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Artigo de método

Vascular transferência de genes de Metallic Stent superfícies usando Adenoviral Vetores Tethered através hidrolisável reticulantes

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DOI:

10.3791/51653

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12 de agosto de 2014

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1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Esses estudos relatam a ligação reversível de vetores genéticos adenovirais a superfícies metálicas sem revestimento de stents e discos de malha modelo. A liberação sustentada de partículas virais competentes para transdução contingentes à hidrólise de reticuladores usados para imobilização vetorial resulta em uma expressão transgênica durável e específica do local em células vasculares e em artérias com stent.

Resumo

Reestenose intra-stent apresenta uma das principais complicações de procedimentos de revascularização à base de stents utilizados para restabelecer o fluxo de sangue através de segmentos criticamente estreitados de artérias coronárias e periféricas. Stents endovasculares capazes de liberação ajustável de genes com atividade anti-reestenose pode apresentar uma estratégia alternativa para actualmente utilizado stents farmacológicos. A fim de atingir tradução clínico que os stents de genes deve apresentar uma cinética previsível de libertação do gene vector imobilizada-stent e transdução específica do local da vasculatura, evitando ao mesmo tempo uma resposta inflamatória excessiva normalmente associado com os revestimentos de polímero utilizados para a retenção física do vector. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para tethering sem casaco de vetores de genes de adenovírus para stents com base em uma ligação reversível das partículas de adenovírus para polialilamina bifosfonato (PABT) -Modified superfície de aço inoxidável via reticulantes hidrolisáveis ​​(HC). Uma família debifuncional HC (aminas e tiol-reactivo) com uma média de t 1/2 de hidrólise do éster em cadeia que varia entre 5 e 50 dias foram utilizados para ligar o vector com o stent. O procedimento de imobilização vector é tipicamente levada a cabo a cerca de 9 horas e consiste em várias etapas: 1) a incubação das amostras de metal numa solução aquosa de PABT (4 horas); 2) desprotecção de grupos tiol instalados em PABT com tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) aumento da capacidade de tiol reactivo da superfície do metal por reacção das amostras com polietilenoimina derivatizados com grupos piridilditio) (PDT (2 h); 4) a conversão dos grupos tióis a PDT com ditiotreitol (10 min); 5) alteração de adenovírus com HC (1 hora); 6) purificação de partículas de adenovírus modificados por meio de cromatografia de exclusão de tamanho da coluna (15 min) e 7) a imobilização de partículas adenovirais tiol-reactivo na superfície de aço tiolada (1 hr). Esta técnica tem uma ampla aplicabilidade potencial além stentsfacilitando a engenharia de superfícies de dispositivos bioprostéticas para melhorar sua biocompatibilidade com a entrega de genes mediada por substrato para as células de interface do material estranho implantado.

Introdução

A eficácia da terapia do gene como uma modalidade terapêutica é dificultada pela capacidade de direccionamento pobre de vectores de terapia génica 1,2. A falta de segmentação resultados adequados nos níveis sub-terapêuticos de expressão do transgene no local de destino e leva a uma ampla disseminação de vetores de órgãos não-alvo 3, incluindo os responsáveis ​​pela montagem respostas imunes contra tanto o vetor e codificado produto terapêutico 4, 5. Um potencial significa para compensar a promiscuidade de transdução e promover a segmentação é introduzir vetores de genes no local desejado de uma forma que impede a sua disseminação através do sangue e da linfa. Tipicamente, esses esforços contar com um sistema de entrega localmente injectáveis ​​compreendendo quer de vectores virais ou não virais misturados com fibrina, colagénio ou matrizes de hidrogel de ácido hialurónico 6-10, que são capazes de sustentar transitoriamente vectores de genes no local de injecção por aprisionamento físico thin em uma rede polimérica.

Outro paradigma geralmente aceite para terapia génica localizada utiliza imobilização de vectores de genes para a superfície de próteses implantadas 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, brônquios, os stents urológicas e gastrointestinais, pacemakers, juntas artificiais, malhas cirúrgicas e ginecológicas, etc.) São utilizados anualmente em dezenas de milhões de pacientes 13. Embora geralmente eficaz, estes dispositivos são propensas a complicações que são inadequadamente controlados pelo práticas médicas atuais 14-17. Próteses implantáveis ​​apresentam uma oportunidade única para servir de plataforma de proxy para tratamento de terapia genética localizada. Do ponto de vista farmacocinético, derivatização da superfície dos implantes médicos com doses relativamente baixas de entrada dos vectores de genes resulta na obtenção de ambas as concentrações locais elevadas de vectores de genes para a interface do implante / tecido e reduzindo a cinética de their eliminação desta localidade. Como conseqüência de residência prolongada e aumento da captação pela população de células alvo, vetor imobilização minimiza propagação do vetor gene. Assim, a inoculação acidental de tecidos não-alvo é reduzida.

Superfície tethering de vetores de genes em biomateriais implantáveis ​​(também denominado como a entrega do gene mediada por substrato ou entrega gene fase sólida) foi implementado em cultura de células animais e experimentos utilizando ambos específica (antígeno-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e não-específico (23-26 carga, van der Waals) interações. A ligação covalente de vectores para a superfície do dispositivo implantado tem sido anteriormente considerado como não funcional uma vez que demasiado fortes ligações com a superfície exclui vector internalização pelas células alvo. Recentemente foi demonstrado que esta limitação pode ser superada através da utilização de espontaneamente hidrolisável reticulante utilizado como o tetdela entre a superfície metálica modificada das proteínas da cápside de stent e o vector adenoviral de 27,28. Além disso, a taxa de libertação do vetor e naturalmente o tempo de expressão do transgene in vitro e in vivo, pode ser modulada, com o uso de agentes de ligação cruzada hidrolizáveis ​​que exibem diferentes cinéticas de hidrólise 28.

O presente documento fornece um protocolo detalhado para a ligação covalente reversível de vectores adenovirais para a superfície do metal activado e apresenta uma configuração experimental útil para estudar os eventos subsequentes de transdução in vitro de músculo liso e células endoteliais em cultura e in vivo no modelo da carótida de rato de angioplastia de stent .

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Protocolo

1 Preparação de Cy3 marcado adenovírus para as experiências de libertação

  1. Suspender 2 x 10 12 partículas de anúncio vazio (aproximadamente 2 x 10 11 unidades infecciosas) em 650 mL de tampão de carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9,3).
  2. Dissolve-se o conteúdo de um frasco (0,2 mg) de corante fluorescente reactivo com amina (Cy3 (NHS) 2) em 1 ml de BC a uma concentração final de 0,2 mg / ml.
  3. Adicionar 100 ul da solução de corante a uma suspensão de vírus, de vórtice durante 5 segundos e incubar durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100-200 rpm).
  4. Equilibrar uma coluna de 20 ml de Sepharose 6B com PBS. Adicionar 750 ul de Cy3 marcado suspensão Ad gota a gota, para o centro do leito de gel.
  5. Após a suspensão viral permeia a resina, adicionar 5 ml de PBS. Rejeitar o eluído.
  6. Adicionar 0,5 ml de PBS e recolher o fluido em um recipiente de vidro escrito. Repita este passo 10x recolher um total de dez fracções de 0,5 ml.
  7. º Ensaioe coletadas frações por espectrofotometria (260 e 280 nm) para conteúdo de DNA viral.
  8. Reunir as fracções que continham mais do que 10% do total (soma de F1 a F10) da densidade óptica (DO) a 260 nm. Nota: Normalmente as frações F3, F4, F5, F6 e são agrupados e misturados.
  9. Re-ensaio das frações agrupadas mistas, por espectrofotometria (260 e 280 nm) e ensaio por fluorimetria (550 ex / 570 los nm) para conteúdo de DNA viral e Cy3 marcado proteína da cápside, respectivamente. Nota: Uma curva de calibração com Cy3 (NHS), que cobre a gama de 2 10 -9 -10 -13 mol / L e é preparado fluorimetricamente ensaiada na mesma placa como as fracções reunidas.
  10. Calcula-se o rendimento do vírus marcado e densidade de rotulagem. Suponha que as partículas de 1,19 x 10 12 vírus / ml corresponde a uma unidade de OD para um 1 cm de percurso 29. Use a fórmula: Rendimento = [(260 nm /1.19)*10 12 * quantidade V / Ad entrada OD] * 100, onde, OD 260nm é o de ópticansity da formulação reunida a 260 nm, e V é o volume da formulação reunidas (ml) para calcular o rendimento de recuperação de Ad (%). Utilizar a fórmula: Etiquetagem Densidade = C * 6,02 * 10 23 / ​​(OD 260nm /1.19)*10 12, em que C é a concentração da formulação Cy3 agrupada (moles / ml) e OD 260nm é a densidade óptica da formulação no pool 260 nm para calcular média densidade rotulagem Cy3. NOTA: A recuperação típica de vírus marcado é> 70% da dose de entrada. A densidade de rotulagem é 600-800 moléculas fluoróforo por partícula do vírus único.
  11. Anúncio vazio em porções menores (tipicamente 5 x 10 11 partículas) adequados para as experiências de libertação individuais alíquota Cy3 marcado. NOTA: protocolo atual especifica o uso de Ad Cy3 marcado apenas no experimento de liberação. Todos os estudos são realizados de transdução com vectores não-marcado.

2 Ativação de amostras de metal

  1. Lave as s inoxidávelteel malha discos ou stents de aço inoxidável consecutivamente em isopropanol (5 min x 2) e clorofórmio (5 x 2 min) a 55 ° C com agitação (100 rpm). Remover o solvente.
  2. Aquece-se as amostras durante 30 min a 200 ° C.
  3. Dissolver bisfosfonato polialilamina com grupos tiol latentes instalados (PABT 27,28,30) em água (1-2% w / v) a 72 ° C com agitação (100 rpm). Ajustar o pH para 4,5-5 com KHCO3.
  4. Incubar as amostras de metal na solução PABT para 2-4 horas a 72 ° C com agitação (100-200 rpm). NOTA: O procedimento pode ser interrompido neste ponto. As amostras são estáveis ​​durante 3 dias a 4 ° C.
  5. Lavar as amostras três vezes com água duplamente destilada (ADD).
  6. Expor as amostras de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, 15 mg / ml em tampão acético 0,1 M) durante 15 min a 28 ° C com agitação (100-200 rpm).
  7. Enxágüe em 5x desgasado DDW.
  8. Expor as amostras a 2% polietileneimina com grupos -piridilditio instalados (PEI PDT 27,28,30) em DDW desgaseificado em atmosfera de árgon durante 2 horas a 28 ° C com agitação (100-200 rpm). NOTA: O procedimento pode ser interrompido neste ponto. As amostras são estáveis ​​por 2 semanas a 4 ° C.
  9. Lavar as amostras três vezes com ADD.
  10. Expor as amostras até 10 mg / ml de ditiotreitol / DDW para converter grupos piridilditio para tióis.
  11. Enxágüe novamente em 5x desgasado DDW.

3. Adenovirus Ativação e superfície de metal Imobilização

  1. Suspender 5 x 10 11 partículas de qualquer anúncio eGFP ou Ad Luc (aproximadamente 5 x 10 10 unidades infecciosas) em 487,5-495 mL de tampão de carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9,3). Nota: Para os estudos de liberação, use 5 x 10 11 de Cy3 marcado partículas vazias de anúncios (ajustar o volume para 487,5-495 mL com CBB).
  2. Dissolver HC com diferentes taxas de hidrólise 28 [(rapidamente (t 1/2 = 5 d), intermediária (t 1 /2 = 12 d) e, lentamente (t 1/2 d = 50) HC, ou seja, RHC, IHC ou SHC; Figura 1] ou não hidrolisável de reticulação (NHC), sulfo-LC-SPDP em CBB a 20 mM.
  3. Imediatamente adicionar 5-12,5 ul de solução de agente de ligação cruzada para a suspensão de vírus, para um volume total de 500 ul (200-500 uM concentração final de agente de ligação cruzada), vortex e incubar durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100 a 200 rpm).
  4. Equilibrar uma coluna de 20 ml de Sepharose 6B desgaseificado com 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Adicionar gota a gota 500 ul de suspensão de trans-Ad-ligante modificadas para o centro do leito de resina.
  5. Adicionar 5 ml de desgasado EPBS. Rejeitar o eluído.
  6. Adicionar 0,5 ml de desgasado EPBS e recolher o fluido em um recipiente de vidro escrito. Repita este passo 10 vezes recolhendo um total de dez fracções de 0,5 ml.
  7. Determinar OD das fracções recolhidas utilizando espectrofotometria a 260 e 280 nm, e converter OD para os títulos de vírus (1,19 x 10 12 / ml Correponde a uma OD) 29.
  8. Reunir as fracções que continham> 10% do vírus eluídas (Nota: normalmente, as fracções F3-F6). Repetir o ensaio de titulação espectrofotométrica a suspensão reunida.
  9. Transferir suspensão viral para o frasco com as amostras de metal activados (como por 2,11). Incubar numa atmosfera de árgon durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100-200 rpm). Nota: As amostras de metal Ad-tethered obtidos neste passo são mais utilizados nas experiências de libertação e de transdução subsequentes descritos nas secções 5-7 do protocolo.

4 Quantificação de Ad Vector associado a superfícies por PCR

  1. Prepare malhas formulados com imobilizada na superfície Ad eGFP tethered via NHC, SHC, IHC e RHC (n = 3 para cada tipo), conforme descrito nas seções 2 e 3.
  2. Use um kit QIAamp DNA Micro para isolar DNA viral. Coloque as malhas individualmente em tubos de plástico de 1,5 ml contendo 200 ul de mistura composta de 180 ul de ATL bpode ser prejudicado e 20 ul de proteinase K (ambos a partir do kit). Adicionar uma quantidade conhecida de partículas Ad eGFP (como padrões para a curva de calibração) nos tubos separados contendo a mesma mistura. Incubar a 56 ° C durante a noite, sem tremer.
  3. Adicionar 200 ul de tampão de AL (do kit), mistura por vortex, adicionar 200 ul de etanol a 100%, e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Transferir a mistura de cada tubo sobre uma coluna individual MinElite (do kit) e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Lavar os tubos contendo malha com 180 ul de tampão fresco ALT, adicionar sobre as respectivas colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Descarte os eluatos.
  5. Adicionar 500 ul de tampão AW1 (do kit) para as colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Descarte os eluatos.
  6. Adicionar 500 ul de tampão AW2 (do kit) para as colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min.
  7. Descarte os eluatos.
  8. Girar a 14.000 rpm durante mais 3 minutos until as colunas estão completamente secos. Descarte os eluatos.
  9. Adicionar 50 ul de água MilliQ grau nas colunas. Girar a 14.000 rpm por 5 min. Recolha de 50 mL de eluído de coluna em cada tubo de recolha individuais (do kit).
  10. Preparar a solução de PCR Master Mix combinando multiplica do seguinte (12,5 ul de Potência Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 mL de 10 mM eGFP sentido iniciador [5 'ACG TAA CCG ACG ACA AGT TC -3'], 0,63 mL de 10 mM eGFP anti-sense cartilha [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 mL de água MilliQ-grade). Multiplique esses volumes pelo número de reações previstas, acompanhada de controles "nenhum DNA".
  11. Carga de 5 mL de eGFP DNA anúncio (do passo 4.8) e 20 l de PCR Master Mix em três cavidades de uma placa de reação de 96 poços Optical MicroAmp. Selar a placa com MicroAmp Optical Adhesive Film. Girar a placa a 1000 rpm durante 1 min para eliminar as bolhas de ar.
  12. Colocar a placa para dentro do receptáculo de uma máquina de PCR 7500 Real-Time. No menu principal do 7500 Sistema SDS Software (v1.4 ou superior), selecione "Criar nova experiência". Clique em "Next". Na tela "Assistente de Novo experimento" escolher Sybr Verde a partir de um menu de rolagem e clique em "adicionar". Clique em "Next" para obter um layout da placa. Destaque todos os poços a serem analisados, selecione Sybr Verde. Destaque consecutivamente há poços de controlo DNA, padrões e amostras de DNA Ad eGFP, e marcá-los usando respectivas designações do menu de rolagem.
  13. Alterne para a guia instrumento. Selecione "Adicionar a fase de dissociação", alterar o volume bem da inadimplência 50 ll a 25 mL. Clique em Iniciar.
  14. Analisar os resultados de PCR utilizando depois de verificar o resumo QC para outliers e outras irregularidades.

5. Lançamento Cinética de hidrolisável Cruz-tethered-vinculador Partículas vetor do modelo de malha de aço

  1. Lavam-se as amostras de malha derivatizados com Ad Cy3 marcado através RHC, IHC, SHC e NHC (como por 3,9) em 1% de BSA / PBS (1 hr x 3) com agitação (100-200 rpm).
  2. Utilizando fórceps estéreis finas, colocar as malhas em poços individuais de uma placa de 96 poços previamente cheio com 200 ul de tampão de eluição (0,1% de BSA / 0,1% de Tween-20 / PBS).
  3. Tome imagens fluorescentes de uma parte central de cada malha. Anote as configurações do microscópio e da câmera CCD utilizado para aquisição de imagem.
  4. Proceder ao ensaio da placa fluorimétricamente (550 ex / 570 em) no modo bem-scan com redução máxima. Usar os poços com malhas não derivatizadas como um controlo de fundo.
  5. Incubar a placa a 37 ° C com agitação (50 rpm).
  6. Em tempos predeterminados (intervalo 1-30 dias) aspirar o tampão de eluição, sem perturbar as malhas e adicionar 200 ul de tampão de eluição de fresco. Repita os passos de 4,3-4,5 após substituir o buffer.

6. Transdução de Cultivadas Cells por Mesh-imobilizadas Vetores de anúncios

  1. Lavar o eGFP Ad - ou Ad Luc -derivatized malhas três vezes com PBS estéril durante 5 minutos com agitação (100 rpm).
  2. Utilizando fórceps estéreis finas remover os discos de malha, um por um e colocá-los individualmente em poços de uma placa de 96 poços com o tipo de células de interesse na fase log de crescimento.
  3. Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C, em 5% de CO 2.
  4. Use o respectivo ensaio não-terminal endpoint (microscopia de fluorescência, fluorimetria para eGFP ou imagem de bioluminescência para luciferase) para determinar a extensão ea distribuição espacial da expressão do gene nos poços.
  5. Opcionalmente, o meio substituto para PBS para aumentar a sensibilidade do ensaio de fluorimetria (485/535 nm), se for baixa expressão eGFP é esperado. Nota: Se um fluorómetro está equipado com capacidade de bem-scan, ler a placa de um modo bem-verificação para avaliar a distribuição espacial de células nos poços que expressam eGFP. Taxas PBS para o meio após a conclusão de fluorimetria.
  6. Imagem das células transduzidas nos poços com malhas Ad eGFP -eluting (ambos subjacentes e periféricas da malha), utilizando o conjunto de filtros FITC. Tome imagens representativas em 40-200X ampliação. Registe as definições exatas do microscópio de fluorescência ea câmera CCD utilizado para a aquisição de imagens.
  7. Adicionam-se 5 ul de estoque luciferina em PBS (10 mg / mL) directamente aos poços com Ad Luc -eluting malhas para uma concentração final de 500 ug / ml e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 minutos antes da imagiologia bioluminescência . Aspirar mídia e substituir por meios livres de luciferina após imagem.
  8. Ensaios de ponto de extremidade de repetição em horários predeterminados (até 2 semanas) para estudar a cinética de expressão do gene repórter seguintes transferência de genes mediada por substrato.

7 Validação de Preservada Capacidade Transdução A lento momentos

  1. Prepare o anúncio de eGFPmalhas rivatized usando RHC, IHC, SHC e NHC para vector tethering (como por 2,1-2,11 e 3,1-3,9) e coloque individualmente as malhas em poços de uma placa de 96 poços com 60-80% de células endoteliais aórticas bovinas confluentes (BAEC ).
  2. Analisar transdução de cultura BAEC com imobilizado de malha Ad eGFP em 1 e 2 dias de colocação pós-mesh usando microscopia de fluorescência e de fluorimetria (como por 6,4-6,5).
  3. 48 horas após o início da transdução de lavar os poços contendo malha com PBS, duas vezes.
  4. Adicionar 200 ul de tripsina a 0,25% / EDTA a cada poço e incubar durante 15 min a 37 ° C com agitação (100 rpm). Lavar 3x com PBS.
  5. Use microscopia fluorescente e fluorometria para determinar a completa remoção de todas as células-eGFP positivas associadas com as malhas.
  6. Semente recentemente passadas BAEC nas cavidades com malhas parcialmente libertados a uma densidade de sementeira inicial de 60-80% (2-2,7 x 10 4 células / cavidade).
  7. Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2 por períodos pré-determinados de tempo (1-10 dias) antes da avaliação dos "novos" eventos de transdução por microscopia fluorescente e fluorimetria.

Implantação de stent na carótida modelo de Stent Angioplastia Rato 8 eluição Ad-

  1. Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo estão em conformidade com os regulamentos federais sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia. Para aderir a condições cirúrgicas assépticas todos os instrumentos são esterilizados em autoclave. Para garantir a esterilidade contínua um esterilizador talão é empregado entre o uso dos instrumentos em até cinco animais consecutivos.
  2. Prepare Ad Luc -eluting stents de acordo com a 2,1-2,11 e 3,1-3,9. Armazenar os stents derivado de vírus e em PBS estéril, a 4 ° C durante não mais do que 24 horas antes de usar.
  3. Anestesiar ratos machos Sprague-Dawley (400-450 g) com injecção IP de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). DeTermine a profundidade da anestesia por pata resposta pitada e tônus ​​muscular. Aplicar pomada oftálmica veterinário para prevenir o ressecamento da córnea e esclera. Nota: A anestesia por inalação, com 4% e 2% de isoflurano (1 L / min) para a indução e manutenção de anestesia, respectivamente, é possível, mas impede o acesso livre à região do pescoço do animal e, assim, não é recomendado para um utilizador inexperiente.
  4. Reavaliar profundidade da anestesia por toe pitada. Raspar e assepticamente prep pescoço e região superior do tórax. Administrar antibiótico (cefazolina, 20 mg / kg; IM), analgésico (meloxicam, 0,5 mg / kg; SC) e solução salina (10 ml / kg; SC). Cateterizar a veia da cauda, ​​com um cateter de 24 G e administrar heparina (200 IU / kg, IV). Nota: Uma dose de 10 mg / kg (IM) enrofloxacina (Baytril) pode ser usado em vez de cefazolina. Evite o uso de antibióticos que faltam atividade significativa contra bactérias Gram-positivas. 10-15 mg / kg, o carprofeno (Rimadyl) pode ser usado em vez de meloxicam como um analgésico de preferência. Analgésicos narcóticos (e.g., morfina, buprenorfina) devem ser evitados por causa das suas propriedades de deprimir a respiração.
  5. Realize uma incisão na linha média através da pele e pescoço fascia. Use técnicas de dissecção romba para isolar a artéria carótida externa esquerda. Amarre-off da artéria carótida externa no local acessível mais distal. Aplicar uma ligadura temporária deslizante para a origem da artéria carótida interna.
  6. Faça uma incisão arteriotomia 2 mm na artéria carótida externa esquerda.
  7. Inserir um cateter 2 French Fogarty, para dentro da artéria carótida comum, através da incisão na artéria carótida externa. Inflar a ponta do cateter com soro fisiológico e passar 3x a partir do arco da aorta até à bifurcação da carótida, para desnudar o endotélio.
  8. Deslize um pedaço de tubo (1,04 mm de diâmetro externo, 0,99 mm de diâmetro) sobre o cateter Fogarty e na artéria carótida comum. Retirar o cateter de Fogarty.
  9. Montagem e cravar uma Luc Ad -derivatized stent sobre o balão de um 1.5mm cateter de angioplastia de diâmetro. Inserir o stent através da tubagem de Teflon e fazê-la avançar para a secção média da artéria carótida comum. Evitar esfregar o stent contra a parede do tubo ou vaso.
  10. Implantar o stent com 12 atm por 30 segundos e retirar o cateter de angioplastia.
  11. Amarre-off da proximal da artéria carótida externa ao site arteriotomia e solte a ligadura temporária sobre a artéria carótida interna.
  12. Reparação da ferida operatória em camadas com o funcionamento de 4.0 Vicryl sutura e grampear a pele.
  13. Recuperar o animal em uma almofada de aquecimento até ambulatório e voltar para sua gaiola isolado. Embora sem sinais de dor ou desconforto são tipicamente exibida pelos animais pós-operatórias após o primeiro 12 horas após o procedimento, considerar a extensão da terapia de meloxicam (0,5 mg / kg, SC diária) durante 72 horas.

9 Bioluminescência imagem das Arterial Gene Expression

  1. Em pontos de tempo pré-determinados (1 dia - 3semanas intervalo) após a implantação de stents revestidos com gene na artéria carótida comum, anestesiar o rato usando anestesia inalatória com isoflurano (2-4% de isoflurano em oxigênio).
  2. Remova os grampos cirúrgicos, assepticamente preparar o local e reabrir a ferida operatória. Usando o acesso a dissecação, re-ganho contundente à artéria carótida comum esquerda e separá-lo do nervo vago e do tecido conjuntivo adjacente.
  3. Prepara-se uma mistura de 50 mg / ml em PBS luciferina e 25% de Pluronic F-127 em PBS (1: 4 v / v) e armazená-la em gelo. Nota: Esta formulação apresenta-se como uma solução viscosa, a 4 ° C e transforma-se em gel imediatamente em contacto com o tecido, a 37 ° C.
  4. Aplicar 200 l de uma luciferina / Pluronic mistura refrigerada directamente exposta ao segmento da artéria carótida comum e verificar a solidez do gel.
  5. Colocar o animal em decúbito dorsal na câmara de imagem do aparelho IVIS-Spectrum e manter a anestesia isoflurano com uma máscara facial.
  6. No acquisitina janela do painel de controle (Living Imagem, versão 4.2 ou superior) escolher a posição "B" (6,6 centímetros câmera eo objeto a distância) e binning fator "meio" nos menus suspensos, intitulado "campo de visão" e "binning", respectivamente. Digite "2,5 centímetros" na caixa de altura assunto. Escolha "min" como uma unidade de tempo na caixa de "tempo de exposição", e escolher um valor numérico de "2".
  7. Três minutos após a aplicação do gel / Pluronic Luciferin, comece a aquisição da imagem, clicando no botão "Adquirir" na tela. NOTA: Imagem tempo de aquisição pode variar de 1 a 6 minutos dependendo da potência do sinal previsto.
  8. Depois de adquirir a imagem, lavar o gel off com soro fisiológico e aplique o espaço periarterial com gaze e algodão aplicadores estéreis.
  9. Feche o ferimento com sutura Vicryl e grampear a pele.
  10. Recuperar o animal e regressar à sua gaiola. Repita a imagem mais tarde tOs pontos de ime para estudar a evolução temporal de expressão arterial provocada pelos vectores Ad imobilizada-stent.
  11. Alternativamente, realizar imagem após a administração sistêmica da luciferina. Anestesiar e preparar o animal como por 9,1-9,2. Cateterizar a veia da cauda, ​​com um cateter de 24 G e cateter seguro com fita adesiva cirúrgica.
  12. Prepara-se uma solução de luciferina, em PBS (50 mg / ml) e injectar 1 ml da solução através do cateter ao longo de um intervalo de 10 segundos. Um minuto após a injeção de iniciar a aquisição de imagens como por 9,7-9,8. Nota: A taxa de injeção mais rápido (<10 seg) pode provocar a atividade de apreensão e parada respiratória. O animal deve ser sacrificado se convulsões ou parada respiratória ocorrer durante o exame.
  13. Siga o passo 9.10.

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Resultados

Experimentos Vector lançamento

Ancoragem de vectores adenovirais para a superfície dos implantes, incluindo dispositivos de intervenção, tais como stents, aproxima-se o vector para o local da doença, evitando parcialmente a falta de orientação física dos vectores. No entanto, para ser capaz de atingir os efeitos terapêuticos através da transdução de tecido alvo, o vector tem de ser libertado a partir da superfície (Figura 2). A utilização de agentes de ligaç...

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Discussão

O protocolo apresentado descreve um método operacional para a entrega de genes mediada substrato conseguida através de fixação reversível de vectores adenovirais sem casaco para as superfícies de aço inoxidável. Embora desenvolvido para a finalidade específica de terapia genética baseada em stent de reestenose vascular, esta técnica tem aplicações muito mais amplas nas áreas de biomateriais, implantes biomédicos e terapia gênica.

Embora os estudos apresentados têm apenas utilizado aço ...

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Divulgações

O desenvolvimento do protocolo e os estudos apresentados neste artigo foram apoiados em parte pelas bolsas de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (I.F. 0735110N e M.C. 10SDG4020003), pela concessão HL 72108 (R.J.L.) do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos EUA T32 007915 (S.P.F.). Os cateteres de angioplastia foram gentilmente doados pela NuMED (Hopkinton, NY). Os autores desejam agradecer a assistência de secretariado da Sra. Susan Kerns.

Agradecimentos

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
316 discos de malha de aço inoxidávelElecton Microscopy SciencesE200-SS
Stents genéricos de aço inoxidável de grau 304Pedido
de Laserage AdeGFPUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversidade da Pensilvânia Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV placas de 96 poçosCostar3635
Fluorometria placas de 96 poçosCostar3915
Placas de cultura celular de 96 poçosFalcon353072
Cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Ditiotreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
EspectrofotômetroMolecular Devices SpectraMax 190
SpectrofluorômetroMolecular DevicesIncubadora Orbital SpectraMax Gemini EM
VWR1575R
Forno de fluxo de ar horizontalShel Lab1350 FM
Centra-CL2 centrífuga International Equipment Company426
Misturador de vórtice digitalFisher Thermo Scientific02-215-370
Microscópio de fluorescência Eclipse TE300Nikon TE300
DC 500LeicaDC-500
7500 Sistema de PCR em tempo realApplied Biosystemsnão disponível
Estação de bioluminescência IVIS SpectrumPerkins-Elmernão disponível
Sal dipotássico EDTASigma-AldrichED2P
Soro bovino albumina fração V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Dumont fórcepsFine Science Tools11255-20
A10 linha celular ATCCCRL-1476
Células endoteliais aórticas bovinasLonzaBW-6002
Luciferina, sal de potássioGold BiotechnologyLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS sem cálcio e magnésioGibco14190-136
Soro bovino fetalGemini Bio-Products100-106
Solução de penicilina/estreptomicinaGibco11540-122
DMEM, alta glicoseCorning cellgro10-013-CV
0,25% Tripsina/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
Placa de Reação Óptica MicroAmp de 96 poçosApplied BiosystemsN8010560
Filme Adesivo Óptico MicroAmpApplied Biosystems4360954
Cephazolin Apotexnão disponível
Loxicom (Meloxicam)Norbrooknão disponível
Heparina sódicaAPP Pharmaceuticalsnão disponível
Ketavet (Cetamina)VEDCOnão disponível
Anased (Xylazine) Lloidnão disponível
Forano (Isoflurano) Baxternão disponível
Pinça curva de íris MoriaFerramentas de ciências finas11370-31
Pinça Graefe extrafina curvaFerramentas de ciências finas11152-10
Pinça Dumont # 5Ferramentas de ciências finas11252-20
Tesoura de mola VannasFerramentas de ciências finas15018-10
Tesoura fina - ToughCutTesoura cirúrgica Fine Science Tools14058-09
FineScience Tools14101-14
Sutura Vicryl (5-0)EthiconJ385
Sutura (4/0 seda) Fine Science Tools18020-40
Michel clipes de suturaFine Science Tools12040-02
Dilatador de feridas (espéculos oculares de Lancaster)KLS Martin34-149-07
Esterilizador de esferas quentesFine Science Tools18000-45
Aplicador de clipe de sutura MichelFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV cateterBeckton-Dickinson381412
2F Fogarty cateterEdwards Lifesciences120602F
Tubo de teflonVention041100BST
PTA cateterNuMedencomenda
Compressas de gazeKendall Healthcare9024
Aplicadores de algodãoSolon ManufacturingWOD1003
Seringa SalineBaxter281321
10 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
seringa de 1 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Clippers com lâmina #40Oster 78005-314
Transpore fita cirúrgica3MMM 15271
Puralube vet pomadaPharmadermnão disponível
personalizadoCâmera CCD personalizada

Referências

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

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