Summary
この方法は、マウスモデルにおける新規薬物の薬物動態を評価するために、頸動脈を介して安定した薬液を送達することを目標に開発された。
Abstract
新規システムへの薬物、薬剤の組み合わせ、または薬物送達の使用を提案する場合、人は研究モデルにおける薬物の薬物動態を評価しなければならない。マウスモデルの使用は、しばしば、前臨床創薬および薬剤開発1-8に重要なステップであるので、均一な、再現可能な方法でマウスに薬剤を導入するためのシステムを設計する必要がある。理想的には、システムは、設定時間経過にわたって定期的に血液サンプルの収集を可能にするはずである。質量分析による薬物濃度を測定する能力は、10、9、研究者は、個々のマウス1の経時的血漿薬物レベルの変化に追従することを可能にした。本研究では、パクリタキセルは、3つを超える連続動脈注入としてトランスジェニックマウスに導入した時間に、血液サンプルを同時に設定した時点で後眼窩採血によって採取した。頸動脈注入は頸静脈注入への潜在的な代替案、要因などである乳腺腫瘍やその他の障害物が頸静輸液は非現実的。この技術を使用して、血漿及び組織中のパクリタキセル濃度は、頸静脈内注入と比較して同様のレベルを達成した。このチュートリアルでは、当時通ってカテーテルの端をスレッド、マウス頸動脈にカテーテルを挿入し、保護する方法を示して、成功裏に個々のマウスモデル用に最適化されたカテーテルを調製することにより、頸動脈カテーテルを挿入する方法を紹介しますマウスの首の、薬物流入の制御された速度を提供するためにポンプにマウスをフック。複数の低容量眼窩採血を経時的に血漿中薬物濃度の分析を可能にする。
Introduction
頸動脈を介して薬物注入機器および技術を最適化することにより、確実かつ再現可能に行うことができる。それは細部への微調整と注意を必要としないものの、手順は、複雑ではありません。優れたケアおよび器用さは頸動脈を分離し、一般的に実践を通して取得することができるカテーテルを挿入するために必要とされる。経験豊富な技術者による手術は1時間を超えないようにしてください。 （マウスが実際の薬物注入に反応するかもしれないが）手術の成功の後、マウスは、正常で健康な表示され、そして薬物は制御され、均一な連続用量で投与してもよい。血液サンプルを頸動脈以外の部位から採取されなければならない。後眼窩採血を収集しやすく、薬物濃度の分析のための十分な証明した。
最適なサイズと形状のカテーテルは、成功した注入11を行う際の貴重な資産である。私たちは、カテーテル使用可能commerciallを見つけたyはしばしば大きすぎるおよび/またはマウスの頚動脈への便利なアクセスを可能にするには柔軟である。これは、注入シリンジにマウスを接続するために使用されるポリエチレン管からファッションカテーテルよりも好ましいが判明した。したがって、すべてのチューブ、コネクタ、針は、注入アセンブリを簡略化し一貫性のある寸法は、であった。この技術を使用して、それがまだ表示されている点を越えて動脈内にカテーテルの先端をプッシュする必要がなく、頚動脈への血流が、カテーテルが最初に固定された後まで復元されない。これは、動脈を穿刺するか、血流の高い圧力によって押し出されたカテーテルを有することの危険を低減する。カテーテルのデザインは、ここに所定の位置に保持するために「バンプ」、そう縫合糸およびサージカルテープとよくカテーテルの確保が優先されるが組み込まれていない。
注入は、臨床投与のよりよい模倣として、一般的な静脈内ボーラス注射に好ましいかもしれないタキサン3、12、13などの薬物。ここに記載の技術は、もともと頸静脈または大腿静脈へのアクセスが乳腺腫瘍の成長および/ または挿入領域の過剰な血管新生によって除外されたことを特徴マウスモデルへの注入を可能にするために開発された。この方法は、多くの場合であっても無腫瘍マウスでは適切かもしれない：頸静脈壁の傾向は以上の失敗の挿入が完了する故障が生じリッピングするための単離および頸動脈をcatheterizingものの、わずかにより侵襲的な、我々は、それが望ましい頸静脈に発見された3時間のタイムコース。
ここに示された結果は、C57BL / 6Jからですが（社内で飼育）マウス、我々が正常にトランスジェニック的に操作マウスモデルにおける薬物動態に従うことを、FVBおよびミックスド株を含むマウスのいくつかの株の中にパクリタキセルを注入するためにこのテクニックを使用している細胞のトランスポーターの機能をダウンレギュレートする。採取した血液および組織サンプルはpaclitaxの予想レベルを示したエル、頚静脈点滴1後に見られるレベルの範囲内である。この技術は、他のマウスモデルおよび他の注入溶液と同様に機能することが期待されてもよい。
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Protocol
このプロトコルは、フォックスチェイスがんセンター施設内動物管理使用委員会により、実験動物施設によって承認され、動物の人道的な扱いのための制度ガイドラインに従ってであることが判明している。
1.前準備
- カテーテルの調製：間伐、平滑化し、エンド（ 図3A）を形成するように変更、ポリエチレンチューブの短い長さからカテーテルを準備します。事前に複数のカテーテルを作成し、無期限に保存します。
- ブンゼンバーナーを点灯し、低い安定した火炎を確立するために調整します。ポリエチレンを柔らかくするために炎に近いチュービングホールド。チューブが溶け始めると、ゆっくりとチューブの薄くなった部分、約0.25ミリメートル外径を作成するために両端を引き離す。
- 面取りエンド薄いセクションに沿って約0.75センチメートルをカット。これは十分なチューブは、過度に長いカテーテルを作成せずに、動脈内に固定することが保証されます。
注：目の上の長い細い終わり電子カテーテルを詰まらせる傾向がある。過度に長い端も大幅にカテーテルの液体体積容量を変更するために十分な液体を保持することができる。 - 適切に加熱されたが、最後は少し丸みを帯び拡大になったときに - 炎を素早く通過することによって面取り終わりを鈍ら。動脈内に挿入する際に役立ちますバックやや先端フックは、チューブを固定する。
- それは薄いし始めるポイントからチューブ6.0センチメートルをカット。これは、非常に扱いやすいカテーテルを作ることは、首を終了し、ホールド快適で動作するように縫うのに十分な長さであるが、過剰チュービング上かじるまたは最初の生理食塩水をクリアするにはあまりにも多くの余分な注入容量を必要とするからマウスを防ぐのに十分に短い。
- 約0.2ミリリットルヘパリン溶液の注射器を準備し、鈍化針をトッピング。カテーテル（ 図3B）の広い方の端に針を挿入します。気泡内がないことを確実にするために注意しながら、ヘパリンとカテーテルを埋めるチュービング。無菌エリアの上に置き、ヘパリン注射器やカテーテルを設定します。シャーレにカテーテル（単数または複数）を配置し、ガンマ線照射の20 Gyのに曝露することによって、ガンマ線照射によりカテーテルを殺菌。あなたは、ガンマ放射線源へのアクセス権を持っていない場合は、そのようなガス - または化学滅菌などの滅菌の他の手段を、調査するためにあなたの動物施設に確認してください。ポリエチレンは熱が滅菌することができないように、オートクレーブしないでください。
- 食塩鉛（ 図3B）の作成 。
- 気泡のないラインを確保するために注意しながら、約0.5ミリリットルの第2のシリンジ滅菌生理食塩水を準備します。
- チューブ2枚目、約15センチカットし、鈍化注射針の上にスリップ。チューブの自由端にコネクタポートを接続します。
- 生理食塩水の流れがスムーズにリードを通して生理食塩水を少量を前進させることによって、障害物がないことをテストします。フロースルーをチェックするために、カテーテルの挿入後に、この生理食塩水のリードを使用するカテーテル、及び血液のラインをフラッシュする。無菌エリアの上に置き、生理食塩水の注射器を設定します。
- 手術前に、オートクレーブ処理することにより、機器を殺菌、あるいはガス滅菌またはガラスビーズ滅菌による。
- 無菌手術領域を準備します。
- このように70％エタノールまたは二酸化塩素などの消毒剤でベンチや顕微鏡の表面を拭きます。清潔な使い捨て、吸収パッド付きベンチ、顕微鏡ベースをカバーしています。
- しっかりと粘着テープで取り付けられたきれいな、吸収紙の二つの層で覆うことによって、外科ボードを準備します。
- 彼らは容易にアクセス可能になるように、（物質一覧にカタログされている）すべての外科用品をレイアウト。
- 滅菌縫合糸の3つの長さを8cmずつカットし、他の電源で取っておく。それは簡単に利用できるようになりますポート（ 図3B）を配置します。
2.手術
- 動物の作製
- Anesth精密気化器に接続された麻酔チャンバー内の2〜3％イソフルランへの曝露によるetizeマウス。チャンバーからマウスを撤回し、マウスの首/胴体上部から毛を剃ると、右耳下の（カテーテル出口のサイト）。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医ワセリン眼軟膏を管理します。動物は（少なくとも二つ分）を分取する前に吸入チャンバー内でマウスに十分な時間を可能にすることによって、または準備中、ノーズコーンを介してマウスにイソフルランを投与することによって、外科準備で目覚めていないことを確認してください。麻酔室にマウスを返します。
- マウスが十分に不活性である場合には、マウスの鼻及び口を覆って麻酔ノーズコーンを配置し、無菌の手術領域に移動し、ノーズコーンにイソフルランの流れをそらす。鉗子で足をつまんで適切な麻酔を確認してください。マウスは全く反応を示さない場合は、次のステップに進みます。
- 頭が向いていると、その背中の上でマウスを置き捜査官。耳、前後の足を確保し、後足を粘着テープや他の拘束装置を備えた外科用ボードに安定したマウスを維持する。ポビドンヨードおよび70％エタノールで切開領域を清掃してください。
- 頸動脈の単離
- 縦首の正中線の右側に少しカット1cmにしてください。気管（ 図4A）を露出するために脂肪と筋肉を分離するために鉗子を使用してください。気管（ 図4B）に平行に走る頸動脈の位置を確認します。
- 慎重に動脈（ 図4C）を覆う筋膜別々に鉗子を使用しています。軽く頸動別に迷走神経を引っ張る、との間の空間に鉗子を挿入します。限り（少なくとも3ミリメートル）できるだけアップ慎重に優しくオープン筋膜のギャップを作成するための鉗子、および喉頭（前端）に近い動脈の分岐点から、動脈から神経を引き離し、（後部）（ 図4D）。
- どんな再一掃動脈が十分に特定されるまでmaining筋膜（ 図4E）。湿った組織を維持するために時折手術領域への生理食塩水の滴を追加し、したがってより少ない脆くランダムに引き裂くしにくい。
- カテーテル挿入のための縫合糸の配置と動脈製剤（ 図4、図5）。
- 動脈の下に絹縫合糸を描画するために鉗子を使用してください。できるだけ前方（ 図4F）に向かって限り動脈を閉鎖する安全な結び目を作る。
- 動脈の下の2番目のスレッドを描きます。一時的に（ 図4F）可能な限り後方に向かって限り動脈を閉鎖するリトラクタブル結び目を作る。
- 動脈の下に第三のスレッドを描画します。迅速な配置（ 図4G）の後にカテーテルを固定するために使用された最初の2本の縫合糸との間の非常に緩い結び目を結ぶ。
- 70％エタノールのビットでそれらを濡らすことで邪魔にならないように、すべての縫合糸の両端を持ち。
- 縫合糸で、少し張りつめた動脈を引っ張って下結び目をつかむ。ニック·上記の動脈が、非常に近い、前方縫合（ 図4H）。あまり深く切らないように注意してください、しかし口に障害物がないことを確認するスリットをご確認ください。
- どちらかの端で空気の大ポケットを作成しないようにしようと、注射針からヘパリンを満たしたカテーテルを取り外します。 （右利きの場合）一般的に下向きに、やや右に、快適な角度で斜面を配置するためにカテーテルを操作します。
- 縫合糸につかまっは少し張りつめた残りの動脈を保つためにしながら、そっとスリット（ 図4I）にカテーテルを挿入します。前方縫合糸を保持し、カテーテルを介して（動脈を穿刺する面取り終了を引き起こす可能性がカテーテルを過度に押し上げる）ダウン動脈を引っ張って鉗子を使用してください。慎重にカテーテルと前方縫合糸を解放する。
- 動脈へのカテーテルの入り口に近い、真ん中の縫合糸の結び目を締めてカテーテルを固定します。タイトなトリプル結び目を作るが、カテーテルを通して流れを妨害するほどきつく引っ張らないようにしてください。さらに動脈への入り口の下に、前方縫合糸でそれを結びつけることによってカテーテルを固定します。
- 再びラインに気泡を導入して回避しようと、コネクタプラグによってカテーテルに生理食塩リードを取り付けます。
- 後部縫合糸の両端をつかみ、そっと結び目を解放するために引っ張る。動脈ダウン縫合糸を操縦、カテーテルの端部の上に（スレッドを削除しないでください）。血液がカテーテル内に流れるべき。全く血流がない場合には、静かにくびれを削除しようとするカテーテルを小刻み。
- 流れが妨げられていない表示されたら、少し真ん中縫合糸の上に、追加的な結び目を作るために（事後縫合から）最後のスレッドを使用しています。
- それぞれの手で鉗子で、ちょうど前方縫合下のカテーテルに保持するために鉗子の1ペアを使用し、それが簡単に側に曲がるように相互に、カテーテル内にキンクを押してください。第二キンクを作成するために繰り返します。これにより、カテーテルの自由端は、動脈の壁に対して横方向に向けるために、カテーテルの先端を強制することなく、マウスの頭の後ろ側に引っ張られることを可能にする。
- 口と鼻の上に配置ノーズコーンを維持し、その（左）側にマウスを回し、そして70％エタノールおよびポビドンヨードで切開領域を清掃してください。小切開下記と右耳の後ろ（約4mm）を作る。 首空洞に、頬を通してチャネルを作成するために皮膚の下に鈍い中空プローブを作業中に、皮膚のオープンフラップを保持するために鉗子を使用してください。それは、代わりに腺と皮膚との間に行くことにしようと、唾液腺の周りにプローブを持参することをお勧めします。慎重に終了したプローブのためのスペースを解放するために鉗子を使用してください。
- 首に終了するには、プローブを介してポートプラグ/カテーテルを通します。あまりにもハード引っ張らないでください。カテーテルは破砕や血管や臓器を収縮されていないことを確認してください。
- 胸の切開、および絹またはステープルとの緊密な創傷に局所鎮痛剤を投与する。
- 麻酔からマウスを外し、動物がきれいに回復できるよう、加熱パッドの上のスペース（場所ケージを温めまたは加熱ランプ）の下で、少なくとも30分間インキュベートした。
3.輸液
- 5ミリグラム/パクリタキセル/ mlのメタノール溶液のアリコートを準備します。
- 15ミリリットルの遠心分離管にパクリタキセル50mgを測定します。無菌10mlのメタノールを加える。キャップチューブ。粉末が溶解するまで手でまたは室温で回転振とう機上で回転する。
- 20小、冷凍庫安全なチューブにアリコート溶液500μlを、-20℃で保存。
- すぐに注入する前に、室温または37℃の水浴中で個々のアリコートを解凍する。
- 注入ポンプ（ 図6）を準備します。
- 約40cmのポリエチレンチューブの長い長さをカット。一端に平滑化した針、およびその他のコネクタポートを接続します。
- 目の速度を計算するために、ほとんどのプログラム可能なポンプは、シリンジバレルの直径を必要とする（既知の内径を有する注射器に薬剤を策定電子ポンプアーム）。注射器に針を取り付け、針とチューブを介した薬物をロードします。
- 製造者の指示に従ってポンプにシリンジを位置づける。総理ポンプ薬はコネクタプラグからスムーズに流れている、それが点滴の準備ができているようにします。
- ポンプには、マウスを接続します。
- 安定したマウスを押したまま、ポートプラグに近いカテーテルをクランプする止血剤を使用しています。プラグを外し、注射器とチューブに取り付けられたコネクタと交換してください。
注：血液は、チューブを通って流れることが起動することがあります。 - 迅速にカテーテルのボリュームをクリアするために、高速ポンプを管理する（チューブの6センチメートルのボリュームを観察を通して経験的に計算された）、その後すぐに必要な注入速度に切り替える。
- 安定したマウスを押したまま、ポートプラグに近いカテーテルをクランプする止血剤を使用しています。プラグを外し、注射器とチューブに取り付けられたコネクタと交換してください。
- 3時間のコースのパクリタキセル注入を続ける。
- これは多くの場合、マウスへの流れの閉塞の兆候であるように接合部に漏れがないかチェックするために時折チューブを監視します。点滴（無気力や多動、不快感の兆候）に予想または予期しない反応のためのマウスを監視します。
- 点滴の長さと性質に応じて、マウスが食べたり飲んますが、金融機関の確立されたポリシーに従って、食料や水へのアクセスを提供するようにしてくださいではないかもしれません。血液の大量のコレクションを、マウスを脱水するための潜在的に注意してください。
- マウスが離れて暑さから滞在することを望むように見える場合を除き、加熱パッドやランプでケージを暖かく保つために続けています。動物は、手術後数時間以内に安楽死されていない場合は、無菌のハウジング条件および手術後疼痛の治療を含む動物の手術後の治療のための計画を実施する。
- （貧しい挿入の徴候である可能性があり）、チューブから多動を通してチューブ、または刺激を引き出していないことを確実にするために、特に最初の数分で、マウスに注視し続ける。マウスがアクティブでない場合は、定数monitoリングが必要になることが、動物は、チューブに絡まれないことを確認するために定期的にマウスをチェックしないことがあります。ハーネスとテザーシステムは、市販されているが、それらの使用は、このプロトコルの範囲を超えている。
- 試料の採取。
- （あなたのプロトコルは、乳房腫瘍モデルを利用して、頚動脈カテーテルを同時に挿入頸静脈カテーテルを介して血液の回収を考慮しない場合）、顎下または眼窩採血によって定期的に血液サンプルを収集する。輸液ラインを引っ張らないように注意してください。後眼窩採血によって収集する場合は、軽く吸入麻酔薬でマウスを麻酔（ 例えばメトキシ）ので1は、マウスを保護するために首筋によってつかむ必要はありません。
- 血漿から血液細胞を分離するためにヘマトクリット遠心機で血液をスピン。相分離の顔にチューブを獲得するために、ファイルまたはダイヤモンドペンを使用してください。チューブを破ると、小さな冷凍庫セーフチューブに、血漿のみを収集します。で保管してください -分析まで80℃である。
NOTE：ヘマトクリット遠心機を使用できない場合は、微量遠心チューブに血液サンプルを転送し、血漿から血液細胞を分離するために高速でマイクロ遠心機スピン。第二チューブに血漿を収集し、-80℃で保存する。 - CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。液体窒素の関心とフラッシュ凍結の臓器から - （50 mg〜約20）の組織を収集します。分析するまで-80℃で保管してください。
4.サンプルの分析
注：このプロトコルの全てのサンプルは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によって外部の研究室で分析した-以下のようパクリタキセル濃度を算出した（LC MS / MS）：
- サンプルからパクリタキセルを抽出します。抽出の前に0.1％酢酸、50％メタノール中で組織サンプルを均質化する。 （メチルtert-ブチルエーテルを用いて、液/液抽出によってパクリタキセルを抽出するMTBE）内部アナログ（ドセタキセル）標準で強化。 MTBE及び乾燥試料を削除します。 50％アセトニトリル、0.1％酢酸溶液中で再懸濁する。
- 校正標準を準備します。 （組織試料0.1〜5000 ng / mlのから、血漿サンプルは1〜20,000 ng / mlでの）基準の最終範囲を得るために、C57BL / 6マトリックスを適切なパクリタキセルの既知の濃度を追加する。上記の研究サンプルの場合と同じ方法を使用して、二重に基準を抽出する。 HPLC / MS / MSは、エレクトロスプレーイオン化を利用することにより、サンプル中のパクリタキセルのピークを測定する。
- 内部標準パクリタキセルの面積比を用いて濃度を計算する。曲線上の嵌めによって標準曲線、および補間された研究サンプルを作成するための校正標準を使用してください。均質化の前に、サンプルの出発重量によって研究サンプルの濃度を正常化する。
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Representative Results
パクリタキセルの分布は165分の低速注入に続いて、15分間高速注入の3時間投与レジメン中に予測可能なパターンに従う。
図1は、頚静脈注入血漿パクリタキセル濃度及び頸動脈、注入の比較を示す。パクリタキセル濃度は、初期の高容量注入後の最初の15分で急速に低下した後、次の150分間にわたって横ばい。比較することによって、貧しい点滴中のパクリタキセル濃度は比較的低いを始める、およびアッセイを通して上下にホバリング。これは、おそらく早期輸液ラインの閉塞によって引き起こされた。アッセイのレコードは、マウスが、薬物の下位投与の考えを裏付け、注入のない、外部反応をほとんど持っていた示した。 図2の終わりに、肝臓および脳組織、ならびに血漿中のパクリタキセルの相対的レベルを示す3時間の点滴。
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図1：頸動脈と頸静脈内注入時の血漿中のパクリタキセル濃度曲線は、個々のマウスにおける血漿パクリタキセル濃度を表す。各マウスはすぐに0.021mg / kg /分の低速、165分の注入に続いて0.42ミリグラム/ kg /分の初期の高速、15分注入、から成る、二相性の注入を受けた。頚動脈内注入についての曲線下面積（AUC）は、約37 / mlの∙分の頸静注入/ mlの約59μgのAUC対∙分であった。頸動脈内注入のために生成さ曲線から計算されたパクリタキセルの半減期は10分であり、注入のために頸静脈11分であった。頸動脈内注入は頸静脈内注入に比べて薬物濃度のほぼ同等のレベルを示している。サイクル上下は、しばしばrの連続低濃度、または濃度貧しい注入をepresent。
図2：組織によるパクリタキセルの濃度はすぐに最後の血液サンプルの3時間のパクリタキセル注入および収集の後、マウスを安楽死させ、肝臓および脳組織試料を採取した。血漿及び組織中のパクリタキセルの濃度レベルは、質量スペクトル分析により得られた。このデータは、 図1の脈注入-マウスから採取した試料を表す。
図3：手術道具。 （A） カテーテル制作：再を可能にしながら、材料費のもの独自のカテーテルを下に続けて引っ張るマウスの年齢やサイズにカテーテルの大きさや形状を調整するための検索者（B）手術前の準備：スリー（3）絹縫合糸、約8cm各;無菌ポートプラグ。生理食塩水の注射器とリード。ヘパリン注射器に取り付けたカテーテル。
図4：頸動脈カテーテル挿入の準備。皮膚を通ってカット（A）は 、腺を脇に移動し、肉眼的に独立した脂肪筋肉を露出するようにするために鉗子を使用しています。（B）に静かに別々の筋肉が気管の右側を公開するために鉗子を使用してください。頸動脈は、（E）（D）。動脈の周りの（C）はブレーク筋膜。気管に平行に走る、頸動脈は別に迷走神経、最大厚肉容器として見えるようになるまで、caroti筋膜を除去していきますdは完全に空洞に沿って隔離されている。後部端で（F）を縫合永久前方端で結び目、スリップノット。（G）第縫合糸が頸動脈の下にねじ込み、非常に緩く結ばれている。（H）動脈がちょうど前方縫合糸の上にニックされている。（ I）動脈にニックにカテーテルを挿入します。カテーテルを介して動脈をプルダウンするための鉗子でつかんで前方縫合。（J）3つのすべての縫合糸で頚動脈内セキュアカテーテル。
図5：縫合糸配置手術部位の略図前後のカテーテルを設置Aは、図4Hに示すように、動脈のニックを添加して、写真図4Gに対応する。
図6：輸液セットアップの模式シリンジは、薬剤で満たされ、鈍針でキャップされる。ポリエチレンラインは、頸動脈カテーテルにシリンジを取り付ける。ポンプはゆっくりと血流に直接均一な用量を送達するために、注射器を圧縮します。
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Discussion
頸動脈内注入は、パクリタキセルの薬物動態のこの研究で重要なテクニックです。頸動脈内注入は迅速に循環系14を通して薬物を分配するための方法である。 3時間の注入は、ボーラス注射よりタキサンのような薬物の臨床的管理の近い模倣である。手術は確実に一人の個人によって実行することができ、手術時間が比較的短く、成功率は> 75％である。サンプルが収集された後、それらを適当な方法により分析されなければならない。我々は、血漿および組織サンプル中のパクリタキセル濃度を決定するために質量分析を使用した。さらにこの手法を検証するために、我々は、分析のための独立した研究室に血液および組織サンプルを送った。このデータは、各動物試験した（ 図1）のための個々の血漿パクリタキセル濃度曲線としてプロットした、パクリタキセルの分布が異なる組織（ 図2）に比較した。それぞれの場合において、それがimで関心のある薬物およびシステムに応じて、薬物の分布および/または代謝を分析するための最良の方法を検討するportant。異なる薬物を測定するための他のオプションは、HPLC-UVまたはイムノアッセイ2を含んでいてもよい。
成功した頸動脈カテーテル法に不可欠な二つの主な要因は、よく昔ながらカテーテルおよび優れた動脈の分離である。マウスモデルの大きさに応じてカテーテルを形作ることは最も重要である。カテーテルの直径が厚すぎると薄すぎるカテーテルが確保しにくい前または注入中に目詰まりしやすくなる一方、動脈への挿入は、過度に困難になる。カテーテル先端の角度、シャープネスも適度な範囲でなければなりません。あまりにも鈍いです先端が動脈に挿入することが困難になりつつ、あまりにもシャープで先端は、動脈壁を穿刺することができる。ここで与えられた測定値は、モデルテンプレートとして、10週齢のC57BL / 6Jマウスに、約20gを用いて誘導した。測定値は、スケーリングされなければならない上下に経験的には、個々のモデルに合うように。
頚動脈の単離は、組織への不必要な損傷を避けるために、大規模な出血を防止するために、繊細な、意図的なプロセスでなければならない。皮下脂肪脂肪は一般的に簡単にメディアの鋭い鉗子に低いと分離することができる。頸動脈の上の筋肉組織は筋線維のバイアスに沿って先端鉗子を微媒体と分離されるべきである。より広範な隙間が必要な場合は、技術者は小血管を破裂を避けるために非常に注意しなければなりません。頚動脈が表示されていると、まだ細かい傾いて鉗子で動脈から離れてtweezedする必要がある筋膜のかなりの量があるでしょう。最後に、迷走神経のいずれかに損傷を与えることなく、頸動脈から分離しなければならない。頚動脈が適切に分離されている場合には、（ 図4E参照 ）、動脈のいずれかの側の空きスペースに、下に鉗子を挿入することが可能であるべきである。
ときトゥル貧しい点滴を撮影BLEは、調査員が適切に予想される用量を送達するためにポンプをプログラムしていることを確認するために、ポンプの指示を見直すことから始めます。その後、慎重に試験動物に導入される音量を変更することを検討。投薬容量が適切であるように、薬物の希釈が計算されなければならない：ボリュームは、動物が許容するのは大きすぎてはいけません、そして理想的に有意な血圧には影響しません。まだボリュームは、ポンプが確実に配信するためにのために十分な大きさでなければならず、接合部で目詰まりを回避するために、定常流を作成します。下駄は、通常の発生となった場合は、小さいゲージ（大きな直径）針とチューブへの切り替えを検討してください。血漿中の薬物含量は、予想レベルに達していない場合、さらに、研究者は、カテーテルが十分に動脈内に配置され、自由流動性のままであるかどうかを判断し、必要に応じてカテーテルの形状/サイズを変更するために、死後マウスを確認してください。
usefulnこの方法のESSは、対象の大きさおよび全般的な健康状態、および注入の時間の意図された長さなどの要因によって制限されることがある。手術や点滴はすでに困窮件名を酷使することができます。でも健康な動物において、頸動脈カテーテルを短期注入、数日、一般に数時間だけ適切である。マウスはそのようなサイトを創傷に局所麻酔の繰り返し適用、または先制全身鎮痛薬として、薬剤注入に応答して、不快感の兆しを見せた場合に使用されるか、痛み緩和の方法を検討してください。それは、この手順を実行するための適切なアクセス許可を取得するために、地元の動物規制機関またはIACUCによって承認され、すべての動物の仕事を持っていることが必要であろう。それ以上の注入を持って、またはマウスを長時間注入に耐えることが必要である場合、代わりの注入方法が検討されなければならない。
研究で頸動脈灌流をマスターした後パクリタキセルの薬物動態のため、我々は他の薬の効果を調べるために、将来的にこの技術を使用する予定、およびC57BL / 6JおよびFVBマウスにおけるAbcc10変調器、および他のマウスモデル。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
我々は、このプロジェクトでのサポートのためにFCCC実験動物施設を承認したいと思います。私たちは、血漿および組織中のパクリタキセル濃度を分析する上で彼らの支援のためにウォルフ·ラボラトリーズ社に感謝します。この作品は、国立衛生研究所EHBにK01CA120091を付与し、フォックスチェイスがんセンターへCA06927によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
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