corante antes de comprometer amostras preciosas para coloração e coleta. Colete alguns milhares de neurônios de um animal nãoperimental, prepare o RNA e determine a integridade do RNA conforme descrito abaixo para encontrar um que produza consistentemente números de RIN acima de 8,5.
   1. Dissolver o corante Azure B (1%, wt/vol) em 70% de etanol sem RNase, tipicamente 0,3 g em etanol de 30 ml em um tubo de centrífuga de 50 ml. Misture bem em um roqueiro no RT durante a noite ou até que todas as partículas tenham dissolvido. Um tubo desta solução pode ser usado para manchar vários slides sem afetar a intensidade de coloração.
   2. Como precaução, use um tubo diferente de mancha para cada réplica biológica.
3. Use os criomolds e O.C.T. para incorporar seções de cordão sem tratamento adicional.
4. Mantenha o criostat em -20 a -24 °C. Após a secção, coloque os slides em um congelador de -80 °C até que um número suficiente tenha sido preparado. Inicie a preparação do RNA o mais rápido possível após os slides terem sido feitos. Para armazenamento a longo prazo, mantenha blocos OCT não ressutados ou parcialmente seccionados, em vez de slides, a 80 °C.
5. Faça o tampão de tiocianato guanidine para a preparação de RNA a partir dos neurônios motores dissecados usando as soluções fornecidas pelo fabricante do kit de preparação de RNA de acordo com suas instruções.

2. Preparação de seções de medula espinhal de camundongos (Figura 1A)

1. Limpe todas as ferramentas de dissecção, lâminas de vidro, lâminas de barbear e plataforma de dissecção, assando ou limpando com solução de descontaminação RNase, seguida de 70% de etanol sem RNase. Deixe secar por 2 minutos. Mantenha tudo livre de poeira cobrindo com lenços de laboratório.
2. Os procedimentos de manejo animal, incluindo anestesia, perfusão cardíaca e eutanásia, devem ser realizados de acordo com as exigências do Comitê Descuidado e Uso institucional de Animais (IACUC), com o objetivo de levar o animal rapidamente ao ponto de dissecção da medula espinhal.
   1. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (ip) de uma dose letal de Cetamina (450 mg/kg).
   2. Uma vez que um nível profundo de anestesia é alcançado e confirmado pela falta de uma resposta de dedo do pé, posicione o lado ventral do mouse para cima em uma plataforma de dissecção (uma placa de isopor, por exemplo), abra a cavidade torácica para expor o coração, e insira a agulha borboleta de 27 G de uma infusão colocada no ventrículo esquerdo (que está à direita do investigador). Corte o átrio direito com um fórceps afiado, e perfunda com PBS a uma taxa de 5-7 ml/min por cerca de 2 min usando uma bomba peristáltica. O líquido que flui do átrio deve estar em grande parte livre de sangue neste momento.
   3. Remova a agulha de perfusão, decapite o rato e vire-o na placa de dissecção. Abra a pele para expor a coluna vertebral, use pequenas tesouras e fórceps para remover as vértebras, e levante a medula espinhal enquanto corta as raízes nervosas com um fórceps afiado. Velocidade e prática são essenciais na mudança do início da perfusão para a remoção do cabo; isso não deve levar mais de 7 minutos.
   4. Enxágüe o cabo por 10 segundos em água sem RNase para lavar qualquer sangue residual. Coloque a medula espinhal em um deslizamento de vidro sem RNase com um fórceps curvo muito suavemente, mas rapidamente. Divida a medula espinhal transversalmente usando uma lâmina de barbear limpa em 9-10 pedaços.
   5. Coloque as peças em uma criomolda cheia de O.C.T. usando os mesmos fórceps, e alinhe-as verticalmente usando uma agulha limpa. Coloque o molde em uma bandeja rasa contendo 2-metilbutano pré-cozido com nitrogênio líquido, e, em seguida, coloque a bandeja em um banho de nitrogênio líquido para congelar rapidamente as peças da medula espinhal para evitar a degradação do RNA.
   6. Armazene o bloco embutida em OCT a -80 °C por até 6 meses antes da secção. O processo de recuperação do cabo até o congelamento deve ser feito dentro de 5 minutos para manter a integridade do RNA.
3. Cryosection o bloco embutido em O.C.T.a -20 °C com um criostat para produzir fatias de 20 μm, cada uma contendo seções transversais de 9-10 medular, em lâminas pen-membrana de 2 μm sem RNase mantidas inicialmente à temperatura ambiente para garantir que as seções aderam ao slide. Imediatamente recongele a seção em uma superfície de -20 °C dentro do criostat. Mantenha os slides a -80 °C até usar.

3. Coloração de Seções da Medula Espinhal (Figura 1A)

1. Em um rack limpo, organize seis tubos cônicos de 50 ml. Encha todos eles com 25-30 ml de 70% de etanol 70% sem RNase, de modo que a profundidade seja suficiente para cobrir todas as seções em um slide quando o slide estiver imerso. Faça 30-35 ml de solução Azure B de 1% conforme descrito anteriormente e mantenha-o no mesmo rack para minimizar o tempo entre a mudança de soluções durante a lavagem ou a coloração. Mantenha três ou quatro lenços de laboratório na frente do rack para drenar a solução extra rapidamente.
2. Leve os slides para fora do congelador -80 °C em gelo seco. Descongele um slide colocando-o em uma palma de luvas. Remova a maior parte da umidade e condensação no slide limpando-a com um lenço de laboratório, tomando cuidado para não tocar nas seções. Coloque o slide em gel de sílica fresco dessecante em uma placa de Petri por 30-40 seg para secar completamente. Se a umidade do laboratório for alta, um breve tratamento em um dessicator a vácuo pode ser usado para secar o slide mais rapidamente.
3. Lavagem e coloração.
   1. Mergulhe o escorregador seco no primeiro tubo de 70% de etanol sem RNase. Mergulhe o slide por 30 segundos e, em seguida, lave o slide para remover o OCT mergulhando-o para cima e para baixo por 45-60 segundos . Tire o slide da solução e escorra o excesso de líquido nos lenços de laboratório. Repita o mesmo processo mergulhando o slide no segundo tubo de 70% de etanol. Se o OCT em torno das seções da medula espinhal não se foi completamente, repita a lavagem no terceiro tubo.
   2. Depois de drenar o excesso de líquido, submergir o slide em 1% solução Azure B em 70% de etanol livre de RNase por 30-45 segundos. Drenar o excesso de Azure B em um lenço de laboratório; neste ponto, todo o slide será azul.
   3. Submergir o slide no próximo tubo de 70% de etanol, e mergulhar para cima e para baixo rapidamente 3-4x para remover o excesso de corante e para tornar visível a coloração específica do neurônio motor. Se as seções parecerem muito escuras, repita o passo desopareçam em um tubo fresco de 70% de etanol. Se a coloração parecer muito leve, devolva o slide para a solução Azure B por mais 30 segundos e repita o destaining. Limpe o excesso de etanol e o ar seque o slide por ~40 segundos até que todo o líquido se vá. A matéria cinzenta será azul claro, enquanto os neurônios motores serão manchados de azul profundo, que é facilmente visível. Inicie a dissecação imediatamente.

4. Microdisseção de captura a laser (LMD) (Figura 1B)

1. Ligue o microscópio e descarregue o suporte do tubo para fixar a tampa de um tubo de microfuça de 0,6 ml para coleta de amostras. Coloque 30 μl de tampão de tiocianato de guanidina na tampa de um tubo de microfuça de 0,6 ml. Cubra a superfície da tampa com líquido espalhando a solução usando uma ponta de pipeta. Dessa forma, todos os neurônios coletados serão dissolvidos em solução solubilizadora à medida que são dissecados. Alinhe a tampa com o orifício e o objetivo com o software de microscópio. Mantenha a tampa na posição coberta até iniciar a captura a laser.
2. Coloque o slide seco de ar no palco do microscópio LMD de cabeça para baixo, de modo que a membrana do slide PEN fique virada para baixo. A membrana com seções deve enfrentar o orifício, por baixo do qual está o tubo de coleta.
3. Ligue o laser 10 min antes de iniciar a preparação do slide. Concentre-se em uma seção de medula espinhal com o objetivo 5X. Mova-se para o objetivo 20X para dissecção.
   1. Marque uma região "manequim" com a caneta de luz e permita que o laser a corte sem recolhê-la. Isso relaxa a membrana PEN e torna possível marcar e cortar várias regiões sucessivamente.
   2. Refoce e identifique neurônios motores na região do chifre ventral. Esses neurônios são reconhecíveis por sua localização, sua morfologia piramiológica, seu grande tamanho, e sua mancha azul escura com Azure B(Figura 2).
   3. Usando a caneta de luz, selecione a ferramenta de desenho e marque ao longo da borda dos neurônios motores, fazendo um contorno completo. Tente fazer o contorno o mais próximo possível do neurônio motor para evitar contaminação de outras células além do neurônio motor. (Teste algumas seções com antecedência para ver o quão larga é a linha de corte a laser e ajuste a folga conforme necessário.) Marque várias células antes de cortar; o software se lembrará das posições.
   4. Coloque a tampa por baixo da posição de corte clicando na posição da tampa. Clique no botão iniciar para iniciar a dissecção do neurônio motor com o laser. Colete todos os neurônios motores de todas as seções em uma lâmina na tampa de um tubo de microfuça.
   5. Após a coleta ser concluída, retire o tubo de microfuça do suporte descarregando a bandeja e desalojando suavemente o tubo. Dissolva completamente os neurônios motores no buffer, encanar a solução para cima e para baixo. Mova a solução para o corpo do tubo centrifugando a 14.000 x g por 2 min a 4 °C. Congele a amostra imediatamente em gelo seco e armazene-a a -80 °C. Este processo, desde a coloração do slide até a coleta de neurônios motores, deve ser feito dentro de 30 minutos para um slide para minimizar a degradação do RNA.

5. Preparação de RNA a partir de neurônios motores

Descongele todos os neurônios coletados de um animal e os unindo para extrair RNA. As amostras podem parecer pálidas, dependendo do número de neurônios motores (manchados com Azure B) neles. Extrair RNA utilizando um kit adequado de acordo com o protocolo previsto para tecido LMD, eluindo no volume mínimo possível. Leve 1 μl para verificar a quantidade e integridade da amostra. Congele rapidamente o RNA restante em gelo seco e armazene a -80 °C.

6. Determinação da Qualidade e Quantidade do RNA

Determine a qualidade do RNA com a amostra de 1 μl em um chip de microfluido de eletroforese capilar de acordo com o protocolo do fabricante. As preparações totais de RNA com um número de integridade de RNA (RIN) acima de 8,5 podem ser usadas para RNA-seq e qRT-PCR. A saída de dados também inclui normalmente a concentração aproximada da amostra.

Resultados

O protocolo descrito acima e na Figura 1 deve produzir 50 ng ou mais de RNA total com um RIN de >8,5 de 3.000-4.000 corpos celulares de neurônio motor medular dissecados a partir das fatias de 9-10 20 μm em cerca de 20 slides PEN. Como este número de slides representa menos de 10% de um bloco embutido em O.C.T.de uma medula espinhal do rato, é possível retornar ao bloco, que foi armazenado a -80 °C, e cortar mais fatias para passar por outra rodada de preparação de RNA. Se forem necessárias quantidades maiores de RNA para uma análise, é melhor fazer apenas o número de slides (por exemplo, 20) de uma só vez que podem ser processados através de dissecção e preparação de RNA em poucos dias, em seguida, fazer mais slides para uma segunda rodada e combinar os produtos. Certifique-se de verificar o RIN de cada preparação primeiro para evitar combinar um bom com um ruim. Os métodos RNA-seq estão se tornando mais sensíveis e novas tecnologias pcr estão prometendo maior sensibilidade do que as atuais. Assim, menos RNA de menos corpos celulares neurônios será necessário, permitindo maior profundidade de sequenciamento e validação mais abrangente de hits interessantes. Por outro lado, a adesão total às recomendações do MIQE para análise e^validação de qRT-PCR pode exigir quantidades maiores para permitir as reações de controle necessárias para RNAs de baixa abundância.

A Figura 2 mostra uma série típica de imagens de uma porção de uma seção de chifre ventral da medula espinhal após a coloração e dissecção do Azure B. No painel A, os corpos celulares grandes e manchados são neurônios motores, confirmados pela mancha de anticorpos anti-Chat², e são facilmente diferenciados das células vizinhas menores. O painel B mostra a mesma região com corpos celulares individuais delineados com a caneta leve e numerados pelo software de microscópio. Os contornos seguem de perto as margens dos corpos celulares, com uma pequena subsídio para a largura de corte do laser. Este espaçamento deve ser determinado para cada configuração de energia laser para minimizar a inclusão de material ínteo, evitando a perda de citosol do neurônio motor. Os painéis C e D mostram a seção após o corte do laser e os corpos celulares individuais caíram na tampa da coleção. Observe que a margem de corte não segue exatamente o contorno da caneta de luz no painel C, mas fica em grande parte fora dela. Essa irregularidade é aparente no painel D, assim como a área escurecida ao redor de cada corte, o que reflete os danos térmicos ao tecido causados pelo laser. Por causa disso, se dois corpos de células estão muito próximos um do outro, é melhor delineá-los para um único corte, em vez de tentar cortá-los separadamente e perder algum RNA para danificar o calor em sua região de quase contato.

A Figura 3 mostra resultados típicos de uma análise eletroforética da integridade do RNA de uma amostra de RNA preparada a partir de ~4.000 corpos celulares de neurônio motor do rato coletados por LMD. O painel superior é o eletroferograma produzido por 1 μl do RNA total; o inset à direita é uma imagem do gel. Em ambos, note os proeminentes picos de RNA ribossômicos. O painel inferior é o eletroferograma da pista contendo padrões de tamanho de RNA. O software de análise calculou um RIN de 9,8 para esta amostra, com concentração de 4,9 ng/μl. Um total de 13 μl desta solução estava disponível após a análise, fornecendo 64 ng de RNA para validação de qRT-PCR a jusante dos valores da transcrição. Para uma análise típica de qRT-PCR de transcrições moderadamente abundantes, 0,15-0,20 ng de RNA total é suficiente para produzir quantitação precisa², de modo que a quantidade de RNA disponível a partir desta preparação é suficiente para validar uma série de transcrições com múltiplos conjuntos de primer, conforme recomendado⁴. É claro que quantidades maiores de RNA de entrada podem ser usadas para permitir a validação de transcrições raras. Esse valor também é mais do que suficiente para permitir a preparação da biblioteca e o RNA-seq de próxima geração.

Figura 1. Visão geral da produção de fatias da medula espinhal e microdisseção de captura a laser de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal. A) Principais etapas na produção e coloração de fatias. B) Visão de desenho animado da seção da medula espinhal e dissecção a laser. Clique aqui para ver imagem maior. 

Figura 2. Imagens antes e depois de uma dissecção a laser de corpos celulares de neurônios motores manchados Azure B. A) Uma parte do chifre ventral de uma seção manchada. Note as quatro grandes células manchadas escuras. Há também algumas células levemente manchadas e um pouco menores, que não são neurônios motores (confirmados por manchas de anticorpos anti-Chat; não mostrados, mas ver Bandyopadhyay²) e que não serão selecionados para dissecção. As muitas pequenas manchas escuras são provavelmente processos neuronais (dendritos e axônios), mas isso não foi confirmado. B) Os quatro corpos celulares delineados com a caneta de luz. Observe que os contornos seguem de perto as margens das células, com uma distância mínima entre elas. Este espaçamento deve ser estabelecido empiricamente para cada microscópio e laser. O software números os neurônios individuais, o que simplifica manter o controle de quantos foram coletados. C e D) Após o corte do laser e as peças contendo os corpos celulares caíram na tampa da coleção. Note que o buraco deixado para trás é um pouco maior do que o contorno e é irregular. Isso reflete a largura do raio laser e sua eficiência de corte ligeiramente variável, dependendo da composição local do tecido. Também é aparente a borda do tecido escurecido ao redor de cada orifício devido aos danos de aquecimento locais causados pelo laser. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 3. Análise eletroforética da integridade do RNA preparado a partir de amostras de LMD. A) Uma alíquota de 1 μl do RNA preparada a partir de ~4.000 corpos celulares de neurônios motores pelo protocolo acima foi analisada por eletroforese microcapilar em um chip de microfluidos. O eletroferograma é mostrado, com picos de RNA ribossômicos proeminentes. À direita está uma imagem do gel em si. B) Mostra-se o eletroferograma dos padrões de tamanho, com a faixa de gel correspondente à direita. O software de instrumento calculou um RIN de 9,8 para esta amostra e uma concentração de 4,9 ng/μl. Clique aqui para ver imagem maior.

Discussão

A medida mais significativa de sucesso deste protocolo para a produção de RNA total por microdisseção a laser de fatias de medula espinhal é o valor RIN⁵. Para amostras de RNA de eucariotes mais altos, valores acima de 8,5 regularmente produzem sequenciamento de alta qualidade e dados qRT-PCR. Se o rendimento for baixo, mas a qualidade for alta, repita a preparação. Se a integridade for menor (mesmo 7,5-8), no entanto, é melhor encontrar a fonte do problema e tentar novamente. Existem muitos passos onde algo pode dar errado, mas na verdade apenas duas fontes do problema - contaminação endógena rnase ou contaminação exógena RNase. O primeiro pode ser abordado pela prática, de modo que o tempo desde o sacrifício do mouse até o congelamento de seu cordão O.C.T-embedded seja minimizado. O outro ponto no protocolo onde o RNase endógeno pode contribuir para um resultado ruim é durante a preparação das fatias. Cada fatia deve aderir a um slide pen de temperatura ambiente rapidamente, mas ele vai derreter (o O.C.T fica claro). Quanto mais rápido a fatia puder ser refrozen, melhor. O criostat que usamos tem superfícies planas dentro da câmara que estão a -20 °C, que usamos para recongelar rapidamente a fatia. Encontre um ponto semelhante no criostat usado e certifique-se de que a fatia se torne opaca novamente rapidamente.

Rastrear fontes de RNase exógeno pode ser difícil, porque há tantas possibilidades. Os únicos reagentes usados que não são expressamente livres de RNase são O.C.T. e o Azure B. Se o Azure B já teve um desempenho satisfatório antes, experimente uma garrafa fresca de O.C.T., embora este reagente nunca tenha sido um problema. Reagentes sem RNase também podem ser substituídos, mesmo de um fornecedor diferente. Uma fonte muito mais provável é o investigador. Além de uma limpeza minuciosa da área de trabalho, muitas vezes é útil ter outro membro do laboratório acompanhando e observando todas as etapas do procedimento. Mesmo que seja alguém que não realiza rotineiramente esse procedimento, um novo conjunto de olhos pode pegar uma fonte de contaminação de outra forma despercebida.

Estender este protocolo para recuperar o RNA de outras células medulares, de células medulares de outras espécies, ou de tipos de células específicas em outros órgãos exigirá modificações em várias áreas destinadas a alcançar a identificação clara das células de interesse enquanto evitam, ou pelo menos minimizam, o impacto do RNase endógeno. No protocolo aqui, a rápida remoção e congelamento do cabo, juntamente com a coloração do Azure B em 70% de etanol, permitiu tanto a minimização da degradação do RNA quanto a fácil identificação dos corpos celulares do neurônio motor. O Azure B é uma mancha histoquímica bem estabelecida para neurônios que parece se ligar ao RNA³ e tem sido usada para avaliar o teor de RNA de neurônios em amostras de autópsia de tecido cerebral de pacientes com doença neurodegenerativa⁶. Notavelmente, a coloração do Azure B não afetou nem a integridade do RNA purificado nem sua capacidade de ser transcrita e analisada reversa. Outros corantes, como cresyl^{violeta 7} e azul toluidina⁸ têm sido usados em protocolos LMD semelhantes. A coleta dos corpos celulares diretamente na solução de tiocianato guanidine à medida que foram dissecadas proporcionou o passo final que resultou na recuperação rotineira do RNA intacto.

Abordagens semelhantes podem ser imaginadas para outras células e órgãos, reconhecendo que identificar as células de interesse ao mesmo tempo em que minimiza ou, preferencialmente, prevenir a degradação do RNA por RNases endógenas é o requisito crítico para uma análise bem sucedida. Em tecidos com altos níveis de RNase, como pâncreas, manuseio rápido e baixa temperatura foram combinados para permitir a recuperação do RNA de células β, aproveitando sua autofluorescência natural para visualização⁹. Procedimentos com a coloração de anticorpos para identificação também foram relatados^10,mas não foram totalmente bem sucedidos em nossas mãos. Finalmente, muitos modelos de camundongos estão disponíveis que expressam proteínas de fusão fluorescente (ou seja, GFP, YFP, RFP) em células de interesse, que poderiam ser usadas para identificá-las em seções de tecido no microscópio LMD. De fato, as cepas de camundongos que analisamos com este protocolo expressam uma proteína de fusão entre SOD1 e YFP¹¹, e seus neurônios motores da medula espinhal são altamente fluorescentes. Não conseguimos, no entanto, encontrar um conjunto de lavagens de etanol e/ou condições de desidratação que removeriam simultaneamente o O.C.T., inibiriam a atividade RNase e consistentemente manteriam fluorescência YFP suficiente para permitir a visualização dos neurônios motores e sua recuperação por LMD. Talvez uma nova proteína fluorescente ou uma variante das disponíveis que mantenha fluorescência em solventes orgânicos possam ser encontradas para superar essa limitação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina	Webster Veterinary	26637041101	Qualquer fonte aprovada pelo serviço veterinário institucional
Ferramentas de dissecação (tesouras, pinças, etc. etc.)			Qualquer fonte conveniente de instrumentos de dissecação de alta qualidade
Criostato	Leica Microsystem	CM3050S	Outros criostatos devem ser adequados
LMD6000 B	Leica Microsystem		Outros sistemas LMD não foram testados
Membrana PEN livre de RNase 2 μ M slides	Leica Microsystem	11505189	Outros tipos de lâminas foram testados e não funcionam bem
RNeasy Micro kit (50)	Qiagen	74004	Qualquer kit que use tampão de lise de tiocianato de guanidina e tenha sido testado para recuperar pequenas quantidades de RNA pode ser usado
Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Azure B Certified	MP Biomedicals	190520	Crítico! Produto de qualquer fonte deve ser testado antes do uso quanto à sua capacidade de manter a integridade do RNA
PBS	Sigma Life Science	D8537	Qualquer fonte confiável de etanol de RNA PBS livre de RNase
70% (feito com água tratada com DEPC)	American Bioanalytical	AB04010-00500	Qualquer fonte confiável, pode ser feita em laboratório
Água, livre de RNase, testado para endotoxina (tratado com DEPC para eliminar RNase)	American Bioanalytical	AB02128-00500	Qualquer fonte confiável, pode ser
RNase AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	Outros reagentes de remoção de RNase semelhantes, como RNaseZAP (também da Invitrogen) podem ser usados
2-Metilbutano	Ciências de Microscopia Eletrônica	78-78-4	Qualquer fonte
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 e 1.5 ml) e pontas de pipeta	Axygen	311-03-051 e 311-09-051	Retenção ultrabaixa, tubos e pontas livres de RNase; teste os produtos de outros fabricantes antes de usar
o O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Cryomold Intermediate Size	Tissue-Tek	4566
Toalhetes de laboratório (Kimwipes)	KIMTECH	34155