Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Resumo

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Resumo

A demanda por anticorpos que atendam às necessidades de ambas as aplicações básicas e clínicas de pesquisa é alto e vai aumentar drasticamente no futuro. No entanto, é evidente que as tecnologias tradicionais não são monoclonais sozinho até esta tarefa. Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos alternativos para satisfazer a procura de alta qualidade e reagentes de afinidade renováveis ​​para todos os elementos acessíveis do proteoma. Para este fim, os métodos de alto rendimento para a realização de seleções a partir de bibliotecas de anticorpos sintéticos exibido em fagos foram concebidos para aplicações que envolvem diversos antígenos e otimizado para o rendimento e sucesso rápido. Nisto, um protocolo é descrito em detalhe que ilustra com demonstração de vídeo a selecção de clones paralelo Fab-fago a partir de bibliotecas de alta diversidade contra centenas de alvos quer utilizando um manipulador de líquidos 96 canal manual ou sistema de robótica automatizado. Usando este protocolo, um único usuário pode gerar centenas de antígenos,selecionar anticorpos para-los em paralelo e validar a ligação do anticorpo dentro de 6-8 semanas. Destacam-se: i) um formato de antígeno viável, ii) caracterização antígeno pré-selecção, iii) passos críticos que influenciam a seleção de clones específicos de afinidade e alta, e iv) formas de eficácia seleção monitoramento e fase inicial de anticorpos clone caracterização. Com esta abordagem, temos obtido os fragmentos de anticorpos sintéticos (FAB) para muitas classes alvo, incluindo os receptores de uma só passagem de membrana, hormônios proteína secretada e proteínas intracelulares multi-domínio. Estes fragmentos são facilmente convertidos em anticorpos de comprimento total e foram validados para apresentar uma elevada afinidade e especificidade. Além disso, eles têm sido demonstrados para ser funcional em uma variedade de imunoensaios convencionais, incluindo Western blot, ELISA, imunofluorescência celular, ensaios de imunoprecipitação e afins. Esta metodologia irá acelerar a descoberta de anticorpos e, finalmente, trazer-nos mais perto de realizar o objetivo of gerar anticorpos qualidade renováveis, elevadas para o proteoma.

Introdução

Com o início da era pós-genômica, a disponibilidade de reagentes de ligação de alta qualidade para caracterizar e modular proteínas é fundamental para abrir novas pesquisas e avenidas terapêuticas. Os anticorpos continuam a ser fundamentais para ambos os pesquisadores acadêmicos e industriais como a pesquisa básica e ferramentas de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Não surpreendentemente, tem havido um crescimento impressionante de empresas de desenvolvimento de anticorpos contrato, a maioria dos que dependem de tecnologias de hibridoma convencionais para gerar anticorpos personalizados. No entanto, a seleção in vitro utilizando bibliotecas de anticorpos exibidos-fago está se tornando uma poderosa tecnologia alternativa que pode oferecer vantagens únicas e sucesso em que as tecnologias convencionais podem enfrentar limitações ^{1, 2.}

À luz do que uma considerável procura de anticorpos de alta qualidade como ferramentas de investigação, dois desafios principais para a produção de anticorpos são renováveis ​​1) selecção de transferência e 2) av antigénioailability. Um certo número de grupos têm agora descrito em condutas de selecção in vitro com vista a aumentar o rendimento e a taxa de identificação de anticorpos. Estas descrições detalhe uma variedade de abordagens que incluem seleccionar viáveis ​​em cima ou de comprimento completo como alvo ^{3,4, 5,6,7} ou domínios estruturalmente relacionado, usando ^6,8 ou a placa de base de ^3,4-regimes de antigénio de imobilização à base de grânulo. Além disso, o crescente adopção de tecnologias de síntese de genes ⁹ fez geração antigénio sistemática, particularmente de domínios isolados, razoavelmente custo eficaz e potencialmente pode aliviar a dificuldade na obtenção de quantidades suficientes de antigénio purificado, de comprimento completo. Ao utilizar as duas tecnologias em conjunto, um oleoduto auto-contido e geração antigénio escalável e selecção de anticorpos foi concebida que permita o isolamento de anticorpos para paralelo de grandes conjuntos de domínios de antigénios expressos e facilitar o desenvolvimento de reagentes para a characterizing classes inteiras de proteínas estruturalmente ou funcionalmente relacionados.

Para atingir esse objectivo, um pipeline integrado que casais em silico identificação de domínios de antigénio, a síntese de genes expressáveis, expressão bacteriana de alto rendimento de antigénios e selecções de anticorpo exibido em fagos tem sido desenvolvido escaláveis. Este gasoduto requer apenas infra-estrutura básica disponível para a maioria dos laboratórios de ciências da vida (incluindo bibliotecas de anticorpos que são cada vez mais disponíveis através de licença ou de transferência de material acordo), mas também é passível de automação para uso em escala industrial. Usando este protocolo, é possível gerar centenas de domínios de antigénio marcado com afinidade, e rotineiramente isolar fragmentos de anticorpos altamente específicos para muitos destes antigénios.

A tecnologia de apresentação de fagos demonstrou compatibilidade demonstrado com uma ampla variedade de formatos de reagentes de afinidade recombinantes incluindo Fab, scFv, Fv e domínios autónomos e umcrescente conjunto de pequenos 'estruturas alternativas' (proteínas ankyrin repetição projetados (DARPINS), fibronectina (FN), domínios lipocalina e mais ^10). Discussão é limitado neste exemplo para o isolamento de fragmentos de anticorpos Fab, embora se presume estes métodos podem ser adaptados a outros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnologia, os Fabs com baixa afinidade nanomolar para pequeno, marcaram domínios proteicos, incluindo domínios de factor de transcrição, domínios SH2, proteínas e outros ligação RNA foram seleccionadas com sucesso, muitos dos quais se ligam a proteína de comprimento completo e são funcionais em imunoensaios tais como imunofluorescência , imunoprecipitação e imuno-histoquímica. Importante, clones de ligação recombinantes são totalmente renovável e pode ser re-gerada a partir de construções de expressão via oferta de produção bacteriana maior coerência, reprodutibilidade e custo-efetividade, justificando, assim, a despesa de validação clone rigorosa.

Neste protOCOL e vídeo acompanhante, métodos básicos para a selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos utilizando domínios de antigénios imobilizados são demonstradas. Este método particular emprega domínios de proteínas marcadas com GST imobilizados por adsorção passiva em placas de micropoços, embora outras marcações ^{11,12,13 13,14,2} e formatos de selecção, também têm sido utilizados com sucesso. Considerações críticas para a instalação e condução das seleções com acompanhamento paralelo de parâmetros de seleção que visam identificar e isolar anticorpos clonais especificamente enriquecido para validação são detalhados.

Protocolo

1. Antigen Generation

NOTA: os domínios de antigénios pode ser sintetizado e clonado por uma variedade de fornecedores comerciais para uma construção de expressão de IPTG induzível adequado.

1. Transformar as construções de expressão em quimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. células de E. coli por mistura de 10 ng de ADN que codifica em 20 ul de 1X KCM sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR, seguida pela adição de 20 L de células quimicamente competentes.
2. Incubar a mistura de célula / DNA em gelo durante 20 min, à RT durante 10 min e, em seguida, novamente em gelo durante 2 min antes de emergência com 100 ul de pré-aquecida de super caldo óptima com glucose (SOC) meios, cobrindo com uma placa de vedação respirável e agitação a 37 ° C durante 1 hora a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetros.
3. Placa 5 ul de células transformadas em Luria-Bertani (LB) / placas de agar suplementado com carbenicilina (100 g / ml) e cultivam O / N para se obter colónias isoladas são usadas paragerando stocks de glicerol.
4. Inocular 1 ml de 2YT media / carb com 5 ul de glicerol e crescer durante 12 horas a 37 ° C num bloco de 96 poços profundos bem com agitação a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetros.
5. Inocular NZY MC15 (suplementado com 0,05% de glucose, 2% de lactose e 100 g / ml de carbenicilina) com uma diluição de 1:40 esta cultura, em seguida, agita-se durante 6-8 horas a 30 ° C e 200 rpm num orbital 2,5 centímetros shaker.
6. Pellets bactérias e purificar proteínas antigênicas de alto rendimento em uma placa de filtro de 96 poços contendo 100 ul de resina Ni-NTA conforme protocols16,17 publicado anteriormente.
7. Determinar a concentração de proteínas purificadas por ligação de corante de Bradford-assay18 e para caracterizar o tamanho e pureza por separação e visualização de 10-50 ug com Coomassie mancha num gel de SDS-PAGE (ver Figura 2).
   NOTA: Nesta fase, as proteínas podem ser ainda caracterizada por métodos que avaliam a agregação da proteína ^{de 19} ou de dobrar ^20, dependendo da natureza do antigénio e os requisitos de selecção do oleoduto.

2. Preparação e Titulação da biblioteca de fagos

1. Escolha uma única colônia de E. resistente ao fago T1 coli células em 1 ml de meio 2YT suplementados com 50 ug / ml de tetraciclina.
2. Uma vez que o crescimento celular é estabelecida visualmente, dilui-se a cultura de um volume maior de 2YT suplementado com 50 ug / ml de tetraciclina para assegurar um volume suficiente de células para a infecção (geralmente 45 ul por biblioteca de diluição, ver abaixo.).
3. Preparar a biblioteca para uso por precipitação a partir de um tampão de armazenamento de fagos com 1/5 volume de autoclavada 20% de PEG-8000, 2,5 M de NaCl (PEG-NaCl) incubar em gelo durante 30 min e peletização fago precipitado por centrifugação a 12.000 x g.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado de fagos num volume apropriado de 1x PBS pH 7,4, 0,2% de BSA e 0,05% de Tween (PBT), ajustando to uma concentração apropriada para a selecção de fagos (se necessário) para assegurar a cobertura adequada biblioteca. Veja o Passo 2.9 e Discussão.
5. Dilui-se uma alíquota de 5 ul de fagos em 45 ul de 1x PBS a pH 7,4 numa placa de multi-poços estéril, misturar, e criar uma série de diluições de 10 vezes no mesmo tampão.
6. Adiciona-se 5 ul de cada diluição de fagos a 45 ul de fago T1-resistente E. coli células em fase de crescimento logarítmico _(DO600 = 0,4-0,8) em uma outra placa de poços múltiplos, cobrir com uma vedação respirável e incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 30 min num agitador orbital 2,5 centímetros.
7. Placa 5 ul de células infectadas a partir de cada um dos poços de uma placa de agar pré-aquecido suplementado com 100 g / ml de carbenicilina e crescer O / N a 37 ° C até as colónias são visíveis.
8. Calcular o total de fagos / mL, como se segue:
   Fago / ml = número de colônias em uma placa carbenicilina no mais, diluir a amostra x 200 x 10 ⁱ (i = onde o num máximober de diluições em que as colônias são aparentes).
9. Para determinar o número de poços de antigénio revestidos para assegurar uma cobertura da diversidade da biblioteca, calcular como se segue:
   Número de poços de antígenos revestidos required =
   Cobertura de vezes desejado * biblioteca diversidade
   # De fago por 100 ul

3. Selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos

3.1) A imobilização Antigénio

1. Para evitar ciclos de congelação-descongelação que podem afectar a qualidade do antigénio e para facilitar as diluições, preparar uma placa de proteína antigénio de estoque normalizado para 100x concentrações de trabalho (por exemplo, 500 g / ml) e em alíquotas para placas de 96 poços não-ligação.
2. Prepare placas revestidas com antigénio de soluções de proteína estoque um dia antes de cada rodada de seleções diluindo a partir de placas de ações com PBS.
3. Revestimento-96 bem altas placas de poliestireno de ligação de proteína com 100 ul de proteína GST-antigénio marcado ou um controlo negativo protein (GST, BSA, neutravidina, etc.) a de 5 ug / ml em PBS. Agitar a 250 rpm, 4 ° CO / N em um agitador de microplacas.
4. Remover proteínas a partir da solução microplacas revestidas, bloquear as placas revestidas com antigénio e selecção negativa com 200 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,2% em 1x PBS, pH 7,4) e agitar a 250 rpm à temperatura ambiente durante 1-2 horas.
5. Após o bloqueio, lavar as placas revestidas com proteína bloqueadas quatro vezes com 200 ul de 1x PBS a pH 7,4 com 0,05% de Tween (PT) tampão, quer manualmente ou utilizando um lavador de microplacas automático.

3.2) Biblioteca Pré-apuramento e Antigen-fago Incubação

1. Esgotar a biblioteca de não (ou tag-) clones específicos de ligação exibida por fagos de fragmentos de anticorpos através de transferência de 100 uL (10 ¹²⁾ de fagos de biblioteca de fagos preparada em tampão PBT para uma série de poços revestidos com proteína de controlo negativo ou etiqueta de afinidade livre proteína (por exemplo, GST) equivalente ao número de alvos e incubar fagonos poços durante 1-2 horas à temperatura ambiente com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Como uma alternativa ou um meio adicional de selecção negativa, a incubação pode também ser realizada na presença de excesso (5-25 uM) de tag de afinidade da proteína solúvel (por exemplo, GST) para remover adicionalmente os clones de ligação a tag e aumentar a recuperação de alvo específico clones obrigatório.
2. Transferência do sobrenadante de fagos para selecção negativa placas revestidas com antigénio e incubar durante 1-2 horas à temperatura ambiente com agitação a 250 rpm durante a captura de clones específicos de ligação.
3. Remover o fago não ligado e lavar os poços da microplaca de 8-15 vezes com tampão PT manualmente ou utilizando um lavador de microplacas. Retire o excesso de tampão de lavagem pouco antes de eluição.

3.3) eluição, Infecção e Phage Amplification

1. Logo no início do dia de seleções, escolher uma única colônia de E. resistente ao fago T1 coli células em 1 ml de meio 2YT suplementados com 50 ug / ml de tetraciclina e crescer a 37 ° C with agitação a 200 rpm num agitador orbital 2,5 centímetro, ou equivalente.
2. Uma vez que o crescimento celular é estabelecida e pode ser visto a olho nu, aumentar o volume do meio com 2YT suplementado com 50 ug / ml de tetraciclina para assegurar um volume suficiente de células para a infecção (geralmente 100 ul por poço de selecção).
3. Crescer as células até uma OD ₆₀₀ de 0,4-0,8 é atingido (aproximadamente 5-7 h), em seguida, para eluir os fagos ligados adicionar 100 uL de células para o antigénio placa lavada e agitar a 37 ° C durante 30 min.
4. Adicionar o fago auxiliar M13K07 para uma concentração final de 1 x 10 ¹⁰ ufc / ml e incubar a 37 ° C durante 45 min com agitação a 200 rpm.
5. Transferência de células a 1,2 ml de 2YT suplementado com 150 ug / ml de carbenicilina e 75 ug / ml de canamicina, num bloco de 96 poços poços profundos com fundo em V e crescer O / N a 37 ° C com agitação a 200 rpm em 2,5 cm de agitador orbital.

3.4) Fago Preparação e Rondas repetidas de Selecção

1. Pellets bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C.
2. Misturar volumes iguais de sobrenadantes de fagos de placas replicadas em uma mini-câmara de ar de 96 poços caixa azul microplaca estéril, neutralizar com ^1/10 volume de 10X PBT e misture. Repita as rodadas de seleção (a partir do passo 3.1.1) por 3-4 rodadas ou até que o enriquecimento é observado (ver secções 4. e 7.) em comparação com proteína de controlo negativo.
   NOTA: Nas primeiras rodadas de seleção quando não é esperado significativo enriquecimento / detectável (ou seja, arredonda 1 e 2), a quantificação de entrada e saída de fagos títulos (descritos na Seção 7 e resultados representativos mostrado na Figura 3) pode ser útil no sentido de garantir concentrações mínimas de fagos para seleções de sucesso (descritos na discussão) e são mais adequados do que ELISAs em pool.

4. Caracterização por Pooled ELISA

1. Brasão de 96 poços de alta proteína-binding placas de poliestireno com 100 ul de proteína marcada GST-antigénio ou proteína de controlo negativo (GST, BSA, neutravidina etc.) a 2 ug / ml, como por Secção 3.1 e agitar a 4 ° CO / N.
2. Remover o excesso de antigénio, bloquear a placa com 200 ul de tampão de bloqueio com agitação durante 1-2 horas à temperatura ambiente a 250 rpm num agitador de microplacas e lavar quatro vezes com tampão PT 200 ul à mão ou pelo lavador de placas automatizado.
3. Adicionar 100 ul de sobrenadante de fagos (diluído 1: 10-1: 20 em tampão PBT), agitar a 250 rpm durante 15 min à temperatura ambiente, e lava-se a placa oito vezes com tampão PT 200 ul.
4. Adicionar 100 ul de anti-M13-HRP (1: 5000 em tampão PBT). Agitar a 200 rpm durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida lava-se a placa de seis vezes com tampão PT 200 ul e duas vezes com 200 ul de PBS.
5. Adicionar 100 ul de 1: 1 de substrato TMB para desenvolver e 5-15 minutos (ou até que a cor substancial desenvolveu), em seguida, parar a reacção por adição de 100 ul de 1 MH ₃ PO ₄ e ler a placa a 450 nm.
6. Em geral, o enriquecimento em conjuntos de fagos pode ser observada em rodadas 3-4 como uma razão de ligação específica em relação a ligação não específica de> 2 (Ver Figura 4)
   NOTA: É informativo notar sinal de ligação absoluta que a alta na proteína tag afinidade indica enriquecimento de ligantes específicos de tag (em vez de ligantes alvo), e que sinal de ligação absoluta no alto da proteína de controlo negativo indica enriquecimento de não-específica ou " "ligantes pegajosas.

5. Clone Selection, Sequenciamento e Caracterização

5.1) O isolamento de solteiro Clones Fab-fagos

1. Para isolar os clones individuais para sequenciação e caracterização, infectar ^1/10 do volume do conjunto de fagos amplificados em T1 para fagos resistentes E. coli células em fase logarítmica de crescimento _(DO600 = 0,4-0,8) em uma placa de microtitulação de fundo redondo, cubra com um Breathable junta da placa e incubar com agitação a 200 rpm durante 30 min a 37 ° C.
2. Preparar diluições em série de 10 vezes em meio 2YT e placa em placas de agar suplementadas separadas com 100 g / ml de carbenicilina.
3. Escolher colónias únicas em 450 ul de meio 2YT / carb suplementado com 1 x 10 ⁹ fago M13K07 / ml e crescem S / N em um mini-tubo 96 caixa azul microplaca estéril incubação a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
4. Pellets bactérias por centrifugação a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Clonal sobrenadante de fagos pode ser utilizada para a sequenciação de clones Fab-fagos (tal como descrito na Secção 5.4) ou para clonal ELISA para determinar a especificidade contra antigénios imobilizados (como descrito nas Secções 5.3 e ²¹⁾ para os quais os resultados representativos são apresentados na Figura ligação directa 5.

5.2) A expressão de clones Fab para a caracterização

1. Após clonagem em um e adequadovector xpression (ver discussão), escolher único E. coli colónias transformadas com construções de expressão em 1 ml de 2YT media / carb em uma placa de 96 poços profundos poços utilizando um palito ou ponta de pipeta estéril e crescer durante 12-16 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm. Isto pode ser feito manualmente ou com uma máquina desbastadora de colónias automatizado.
2. ¹⁵ Transferir 40 uL de cultura de crescimento de 1,5 ml de meio NZY suplementado com glucose / lactose / glicerol num bloco de 96 poços fundos bem como por metodologia de Studier et ai.
   NOTA: Como alternativa, as células podem ser cultivadas durante 3-4 horas (0,8-1,0 OD) na expressão não-suplementado e proteína induzida pela adição de IPTG 1 mM.
3. Cobrir o bloco (s) de cultura com um selo respirável e expressar clones de Fab para 6-8 horas a 30 ° C com agitação a 200 rpm. Placas de spin em 4000 xg durante 15 min para sedimentar as células bacterianas, remover o sobrenadante, placas de cobertura com um selo de alumínio e congelar peletes a -20 ° C até a lise.
4. Libertar Fabs expressos a partir de sedimentos recolhidos com 100 ul de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% de Triton X-100 a pH 8,0 com 1 mg / ml de lisozima e 10 U benzonase / ml de cultura e inibidores de protease) e agitação durante 2 hora a 4 ° C.
5. Remover os detritos celulares por centrifugação a 4000 xg durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante lisado bruto para utilização na caracterização inicial da especificidade por placas de ELISA (ver Secção 5.3).

5.3) Clone Caracterização pelo Direct Encadernação Clonal Fab ELISA

1. Imobilizar antígenos conforme descrito na Seção 3.1, em vez aliquotting 30 ul de antigénio / ml 2 mg em PBS para poços de uma placa de 384 poços. Layouts de antígenos baseados em Quad na placa pode facilitar a transferência de reagente quando utiliza 96 cabeças de distribuição baseada em canais. Lave e placas de ELISA bloco conforme Seção 3.1.
2. Lisados ​​desmatadas coletados a partir de Seção 5.2 pode ser aplicado diretamente ao antígeno imobilizado por evaavalia- de ligação. Incubar 30 ul de lisato por poço, durante 15 min à temperatura ambiente com agitação a 200 rpm.
   NOTA: proteína purificada clone Fab podem ser utilizados alternadamente por diluição de 10 ug / ml em tampão de aplicação de PBT e 30 ul de cada clone a poços bloqueados contendo antigénio ou proteína de controlo negativo (GST, BSA, etc.) e no desenvolvimento da mesma maneira descrita abaixo. Alternativamente, Fab-fago também pode ser utilizado por diluição de 10 ul de sobrenadante de fagos (descrito na Secção 5.1) em 20 ul de tampão PBT (1: 3) e a detecção com anticorpos anti-M13-HRP (descrito nos Passos 4,4-4,5)
3. Remover o excesso de lisado e lavar os poços, quer manualmente ou utilizando uma placa automatizado lavado com 8x 100 ul de tampão de PT e remover o excesso de tampão.
4. Incubar 30 ul de uma diluição de 1: 5000 de anticorpo secundário anti-FLAG em tampão PBT durante 30 min à temperatura ambiente com agitação a 200 rpm.
5. Wash, desenvolver e quantificar como por secções 4,3-4,5.
   NOTA: Os resultados representativosilustram ambos os clones de ligação específicos e não-específicos são apresentados na Figura 5.

5.4) Clone Sequencing

1. Prepara-se uma mistura principal de PCR, como indicado na Tabela 2.
2. Adicionar 2 mL de modelo de PCR apropriado (ou sobrenadante de fago ou única colónia bacteriana contendo fagemídeo re-suspenso) a 20 ul de PCR master mix preparado com os iniciadores apropriados em poços de uma placa de PCR.
   NOTA: misturas principais separadas são necessárias para a sequenciação de ambos os genes de cadeia pesada e leve.
3. Executar a reacção de PCR utilizando os parâmetros listados na Tabela 2 - Definições PCR.
4. Verificar o sucesso da reacção de PCR por mistura de 5 ul da reacção completada com corante de carga sobre um gel de agarose a 1% suplementado com mancha de ADN e visualização de imagem num transiluminador de 300 nm.
5. Adicionar 2 l de produto de PCR de 10 uL de água estéril contendo 0,2; Ul cada uma exonuclease e fosfatase alcalina de camarão e incubar a 37 ° C durante 20 minutos, seguido de inactivação da enzima a 80 ° C durante 10 min para remover os iniciadores em excesso na preparação para a sequenciação.

6. Scaling para Automated Seleções

6.1) à base de manuseamento de líquidos Pipeta

1. Prepara-se uma 1% (w / v) de azul de bromofenol em água e remover partículas insolúveis utilizando um filtro de 0,45 ml.
2. Para determinar a gama linear de absorvância no leitor de placa, preparar uma diluição de 1: a uma solução de azul de bromofenol a 1% em água 1.000, e continuar com duas diluições em série (16 diluições no total).
3. Transferir 100 ul de cada diluição a um plano inferior placa de 96 poços e ler a absorvância a 590 nm. Plot absorção absoluta contra fator de diluição e escolher uma diluição no médio a alto final do intervalo linear de provas posteriores.
4. Adicionar azul de bromofenol à água ou à solução realque vai ser pipetadas com base na diluição escolhida na etapa anterior em volume suficiente para pipetagem para três placas de 96 poços, mais o volume morto no reservatório.
5. Calibrar uma pipeta de canal único para entregar o volume de teste pipetando água sobre uma balança analítica (100 l de água pesa 100 mg na RT.)
6. Utilizando a pipeta calibrada, transferir o volume de teste da solução tingidos com pelo menos três cavidades de um plano inferior placa de 96 poços e ler as suas absorvâncias a 590 nm, em triplicado.
7. Pesar três de fundo plano placas de 96 poços vazios em uma balança analítica e gravar suas massas.
8. Pipeta volume de ensaio de reservatório para cada um dos três placas de 96 poços e medir as suas absorvâncias a 590 nm, em triplicado.
9. Pesar cada placa e calcular a diferença em massa.
10. Em primeiro lugar, avaliar se as absorvâncias em cada poço são uniformes dentro do intervalo de tolerância (por exemplo., +/- 5%) e se são compatíveis com the absorbâncias obtidas por mão-de pipetagem com a Pipetman calibrado. Se os canais particulares são consistentemente acima ou abaixo da entrega (por exemplo, ver Figura 6), siga os procedimentos de reparo e repita o processo de avaliação até que todos os canais de entregar volumes uniformes.
11. Em segundo lugar, uma vez que todos os canais estão confirmados para entregar volumes uniformes, verificar a exatidão de que o volume através do cálculo da diferença de massa média, por poço. Por exemplo, um conjunto manipulador de líquidos perfeitamente calibrado para 100 l entregará 9,60 g de água por placa, ou 0,10 g de água por poço. Se o real volume entregue é consistentemente acima ou abaixo do volume pretendido, em seguida, um fator de correção pode ser aplicada, ou seja, a programação de 110 mL, a fim de realmente entregar 100 l.
    NOTA: Para pequenos volumes, por exemplo, 10 ul, usam dez vezes mais azul de bromofenol na solução tingidos e pré-aliquota de 90 ul de água para as placas de 96 poços à mão, para assegurar que a absorbances são mensuráveis ​​e queda na faixa linear.

6.2) Lavagem da placa automatizado

1. Imobilizar alvo positivo e proteínas de controlo negativo em poços separados de microplacas de 96 poços (duas placas para cada condição a ser testada), conforme descrito na Seção 3.1.
2. Bloquear locais de ligação não específicos por incubação com solução de bloqueio durante uma hora à TA.
3. Adicionar idênticos alíquotas de 100 ul de uma 10 ¹³ ufc / ml alvo de ligação de solução de Fab-fago em PBT a todos os poços em todas as placas e incuba-se com agitação suave à temperatura ambiente durante 2 horas.
4. Lavar duas placas de acordo com cada condição, uma placa para infecção e titulação e uma placa para ELISA.
5. Avaliar a eficácia da lavagem por infecção direta em bactérias e titulação (conforme descrito na Seção 3.3 (sem M13K07 adição) e 7.2.1) ou desenvolvimento com anti-anticorpo M13 HRP e substrato colorimétrico (conforme descrito na Seção 4).
6. Titres fagos from clones específicos, muitas vezes, dar na gama de 10 -10 ^{5 7} fago / ml a partir de uma proteína imobilizada contra o qual se liga especificamente o clone. Alguns ligação residual a proteína de controlo negativo (por exemplo, BSA), deve ser esperado e geralmente 10 ² -10 ⁵ fago / ml são observadas, no entanto títulos muito baixos (isto é., <10 ¹⁾ pode sinalizar excessivamente rigorosas de lavagem, o que pode comprometer uma selecção.
7. Para a ligação do fago determinado por ELISA, comparar os sinais de ligação absolutos para proteínas de controlo positivas e negativas para determinar se a lavagem robótico é equivalente a estabelecidas resultados de lavagem das mãos (Figura 7).

6.3) Washer Placa Descontaminação

1. Para começar, executar o protocolo de descontaminação para ser testado.
   NOTA: Recomendamos a utilização de, pelo menos, o dobro do volume total da linha e privilegiada e mergulhe a cabeça com arruela de hipoclorito de sódio a 5 min em 0,5%, fr recentemente diluídolixívia comercial om (tipicamente de hipoclorito de sódio a 6%).
2. Prime e mergulhe a cabeça com arruela por 5 minutos em (autoclavado) água estéril e, finalmente, preparar o sistema até que as linhas estão cheios de ar.
3. Primeiro as linhas com água esterilizada ou tampão de lavagem.
4. Lave a estéril microplaca de 96 poços uma vez, retire do lavadora e marque com um selo placa estéril. Esta é a placa de controlo antes da contaminação.
5. Aliquota de 100 ul de O / N fago amplificado cultura sobrenadante de todos os poços de uma placa de 96 poços.
6. Lave a placa contendo fago uma vez, em seguida, retire da máquina de lavar e selar com um selo de plástico ou folha de placa. Esta é a placa de controlo de contaminação.
7. Realizar o protocolo de descontaminação está sendo testado. Neste exemplo, repita os passos 6.3.1 e 6.3.2.
8. Lave microplaca estéril uma vez, em seguida, retire da arruela e selo. Este é o teste de placa de descontaminação.
9. Placa 50 ul de fase log E. coli para placas de titulação; esta é a pré-infecplaca de controle ção.
10. Desselar pré-contaminação, contaminação e descontaminação placas de 96 poços e adicionar 100 ul de E. coli em fase de crescimento de fase log de ​​todos os poços, utilizando novas dicas para cada poço.
11. Selar e incubar a 37 ° C durante 30 min a 200 rpm.
12. Placa 50 uL de células infectadas de três poços aleatórios de cada placa de 96 poços de placas de 10 cm de 2YT / carb e incubar a 37 ° CO / N.
13. Transferir 50 uL de células infectadas de todos os poços de cada placa para placas de poços profundos contendo 1 ml de 2YT com 100 g / ml de carbenicilina por poço e crescer O / N a 37 ° C.
14. Repita o protocolo de descontaminação e deixar a máquina de lavar linhas secar.
    NOTA: Não O crescimento / N em placas ou em meio líquido deve ser observado nas placas de controlo de pré-infecção, controle de pré-contaminação ou teste de descontaminação. Muitas colônias e de crescimento deve ser observado na placa de controle de contaminação; Se não, não há conclusões sobre a eficácia doprotocolo de descontaminação pode ser feito. Idealmente, as placas de descontaminação produzirá nenhuma colónia e não O / N crescimento em qualquer um dos poços das placas de S / N. O rigor do protocolo de descontaminação pode ser aumentado com as concentrações mais elevadas do branqueamento, mais tempos de imersão e ciclos adicionais.

7. Entrada / Saída de titulações

7.1) Titulações de Entrada de fagos

1. Dilui-se uma alíquota de 5 ul de fago de 50 ul com PBS estéril-filtrada e misturar.
2. Prepare a diluição em série de 10 vezes em PBS estéril-filtrada para 10 ¹⁰ utilizando uma pipeta multi-canal ou um pipetador de 96 canais.
3. Inocular 5 ul de fago diluído em até 45 ul de E. resistente ao fago T1 células de E. coli em log-fase de crescimento (DO de 0,6-0,8) e incuba-se coberto com um selo respirável durante 30 min a 37 ° C.
4. Placa 5 ul de células infectadas a uma sobre / placa de agar LB suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina e incubar S / N, umt 37 ° C.
5. A concentração de fago pode ser estimada a partir da amostra mais diluída em que colônias aparecem de acordo com os cálculos detalhados na Seção 2.8.

7.2) de saída do fago Pitrations

1. Após eluição dos fagos ligados a placa através da adição de E. coli células, dilui-se uma alíquota de 5 ul de células infectadas com o fago a 50 ul com meios 2YT autoclavados
2. Prepare a diluição em série de 10 vezes em meio 2YT autoclavados a 10 ⁶ utilizando uma pipeta multi-canal ou canal 96 pipetador.
3. Placa 5 ul de células infectadas para sobre uma placa de agar suplementado com 100 ug / ml de carbenicilina e incubar O / N a 37 ° C.
4. A concentração de fago pode ser estimada a partir da amostra mais diluída em que colônias aparecem de acordo com os cálculos detalhados na Seção 2.8.
   NOTA: Em ambos os casos (isto é, entrada e saída de fagos títulos, a comparação com os números de colônias em ambos tetraciclina (cel total del número) e canamicina (fago auxiliar título) também pode ser informativo.

Resultados

O protocolo aqui descrito foi utilizado para isolar fragmentos de anticorpo a uma variedade de ambos os domínios de antigénios structurally- e funcionalmente relacionados com o de bibliotecas combinatórias exibida por fagos de Fab em paralelo. Problemas relacionados com a disponibilidade de antigénio pode ser contornado, em muitos casos, por na identificação de domínios de antigénios silico expressáveis ​​que são apropriados para selecção de anticorpos ^23. Ao acoplar a expressão de antigénio para selecção de ...

Discussão

Ao conduzir em selecções de anticorpos in vitro, os dois principais determinantes do sucesso selecção são 1) o isolamento de alvos antigénicos bem dobradas para a selecção em cima e 2) a disponibilidade de uma biblioteca de anticorpos de alta diversidade funcional. Em muitos casos, a disponibilidade de quantidades suficientes de bem-dobradas, proteína de comprimento completo pode ser limitante. Uma abordagem para superar esta limitação é a utilização de domínios identificados a partir da análise de bio...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MATERIAIS
Novo agitador de incubadora empilhável Brunswick Innova44	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator Sistema de pipetagem de bancada manual de 96 canais	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Agitador de microplacas	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 centrífuga de bancada	Thermo Product
ELx405 Selecione a arruela de microplacas de poço profundo	Biotek	ELX405USD
Robô automatizado de seleção de fagos de alto rendimento personalizado	S & P Robotics
Tubo de falcão cónico de plástico: 50 ml	VWR	21008-178
Tubo de plástico cónico Falcon: 15 ml	VWR	89039-668
	microcentrífuga Axygen de 1,7 ml Placa	Maxisorp
	Sigma	M9410-1CS
Bloco de poços profundos com fundo em V de 96 poços Corning	Corning	3960
Axygen Mini-tubo Microplaca estéril de 96 poços caixa azul	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Película de vedação de placa adesiva respirável	VWR	60941-084
REAGENTES
Nome	Empresa	Número de
polietilenoglicol	Bioshop	PEG800.1
extrato de levedura	Bioshop	YEX401.1
bio-triptona	Bioshop	TRP402.1
N-Z amina	Sigma	C7290
glicose	Sigma	G8270-1KG
lactose	Bioshop	LAC234
glicerol	Bioshop	GLY001.500
carbenicilina	Bioshop	CAR544.10
canamicina	Bioshop	KAN201.25
tetraciclina	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
fosfato de potássio monobásico	Bioshop	PPM302.1
fosfato de sódio dibásico	Anachemia	84486-440
cloreto de sódio	Bioshop	SOD001.10
cloreto de potássio	Bioshop	POC308.1
cloreto de cálcio	Bioshop	CCL302.500
sulfato de magnésio	EMD	MX0070-1
cloreto de magnésio	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
ágar	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel corante	Invitrogen	S33102
ácido fosfórico	Acros Organics	201140010
lisozima	Bioshop	LYS702.25
benzonase	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
coquetel inibidor de protease comprimidos	Roche	11 836 170 001
Resina Ni-NTA	Qiagen	1018240
estoque de 1.000x fagos auxiliares (M13K07) (1013 fago por ml)	NEB	N0315S
HRP conjugado com anticorpos específicos M13-HRP (anti-M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
Substrato TMB: misture volumes iguais de substrato TMB e H2O2 peroxidase	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq polimerase	Genscript	E00007
Exonuclease	GE Healthcare	EZ0073X-EZ
Fosfatase alcalina de camarão	GE Healthcare	E70092Z-EZ