Artigo de método

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

DOI:

10.3791/51721

⸱

25 de outubro de 2014

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

Resumo

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Membros da família SNF2 de ATPases geralmente funcionam como componentes de complexos de remodelação de cromatina de múltiplas subunidades que regulam a dinâmica do nucleossomo e a acessibilidade do DNA, catalisando a remodelação do nucleossomo dependente de ATP. Dissecar bioquimicamente as contribuições de subunidades individuais de tais complexos para a reação de remodelação da cromatina dependente de ATP em várias etapas requer o uso de ensaios que monitoram a produção de produtos de reação e medem a formação de intermediários de reação. Este protocolo JOVE descreve ensaios que permitem medir as atividades bioquímicas de complexos de remodelação da cromatina ou subcomplexos contendo várias combinações de subunidades. A remodelação da cromatina é medida usando um ensaio deslizante de nucleossomo dependente de ATP, que monitora o movimento de um nucleossomo em uma molécula de DNA usando um método baseado em ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA). A atividade de ligação ao nucleossomo é medida monitorando a formação de mononucleossomos ligados a complexos de remodelação usando um método semelhante baseado em EMSA, e a atividade de ATPase dependente de DNA ou nucleossomo é testada usando cromatografia em camada fina (TLC) para medir a taxa de conversão de ATP em ADP e fosfato na presença de DNA ou nucleossomos. Usando esses ensaios, pode-se examinar as funções das subunidades de um complexo de remodelação da cromatina comparando as atividades do complexo completo com aquelas que não possuem uma ou mais subunidades. O complexo de remodelação da cromatina INO80 humano é usado como exemplo; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser adaptados ao estudo de outros complexos de remodelação da cromatina.

Introdução

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SnF2 complexos de remodelação da cromatina família incluem um SnF2-como centro ATPase subunidade 1,2. Alguns ATPases função SnF2-como enzimas individuais de subunidade, enquanto que outros funcionam como a subunidade catalítica de grandes complexos de multi-subunidades. Elucidar os mecanismos moleculares pelos quais cada uma das subunidades da cromatina complexos de remodelação contribuir para as suas actividades requer a capacidade de realizar ensaios bioquímicos que dissecam o processo de remodelação.

ATP-dependente remodelação nucleossoma pelo complexo INO80 humano e outras enzimas remodelação da cromatina pode ser concebido como um processo multi-etapas que começa com a ligação da enzima à remodelação nucleossomas, seguido por activação do seu ADN e / ou nucleossoma-ATPase dependente, translocação da enzima na remodelação ADN nucleossomal, e eventual reposicionamento de nucleossomas 1,2. Compreender os detalhes moleculares do dependente de ATP processo de remodelação da cromatina requires dissecção da reacção remodelação nos seus passos individuais e definição das contribuições das subunidades individuais do complexo de remodelação da cromatina para cada passo da reacção. Tais análises exigem a capacidade de analisar remodelação nucleosome e outras atividades utilizando substratos moleculares definidos in vitro.

Em um protocolo JOVE anterior, descrevemos os procedimentos utilizados para gerar complexos de remodelação da cromatina INO80 e subcomplexos com composições de subunidades definidas 3. Aqui, apresentamos três ensaios bioquímicos que permitem a análise quantitativa da ligação, DNA- e nucleosome ativado ATPase, e as atividades de remodelação nucleossomos associados com tais complexos nucleosome.

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Protocolo

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1. ATP-dependentes nucleossoma Remodelação Ensaios

Para medir as actividades de ATP-dependente nucleossoma remodelação, imunopurificada INO80 ou subcomplexos INO80 são incubados com ATP e um substrato mononucleosomal, que contém um único nucleossoma posicionado numa extremidade de um fragmento de ADN de 216 pb, 32 P-marcado. Os produtos da reacção são então sujeitos a electroforese em géis de poli-acrilamida nativo.

  1. Para gerar o, '601' fragmento de ADN marcado com 32 P, a partir de amplificar pGEM-3Z-4 601 um fragmento de ADN de 216 pb que contém uma sequência de 601 posicionamento nucleossoma posicionada-final, utilizando os oligonucleótidos 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5'-como AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG frente e verso, primers.
    1. Defina-se uma reacção de PCR de 100 ul, tal como descrito na Tabela 1.
    2. Realizar as reacções de PCR num termociclador utilizando o seguinte programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 seg a 94 ° C, 30 seg a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando com 7 min a 72 ° C.
    3. Após a reacção de PCR é terminado, remover os nucleótidos não incorporados fazendo passar os produtos de reacção duas vezes através de colunas de giro livre de nuclease.
    4. Executar 5 ul do produto de PCR purificado em gel de agarose a 1,2% para confirmar que a reacção de PCR gerado a ~ 216 pb Fragmento de ADN desejado.
    5. Dilui-se 5 ul do produto de PCR purificado de 20 vezes, e medir a concentração de ADN, utilizando um espectrofotómetro de UV. O rendimento médio é de aproximadamente 40 ng / mL.
    6. Medir a radioactividade de 1 ul do produto de PCR purificado em um contador de cintilação. Estimar a eficiência de marcação pelo cálculo do cpm / ng. A reacção de marcação bem sucedida é esperado para produzir ~ 15,000 cpm / ng de fragmento de ADN 601.
  2. Transferir nucleossomas células HeLa na rotulada 601 DNA utilizando um método de diluição em série 5.
    1. Misture 2 pmol de32 601 fragmento de ADN marcado com P com 6 ug de nucleossomas Hela (preparado tal como descrito 5) em 50 ul de um tampão contendo 1,0 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM e 1 mM TDT e incubar a 30 ° C durante 30 min.
    2. Sequencialmente diluir a mistura a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M de NaCl por diluição com 12,5 mL, 20,8 mL, e 41,6 ul, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, e 1 mM de DTT, com uma incubação de 30 min a 30 ° C depois de cada diluição.
    3. Diluir a mistura de 0,2 M e, em seguida, para NaCl 0,1 M por adição de 125 mL e, em seguida, 250 ul do mesmo tampão contendo 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, e 200 ug / ml BSA, com uma incubação de 30 min a 30 ° C entre as duas diluições finais. Armazenar o substrato mononucleosome a 4 ° C durante até 3 meses.
  3. Realizar as reacções de nucleossomas deslizante dependentes de ATP num volume total de 10 ul. A reaction componentes estão listados na Tabela 2. vez que a concentração de NaCl para a actividade óptima remodelação nucleossoma INO80 ~ é NaCl 50 mM (resultados não publicados), ajustar a concentração total de cada reacção em NaCl a 50 mM, tendo em conta a quantidade de NaCl contido nas preparações de nucleossomas e enzima.
    1. Antes de começar a configurar os ensaios, lança gel de poli-acrilamida nativas (18 x 16 cm). Para preparar um único gel contendo 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida a 37,5: 1), TBE 0,5 x (45 mM Tris borato, 1 mM EDTA), 0,01% de persulfato de amónio (APS), e 0,001% de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED), mistura dos ingredientes listados na Tabela 3. Permitir que o gel de polimerizar durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente.
    2. Entretanto, para cada reacção a ser realizada, combinar num tubo siliconizado microcentrífuga de 1,5 ml pré-arrefecido ~ 20 nM ou INO80 INO80 subcomplexo (preparado como descrito 3) com uma quantidade de tampão EB100 ( Tabela 4) suficiente para dar um volume de 4,75 mL. Imediatamente re-congelar qualquer restantes fracções contendo INO80 em gelo seco em pó ou em azoto líquido.
    3. Defina-se um cocktail mestre com o resto dos ingredientes, ampliação de um factor de 'X' (em que X = número total de reacções 3). A quantidade de cada ingrediente necessário para uma única reacção de 10 uL é listada na Tabela 5; a receita deve ser dimensionado de acordo com o número de reacções a serem realizadas. Misture bem, tocando o tubo ou pipetando para cima e para baixo com um Pipetman e girar o tubo por alguns segundos em uma microcentrífuga de bancada.
    4. Dispensar 5,25 ul do cocktail de mestre para cada um dos tubos de reacção estabelecidas no passo 1.3.2. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Iniciar as reacções através da transferência de tubos de reacção para um banho de 30 ° C de calor bloco ou água e incubar durante 2 horas.
    5. Enquanto isso, a preparar »removendo mistura 'cocktail contendo ADN competidore nucleossomos, ampliação por um fator de X (X = número total de reações + 4). A quantidade de cada ingrediente necessário para a preparação de 1,5 ul da mistura para remoção de uma única reacção está listado na Tabela 6; a receita deve ser aumentado de acordo com o número de ensaios a serem realizados.
    6. Terminar reações adicionando 1,5 mL da mistura de remover. Misture bem, girar para baixo, e incuba-se a 30 ° C durante mais 30 min.
    7. Enquanto isso, a pré-rodar o gel de poliacrilamida nativa, em uma unidade de electroforese vertical, a 100 V durante 30 min a 4 ° C, usando TBE 0,5 x como tampão de corrida com uma barra de agitação magnética no interior da câmara inferior para manter a circulação tampão constante.
    8. Para carregar a amostra, adicionar 2,5 l de corante de carga contendo TBE 3x, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol e 0,25% xileno cianol FF. Misture bem, girar rapidamente as amostras, e carregar no gel usando dicas de carregamento.
    9. Submeter o gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação.
    10. Para detectar o sinal, a transferência do gel para uma pilha de duas folhas de papel de filtro. Envolver o papel de filtro com o gel no topo usando plástico transparente, e, em seguida, expô-la a um ecrã de fósforo de armazenamento a 4 ° C durante o tempo desejado.
    11. Digitalize o ecrã com um sistema de scanner de imagens isótopo e analisar os dados utilizando software apropriado.

2. Mononucleosome Ensaios de Ligação

Para ensaiar a afinidade de ligação de um dado complexo INO80 para mononucleosomes, realizar um deslocamento Electrophoretic Mobility Assay (EMSA), utilizando o substrato mononucleosomal gerado no passo 1.2.

  1. Configure a reação Misturas para ensaios de ligação, tal como descrito para os ensaios de remodelação nucleossomos, mas omitir o ATP e remover mix das reações; incubar a 30 ° C durante 30 min.
  2. Adicionar 2,5 uL de corante de carga de cada uma das misturas de reacção, e aplicam-se a um gel de poliacrilamida nativa, contendo 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37,5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% APS, 0,001% e TEMED.
  3. Usando 0,5 x TBE como tampão de corrida, correr o gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação e expor a um ecrã de fósforo de armazenamento.

3. ADN e Nucleosome-ATPase Os ensaios dependentes

Realizar ensaios ATPase em misturas de reacção contendo 5 ul de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM de NaCl, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 DTT, 0,1 mM de PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complexo INO80 ou quantidade de complexo a ser ensaiada INO80 criou três reacções paralelas, uma contendo tampão EB100 para medir DNA- ou nucleossoma-ATPase independente, contendo um DNA de plasmídeo circular fechado (5000 pb, ~ 30 nM) para medir DNA- ATPase dependente, e outro contendo Hela oligonucleosomes (~ 185 nm) para medir nucleosome-ATPase dependente. Configure todas as reações no gelo.

  1. Para cada reacção, combinar 10-50 nM dos INO80 ou INO80 subcomplexos imunopurificados com uma quantidade de tampão EB100 suficiente para dar um volume de 2,2 mL em 1,5 mL lubrificados microtubos previamente arrefecidos. Imediatamente re-congelar quaisquer fracções contendo INO80 em gelo seco em pó ou em azoto líquido.
  2. Configurar um cocktail mestre. A quantidade de cada ingrediente necessário para uma única reacção é apresentado na Tabela 7. Scale-se a receita por ampliação de um factor de 3 (X + 2) 1, em que X = número de preparações INO80 a ser ensaiada.
  3. Para preparar contendo tampão 'sub-cocktails' só, DNA, ou nucleossomos, dispensar 2.5 (X + 2) ul do cocktail mestre em três tubos separados. Adicionar 0,3 (X +2) ul de qualquer EB100, o DNA de plasmídeo circular fechado (1,5 ug / uL), ou Hela oligonucleosomes (1,5 ug / uL) e misturar bem.
  4. Dispensar 2,8 ul da sub-coquetel adequado para os tubos de reacção contendo enzimas criados em rep 3.1. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar; evitar a introdução de bolhas.
  5. Para iniciar reações, transfira os tubos de reacção a um bloco de 30 ° C de calor.
  6. Depois de 5, 15, 30, e 60 min de incubação, a mancha de 0,5 ul de cada mistura de reacção sobre uma cromatografia em camada fina de celulose polietilenoimina (CCF) da placa (20 x 10 cm) de uma linha recta, pelo menos, 1,5 cm a partir da extremidade inferior . Retornar imediatamente tubos de reação ao bloco C calor de 30 ° para múltiplos pontos temporais podem ser tomadas a partir de um único tubo. Depois de manchas, seque as placas de TLC usando um secador de cabelo.
  7. Transferir as placas de TLC de uma câmara de vidro contendo o suficiente fosfato de potássio 0,375 M (pH 3,5) para permitir que o fundo de 0,5 cm da placa de TLC a ser submergido na solução.
  8. Cobrir a câmara, e se desenvolvem até a frente da fase de líquido atinge o topo das placas de TLC. Immediate secar os pratos, cuidadosamente, com um secador de cabelo.
  9. Expor as placas de TLC secas para uma tela de fósforo de armazenamento à temperatura ambiente.Digitalize o ecrã com um sistema de scanner de imagens isótopo e determinar a quantidade de substrato ATP radioativo e produtos ADP.
  10. Para calcular a quantidade de ATP hidrolisado, multiplicar o ATP% hidrolisado por a quantidade de ATP presente na mistura da reacção de partida com a seguinte fórmula: pmol de ATP hidrolisado = 10 pmol de ATP na reacção de partida x [ADP / ATP (+ ADP)]

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Resultados

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As figuras mostram os resultados representativos de testes bioquímicos usados ​​para caracterizar as actividades, incluindo INO80 nucleossoma deslizante (Figura 1) e de ligação (Figura 2) e DNA- ensaios ou ensaios de ATPase dependente de nucleossoma (Figura 3).

A experiência apresentada na Figura 1 compara a capacidade dos complexos INO80 intactas purificado através de FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E e de INO80 subcomplexos purific...

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Discussão

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Para garantir que a remodelação nucleosome e atividades ATPase observamos em ensaios dependem da atividade catalítica de complexos INO80, e não sobre a contaminação de remodelação e / ou enzimas ATPase, nós nucleosome rotineiramente ensaio remodelação e atividade ATPase de versões cataliticamente inativos de complexos INO80, purificado em paralelo com o tipo selvagem INO80 utilizando o mesmo procedimento. Uma reacção de controlo negativo a que falta o ATP também deve ser realizada quando se examina a actividade de remod...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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O trabalho no laboratório dos autores é apoiado por uma doação do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM41628) e por uma doação para o Instituto Stowers de Pesquisa Médica do Fundo de Pesquisa Médica Helen Nelson da Greater Kansas City Community Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Inibidor de Protease CoquetelSigmaP8340
10x PCR reage buffer Roche Ciência Aplicada 
Roche Taq DNA PolimeraseRoche Applied Science 
Colunas de Spin Nuclease NucAway sem Nuclease AmbionCat. # AM10070
ATP ultrapuro USB/Affymetrix77241 25 UM
albumina de soro bovinoSigmaA9418 
40% Acrilamida/Bis 37.5:1Amresco0254-500ML
DNAs de esperma de salmão sonica GE Healthcare27-4565-01
10% persulfato de amônio (APS)Thermo Scientific17874
benzonase NovagenCat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmolTermociclador PerkinElmerBLU013Z250UC
PCR PTC 200MJ ResearchPTC 200
Unidade de eletroforese vertical HoeferSE600X-15-1.5
tubos de microcentrífuga lubrificados de 1,5 ml de Fósforo Costar3207
 Molecular Dynamics63-0034-79
Papel de filtro 3MMWhatman 28458-005VWR
Typhoon PhosphorImager Software GE Healthcare8600
ImageQuant GEHealthcarever2003.02
Placas de Vidro TLC, PEI-Celulose FMillipore5725-7
Immobilon-FL 7 x 8.4MilliporeIPFL07810
Medidor de pesquisa de uso geral com janela final ou panqueca Sonda GM (Geiger-Mueller)BiodexModelo 14C
1143509400111435094001Tela de Armazenamento Membrana de Transferência

Referências

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  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  3. Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
  4. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
  5. Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
  6. Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
  7. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
  8. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
  9. Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
  10. Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
  11. Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
  12. Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
  13. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  14. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
  15. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  16. Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).

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