FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Summary

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

Abstract

Na era da biologia computacional, novos sistemas experimentais de alto rendimento são necessárias para preencher e refinar os modelos para que possam ser validadas para fins preditivos. Idealmente esses sistemas seria baixo volume, o que impede análises de amostragem e destrutivas, quando os dados do curso do tempo devem ser obtidos. O que é necessário é uma ferramenta de monitoramento em situ que pode relatar as informações necessárias em tempo real e de forma não invasiva. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres de concentrações intracelulares baseados em proteína. Uma classe especial de in vivo biossensores que tem encontrado aplicações em metabolito quantificação baseia-se na transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha celular, eles têm tempos de resposta rápidos e sua cha espectralcas mudar de acordo com a concentração de metabolito no interior da célula. Neste papel, o método para a construção de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para glicose e glutamina e calibrar os FIBS in vivo em cultura de células em lotes a fim de permitir futura quantificação da concentração intracelular do metabolito é descrito. Os dados de batelada alimentada CHO culturas celulares demonstra que os FIBS foi capaz, em cada caso, para detectar a alteração resultante na concentração intracelular. Usando o sinal de fluorescência a partir das FIBS e a curva de calibração construída anteriormente, a concentração intracelular foi determinada com precisão, como confirmado por um ensaio enzimático independente.

Introduction

Monitoramento metabolito tem diversas aplicações em bioprocessing, incluindo o desenvolvimento de processos, mídia e design de alimentação e engenharia metabólica. Vários métodos estão disponíveis para as medições de concentração através da utilização de ^um enzimática, química ^2, ou ensaios de ligação ^3. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres da concentração intracelular de metabolitos essenciais à base de proteínas. Em ensaios de ultra-baixo volume, a fluorescência é uma ferramenta conveniente como miniaturização realmente melhora a taxa de ^4,5 sinal-ruído e sensores à base de proteínas podem ser geneticamente codificados sentido de que não há reagentes exógenos são necessários para análise de metabolitos. Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) biossensores consistem de duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET é uma transferência não radiativa de energia a partir de um doador de foto-animado para um receptor molécula fluorescente loca ed em estreita proximidade (<100). Clivagem ligando ou ligação provoca uma alteração conformacional no sensor, o qual, por sua vez, induz uma mudança na proximidade dos fluoróforos, conduzindo a uma alteração na eficiência de TERF medido pela alteração no espectro de emissão. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha de células e as suas características espectrais são alteradas com base na concentração de metabolito no interior da célula. FIBS têm tempos de resposta rápidos, tornando-os ideais para a tomada de medidas para os modelos dinâmicos ^6. Aplicações anteriores incluem o monitoramento único ^7-9 e múltiplas ¹⁰ metabólitos e fornecendo dados sobre a distribuição espaço-temporal ^11. FIBS podem ser criados de duas configurações: Apo-Max, onde a ligação do ligando perturba a proximidade dos fluoróforos reduzindo a transferência de energia e de Apo-Min, onde a ligação do ligando traz os dois fluoróforos em contacto mais próximo (Figura 1).

_content "> Neste trabalho, um protocolo para a construção são apresentados de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para um metabolito de glucose ou glutamina. está estabelecido um método para a calibração do sensor in vivo, para permitir futura quantitativa medições de concentração de metabolito intracelular, tal como apresentado na Figura 2. Baseado nisto, a concentração intracelular de glucose ou glutamina pode ser determinada em fed-batch culturas de células CHO, em que os dois nutrientes foram adicionados em concentrações elevadas no processo. Os resultados demonstram que a utilização do sinal de fluorescência a partir das FIBS e da curva de calibração previamente construído, com precisão de previsão da concentração intracelular é possível, tal como foi confirmado por um ensaio enzimático independente. Este método oferece vantagens substanciais em relação às tecnologias analíticas correntes, porque ele não é invasivo, de baixo custo e rápida, dando um sinal em tempo real dos FIBS que podem ser monitored em toda a cultura.

Protocol

1. Celular Linha Revival e Manutenção

1. Reviver as células CHO em 9 ml de meio CD-CHO suplementado com 8 mM de L-glutamina e 10 ml / L de suplemento de 100x hipoxantina / timidina (meio de crescimento completo).
2. Centrifugar a 100 xg durante 5 min.
3. Ressuspender as células em 10 ml de meio de crescimento completo fresco.
4. Retirar uma amostra de 1 ml e determinar a concentração de células viáveis ​​por microscopia de luz, utilizando o método de exclusão do corante azul tripano num hemocitómetro.
5. Iniciar uma cultura com uma densidade de sementeira de 3 x 10 ⁵ células / ml em 125 ml de frascos de agitação.
6. Manter a cultura numa incubadora a 37 ° C, numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2, numa plataforma de agitação orbital rotativo a 120 rpm.
7. Subcultura a cada 3-4 dias em meio de crescimento completo com uma densidade de sementeira de 2 x 10 ⁵ células / ml.

2. A transfecção da linha celular com o plasmídeo Containing o Biosensor Gene

1. Preparar DNA de plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeo em larga escala.
2. Manter as células em condições adequadas (37 ° C, 5% CO ₂₎ 12-24 h antes da transfecção para assegurar que as células são activamente dividir no tempo de transfecção.
3. Contar as células usando o método de exclusão do corante azul de tripano, em seguida, se preparar um volume de trabalho de 20 ml de cultura de células em um frasco de agitação de 125 ml a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.
4. Usar um kit de transfecção adequado para a linha celular em uso. O DNA de plasmídeo a proporção de reagentes de transfecção vai ser dependente da linha de células e o vector. Recomenda-se que esta é otimizado pelo teste de uma gama de relações dentro do intervalo especificado pelo fabricante antes de realizar as transfections finais. Também manter, pelo menos, uma cultura de controlo negativo que contém as células, mas não o ADN.
5. Incubar durante 4 dias em modo estático e, em seguida, transferir para um Shaking plataforma rotativa a 125 rpm.
6. Adicionar o antibiótico apropriado para a selecção do plasmídeo a uma concentração apropriada, tal como determinado por uma curva de mortalidade. Neste estudo, zeocina foi adicionado a uma concentração final de 400 ug / ml para selecção de células transfectadas.
7. Mudança de mídia em um intervalo de tempo adequado para a linha celular, acrescentando antibiótico a cada vez, até que as células em controle de poço morreram.
8. Use os poços mais confluentes para avançar para agitando culturas.
9. Estabelecer um banco de células, congelando as células em frascos criogénicos contendo 10 ⁷ células viáveis ​​em 1 ml da mistura de congelação. Neste trabalho, esta é constituída por 92,5% de meio de crescimento e de 7,5% de dimetil sulfóxido.

3. Batch e Fed-batch Crescimento Celular Curve

1. Seguir as instruções para a manutenção das células acima para estabelecer culturas de células em triplicado de células CHO transfectadas em 250 ml de frascos de agitação com um volume de trabalho de 50 ml.
2. Manter a cultures em um incubador humidificado de células a 37 ° C, com 5% de CO _2, numa plataforma de agitação orbital rotativo a 125 rpm, e retirar amostras de 4,1 ml a partir de cada cultura de crescimento a intervalos de 24 h.
3. Utilizar 100 ul da amostra para determinar a concentração de células e viabilidade celular viável com o método de exclusão de corante azul de tripano.
4. Repetir até que a concentração de células viáveis ​​é reduzido a zero.
5. Repetir para as culturas de células alimentado com alimentação suplementar com a quantidade apropriada de glicose ou glutamina no dia 6 para restaurar as suas concentrações para os seus valores iniciais de 36 mM e 4 mM, respectivamente. Recomenda-se que as culturas de controlo adicional, também são mantidos, que estão a ser alimentados com o mesmo volume (12 ml, no caso) de água pura.

4. FRET Medidas Relação

1. Tome 2 ml das amostras diárias removidos na etapa 3.2 e centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C.
2. Resuspterminou o sedimento celular em 2 ml de gelo frio de fosfato salina tamponada (PBS). Transferir este em uma placa de 6 poços e adicionar uma amostra de branco não contendo células para um poço.
3. Medir os níveis de fluorescência azul e amarelo imediatamente em um comprimento de onda de excitação de 430/435 nm e emissão de comprimentos de onda 465/435 nm (azul) e 520/510 nm (amarelo).
4. Calcular as relações de FRET (razão de fluorescência amarela detectados mais de fluorescência azul detectado).

5. Metabolite Ensaios

1. Tome 2 ml das amostras diárias removidos na etapa 3.2 e centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
2. Ressuspender o sedimento de células em 3 ml de PBS gelado e centrifugar novamente a 100 x g durante 5 min.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de PBS gelado, como acima. Sonicar o 5x amostra por 3 min cada um em um pulso de 15 segundos ligado e 15 segundos desligado. Neste ponto, a célula adicionalcts podem ser congeladas, se desejar.
4. Utilizado um kit de ensaio de glucose apropriada conforme as instruções do fabricante, em amostras de extractos de células para determinar a concentração de glucose intracelular (ver tabela de materiais).
   Nota: Use padrões apropriados para a construção de uma curva padrão. Neste trabalho, a concentração dos padrões variaram entre 0-100 mM.
5. Usando as leituras para os padrões, construir a curva padrão e encontrar a equação linear de melhor ajuste (neste caso: y = 1310.51x - 723,43, onde y é a leitura de absorvância e x é a concentração de glucose).
6. Calcular as concentrações de glicose utilizando a curva padrão e tendo em conta a diluição. A concentração de glucose intracelular pode ser calculada utilizando a seguinte equação:
   
   Para as células CHO, o volume da célula única foi calculada usando um diâmetro de célula de 12 pM ¹²
7. Usar um kit de ensaio de glutamina apropriado conforme as instruções do fabricante, em amostras de extractos de células para determinar a concentração de glutamina intracelular (ver tabela de materiais).
   Nota: Use padrões apropriados para a construção de uma curva padrão. Neste trabalho, a concentração dos padrões variaram entre 0-2 mM.
8. Como em 5.5 acima, a curva de calibração (neste caso, y = 203.1x + 17.1, onde y é a leitura de absorvância e x é a concentração de glucose)
9. Usando a curva padrão, calcular a concentração de glutamina das amostras, tendo em conta a diluição. A concentração de glutamina intracelular pode ser calculado usando a Equação 1 acima.

Results

Uma visão geral da metodologia é apresentada na Figura 2. No trabalho aqui apresentado, as células CHO foram transfectadas com o vector de linhas de células estáveis ​​foram seleccionadas FIBS e a uma pressão de antibiótico de 400 ug / ml de zeocina. Por conseguinte, foram criadas duas linhas de células estáveis ​​que expressam constitutivamente separados os sensores de glicose e glutamina. Figura 1 representa as configurações dos dois biossensores utilizados neste estudo. O sensor de g...

Discussion

Os FIBS activar in vivo e in situ, a quantificação de moléculas-chave, neste caso nutrientes limitantes do crescimento, eliminando incertezas decorrentes de têmpera e métodos de extracção. Os resultados sugerem que existe uma boa correlação entre o sinal FIBS e as concentrações intracelulares na gama de 1-5 mM de glicose e 0,3-2 mM de glutamina. No lote CHO cultura de células, estas concentrações são encontradas nas fases de declínio exponencial, estacionárias, e no início. As fases exponencial e estacionária s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	A linha celular varia de acordo com os objetivos do estudo
vetor pCDNA4/TO	Life Tecnologies
TransIT-PRO Reagente de Transfecção	Mirus Bio	MIR 5700	As transfecções podem ser realizadas usando qualquer método adequado para a linha celular em estudo
Meio Zeocin	Invivogen
CD-CHO	Life Technologies	10743-011	O meio de crescimento celular depende das células em estudo
100x HT Suplemento	Life Technologies	11067-030
L-Glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Leitor de placas InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Qualquer leitor de placas de fluorescência de 96 poços que possa acessar os comprimentos de onda necessários pode ser substituído
Filtros para leitor de placas	Tecan	30000463
Kit de Purificação de Plasmídeos Maxiprep	Qiagen	12163	Qualquer kit adequado pode ser substituído pelo
kit de ensaio de glicose/glicose oxidase Amplex Red	Invitrogen	A22189	Qualquer kit adequado pode ser substituído por
EnzyChrom  Kit de Ensaio de Glutamina	BioAssay Systems	EOAC-100	Qualquer kit adequado pode ser substituído
Hemocitômetro Neubauer Melhorado	Incubadora Fisher Scientific	MNK-420-010N
	Nuaire	NU-5510E