Summary
Этот метод был разработан с целью предоставления стабильного лекарственного раствора через сонную артерию, чтобы оценить фармакокинетики новых лекарственных препаратов на мышах.
Abstract
Предлагая использование препарата, лекарственной комбинации, или доставки лекарств в новой системе, надо оценить фармакокинетики препарата в модели обучения. Как использование мышиных моделях зачастую жизненно важным шагом в доклинической открытия и разработки лекарственных препарата 1-8, надо разработать систему, чтобы представить наркотики мышам в мундире, воспроизводимым способом. В идеале, система должна позволить сбор образцов крови через регулярные промежутки времени в течение установленного времени, конечно. Возможность измерения концентрации препарата от масс-спектрометрии, позволило следователям следить за изменениями в уровнях в плазме наркотиков в течение долгого времени в отдельных мышей 1, 9, 10. В этом исследовании паклитаксел вводили в трансгенных мышей в виде непрерывной артериальной инфузии в течение трех часов, в то время как образцы крови были одновременно приняты ретроорбитального кровотечений в точках заданного времени. Настои сонной артерии являются потенциальной альтернативой для яремную вену вливаний, когда такие факторы, какопухоли молочных желез или других препятствий сделать яремной настои непрактично. Используя эту технику, концентрации паклитаксела в плазме и ткани достигается такой же уровень, по сравнению с яремной инфузии. В этом уроке мы покажем, как успешно катетер сонной артерии путем подготовки оптимизированную катетер для конкретной модели мыши, а затем показать, как вставить и закрепить катетер в мышь сонной артерии, пропустите конец катетера через спину из шеи мыши, и подключить мышь к насосу, чтобы доставить регулируемой скоростью притока наркотиков. Несколько низкий объем ретро-орбитальной кровотечения позволяют анализировать концентрации в плазме наркотиков в течение долгого времени.
Introduction
Введения препарата через сонную артерию может быть выполнена надежно и воспроизводимо, оптимизируя оборудование и технику. Процедура не сложная, хотя и требует точного управления и внимание к деталям. Улучшенный уход и умения необходимы для изоляции сонную артерию и вставить катетер, который обычно могут быть приобретены через практику. Хирургическое опытным специалистом не должно превышать одного часа. После успешной операции, мышь должно быть нормальным и здоровым (хотя мышь может реагировать с фактическим инфузии лекарственного средства), и препарат (ы) можно вводить в контролируемой, равномерного непрерывного дозирования. Образцы крови должны быть взяты из сайта, кроме сонной артерии; ретроорбитального кровотечения оказалось легко собрать и удовлетворительным для анализа концентрации препарата.
Катетеры оптимального размера и формы являются бесценным активом в выполнении успешного вливания 11. Мы нашли катетеры доступной commerciallу часто, чтобы быть слишком большим, и / или слишком гибким, чтобы позволить для удобного доступа к мыши сонной артерии. Она оказалась предпочтительнее моды катетеров из полиэтиленовой трубы, используемой для подключения мыши к инфузионной шприца. Таким образом, все трубки, разъемы и иглы были последовательных измерениях, которые упрощенных настой сборку. При использовании этого метода, что нет необходимости, чтобы подтолкнуть кончик катетера в артерию мимо точки, где она еще видны, и приток крови к сонной артерии не не восстановлен до окончания катетер сначала закреплены. Это снижает опасность прокола артерии или наличия катетер выталкиваются высокого давления кровотока. Конструкция катетера здесь не включают «поднять», чтобы держать это в месте, так обеспечении катетер хорошо со швами и хирургическое лента является одной из приоритетных.
Инфузионные растворы могут быть предпочтительнее простых инъекций внутривенно болюсно, как лучше имитируют из клинического примененияпрепараты, такие как таксаны 3, 12, 13. По методике, описанной здесь, была первоначально разработана, чтобы позволить вливание в мышиных моделях, где доступ к яремной или бедренной вены была исключена путем роста опухоли молочной и / или избыточной васкуляризации области вставки. Этот метод часто может быть уместно даже в опухолевых свободной мышей: хотя выделения и catheterizing сонной немного более агрессивным, мы обнаружили, что предпочтительнее яремной, потому что склонность яремной стене сорвать привело к более неудачных вставок и неудач, чтобы закончить Время, конечно 3 ч.
В то время как результаты, показанные здесь, из C57BL / 6J (в доме воспитанный) мышей, мы использовали эту технику для успешной влить паклитаксел в нескольких линий мышей, в том числе FVB и смешанных штаммов, следовать фармакокинетики в мышиных моделях трансгенно манипулировать к понижающей регуляции клеточных функций транспортера. В образцы крови и тканей, собранные показал ожидаемые уровни paclitaxEL, в диапазоне от уровней, наблюдаемое после яремной инфузий 1. Этот метод можно ожидать, что одинаково хорошо работать и в других мышиных моделях и с другими инфузионных растворов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Комитетом по Fox Chase онкологический центр институционального уходу и использованию животных в общем и в лабораторных животных фондом, и установлено, что в соответствии с ведомственным руководящим принципам для гуманного обращения с животными.
1. Предварительная подготовка
- Подготовка катетера: Подготовка катетер с короткой длины полиэтиленовой трубки, модифицированного с образованием разбавленной, тупого конца (фиг.3А). Сделайте несколько катетеров заранее и сэкономить на неопределенный срок.
- Зажгите горелку и отрегулируйте установить низкую устойчивое пламя. Держите трубки близко к пламени, чтобы смягчить полиэтилен. Когда трубка начинает плавиться, медленно растащить два конца, чтобы создать утонченную часть трубки, примерно 0,25 мм OD.
- Вырежьте скошенный конец примерно 0,75 см вдоль тонкой части. Это гарантирует достаточно трубки должны быть закреплены в артерии, не создавая слишком длинную катетер.
ПРИМЕЧАНИЕ: длинный тонкий конец на гое катетер имеет склонность забивать. Чрезмерно длинный конец может также проводить достаточное количество жидкости, чтобы существенно изменить жидкого объема тома катетера. - Тупой скошенный конец, быстро проходя через пламя - при правильном подогревом, конец становится немного округлены и дополненное. Кончик крючки немного назад, что помогает закрепить трубку, вставляя в артерию.
- Вырезать трубки 6,0 см от точки, где она начинает тонкий. Это делает очень управляемый катетер, который достаточно долго, чтобы нить до выхода из шеи и держать и работать с комфортом, но достаточно коротким, чтобы предотвратить мышь от грызть избыточного трубки или требуя слишком много дополнительного объема инфузии, чтобы очистить первоначальный физиологический раствор ,
- Подготовьте шприц примерно 0,2 мл раствора гепарина, увенчанный притупленной иглы. Вставьте иглу в широком конце катетера (Рис 3В). Заполните катетер гепарином, будьте осторожны, чтобы гарантировать, что нет никаких пузырьков вНКТ. Установите гепарин шприца и катетера в сторону на стерильной зоне. Стерилизация катетеров гамма-облучением, путем размещения катетера (ы) в чашке Петри, и подвергая до 20 Гр из гамма-облучением. Если у вас нет доступа к источнику гамма-излучения, проконсультируйтесь с вашим животным объекта для исследования других средств стерилизации, например, газо- или химической стерилизации. Не автоклав, как полиэтилен не может быть тепловой стерилизации.
- Создание солевым свинца (рис 3b).
- Приготовьте второй шприц примерно 0,5 мл стерильного физиологического раствора, соблюдая осторожность, чтобы обеспечить без пузырьков линию.
- Отрежьте второй кусок трубы, примерно 15 см, и скользить на притупленной иглы шприца. Приложить порт разъема к свободному концу трубки.
- Проверьте, что поток солевого раствора беспрепятственно плавно продвижении небольшой объем физиологического раствора через свинец. Используйте этот физиологический лидерство после катетера, чтобы проверить поток черезкатетер, и, чтобы избавиться линию крови. Установите физиологический шприц в сторону на стерильной зоне.
- До операции, стерилизации оборудования в автоклаве, или, альтернативно, по стерилизации газа или стеклянных шариков стерилизации.
- Подготовьте стерильную хирургическую область.
- Протрите стендовые и микроскопа поверхностей с дезинфицирующим такие как 70% этанола или диоксида хлора. Обложка скамейки и микроскоп базу с чистого располагаемого, впитывающей прокладки.
- Подготовка хирургического доска, покрывая двумя слоями чистой, впитывающей бумаги, надежно прикрепленными клейкой лентой.
- Выложите все хирургические материалы (как каталогизированы в список материалов), чтобы они были легко доступны.
- Вырезать три длины стерильной шва, 8 см каждый, и отложите в сторону с другими поставок. Поставьте порт, где она будет легко доступна (Рис 3B).
2. Хирургическое
- Подготовка животных
- Anesthetize мыши под воздействием 2-3% изофлуран в анестезии камеры, подключенной к точности испарителем. Вывод мышь из камеры, и брить волосы от шеи / верхней части туловища мыши, а ниже правого уха (сайт катетера выхода). Администрирование ветеринарный вазелин глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Убедитесь, что животное не разбудить во время хирургических препаратов, позволяя мыши достаточно времени в ингаляционной камере до подготовительной (по крайней мере, две минуты), или путем введения изофлурана к мыши с помощью носового конуса во время преп. Вернуться мышь для анестезии камеры.
- Когда мышь достаточно инертен, перейти на стерильный хирургический участок, разместить анестезии носовой конус над носом и ртом мыши, и отвлечь поток изофлураном к носовой обтекатель. Подтвердите правильное обезболивание, зажимая лапу щипцами; когда мышь не показывает никакой реакции, переходите к следующему шагу.
- Поместите мышь на спине, с головой, обращенной кСледователь. Закрепите ушах, передних лап и задних-лапы к хирургическому доске с помощью клейкой ленты или другого запретительного устройство держать мышь устойчивым. Очистите разрез зона с повидон-йода и 70% этанола.
- Выделение сонной артерии
- Сделать 1 см продольный разрез немного правее от средней линии шеи. Используйте пинцет, чтобы отделить жир и мышцы, чтобы выставить трахеи (рис 4А). Найдите сонной артерии, идущие параллельно трахеи (рис 4В).
- Осторожно используйте щипцы для отдельной фасции перекрывающих артерию (рис 4C). Слегка потянуть блуждающий нерв в стороне от сонной артерии, и вставить щипцов в пространство между. Аккуратно откройте щипцы для создания разрыва в фасции, и осторожно вытяните в сторону нерв от артерии, от развилки в артерии вблизи гортани (переднего конца), до (задняя), насколько это возможно (по крайней мере, 3 мм) ( Рисунок 4D).
- Очистите от любой реостающие фасции, пока артерии не хорошо изолирован (рис 4Е). Добавить каплю физиологического раствора к области хирургии иногда, чтобы держать ткань влажной, и, таким образом, менее хрупкими и менее склонна к разрыву случайным образом.
- Размещение шовный и подготовка артерии для катетеризации (рисунки 4, 5).
- Используйте пинцет, чтобы нарисовать шелковой нитью нить под артерии. Свяжите безопасный узел, чтобы закрыть артерию как далеко в сторону передней, насколько возможно (рис 4F).
- Нарисуйте второй нить под артерии. Свяжите выдвижной узел временно перекрыть артерию, как далеко в сторону задней насколько возможно (рис 4F).
- Проведите третью нить под артерии. Свяжите очень свободную узел между первыми двумя швами, которые будут использоваться, чтобы быстро обеспечить катетер после размещения (рис 4G).
- Держите концы всех швов из пути путем смачивания их с небольшим количеством 70% -ного этанола.
- С шва, захватите нижнюю узел тянуть артерии слегка натянута. Ник выше артерии, но очень близко к, переднего шва (рис 4H). Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком далеко, но проверить щель, чтобы убедиться, что открытие беспрепятственно.
- Удалить гепарин заполненные катетер с иглой шприца, пытаясь избежать создания больших карманы воздуха с обоих концов. Манипулирование катетер позиционировать скос под удобным углом, как правило, вниз, и слегка вправо (для правшей).
- В то время как, держась за швом держать артерию оставаясь немного тугой, аккуратно вставьте катетер в щели (рис 4I). Используйте пинцет, чтобы удерживать передний шов и вытащить артерии вниз над катетер (толкая вверх чрезмерно с катетером может привести к скошенный конец, чтобы проколоть артерии). Осторожно отпустите катетера и передний шов.
- Закрепите катетер, затянув узел среднего шва, недалеко от входа катетера в артерию. Сделайте плотный тройной узел, но будьте уверены, не тянуть так туго, как препятствовать поток через катетер. Далее закрепите катетер, привязав его с переднего шва, ниже входа в артерии.
- Закрепить солевой привести к катетеру с помощью штекера соединител, снова пытаясь избежать введения пузырьков воздуха в линии.
- Возьмитесь за концы задней швом и осторожно потяните, чтобы освободить себя узами брака. Маневр шов вниз артерии, на конец катетера (не удалите нить). Кровь должна течь в катетер; если нет потока крови, осторожно покачивание катетер, чтобы попытаться удалить сужение.
- Когда поток появляется свободный, использовать последнюю нить (из задней шва), чтобы связать дополнительный узел, чуть выше среднего шва.
- С пинцетом в каждой руке, используйте одну пару щипцов, чтобы держаться за катетера чуть ниже передней шва, и с другой, нажмите излом в катетера, так что будет легко согнуть в сторону. Повторите для создания второго излом. Это позволяет свободный конец катетера, чтобы вытянуть в направлении задней части головы мыши, не вынуждая кончик катетера, чтобы включить в боковом направлении к стенке артерии.
- Переверните мышь на его (левой) стороне, держа носовой конус, расположенный на рот и нос, и очистить разрез область с 70% этанола и повидон-йода. Сделайте небольшой надрез (примерно 4 мм) ниже и позади правого уха. Используйте пинцет, чтобы удерживать открытую лоскут кожи, во время работы тупой полый зонд под кожу, чтобы создать канал через щеку, в полость на шее. Желательно, чтобы принести зонд вокруг слюнной железы, вместо того, чтобы идти между железой и кожи. Используйте пинцет, чтобы аккуратно освободить пространство для зонд для выхода.
- Автор порта пробку / катетер через зонд, чтобы выйти в шею. Не тяните слишком сильно; убедитесь, что катетер не дробления или сжимая кровеносные сосуды или органы.
- Администрирование местное болеутоляющее к груди разрез, и тесное рану шелковой или скрепками.
- Удалить мышь от анестезии, и позволить животным, чтобы восстановить в чистом, нагревали пространство (место клетку сверху грелкуили под инфракрасной лампой), по крайней мере, 30 мин.
3. Настой
- Подготовьте аликвоты 5 мг / мл раствора паклитаксела / метанол.
- Измерить 50 мг паклитаксела в 15 мл центрифужную пробирку. Добавьте 10 мл стерильной метанола. Кап трубки. Поворот вручную или на вращающемся шейкере при комнатной температуре, пока порошок не растворится.
- Алиготе 500 мкл раствора в 20 маленький, морозильных безопасных трубок, и хранить при температуре -20 ° С.
- Оттепели индивидуальный аликвоту при комнатной температуре или в водяной бане 37 °, непосредственно перед инфузией.
- Подготовьте инфузионный насос (рисунок 6).
- Вырезать длинную длину полиэтиленовой трубкой приблизительно 40 см. Приложите притупляются иглу в одном конце, и разъем порта в другой.
- Составление препарата в шприц с известным внутренним диаметром-(большинство программируемых насосы потребует диаметр цилиндра шприца, чтобы вычислить скорость гое насос рука). Установите иглу в шприце и загрузки лекарственного средства через иглу и трубки.
- Расположите шприц в насос в соответствии с указаниями производителя. Премьер-насос так, что препарат течет плавно из разъема вилки, и она готова для инфузий.
- Прикрепите мышь, чтобы накачать.
- Держите мышь устойчивый и использовать кровоостанавливающего зажать катетер, недалеко от порта вилкой. Снимите пробку и заменить разъем прилагается к шприцу и трубки.
Примечание: Кровь может начать течь обратно через трубы. - Быстро вводить быстрый насос, чтобы очистить объем катетера (рассчитаны эмпирически, путем наблюдения за объем 6 см) трубки, а затем сразу же перейти к нужной скорости инфузии.
- Держите мышь устойчивый и использовать кровоостанавливающего зажать катетер, недалеко от порта вилкой. Снимите пробку и заменить разъем прилагается к шприцу и трубки.
- Продолжить вливания паклитаксела для трех часового курса.
- Монитор трубки иногда, чтобы проверить на герметичность в местах соединений, как это часто является признаком закупорки в потоке на мышь.Смотреть мышь для ожидаемых или неожиданных реакций на вливания (вялость или гиперактивность, признаки дискомфорта).
- В зависимости от длины и характера инфузии, мышь не может ни есть, ни пить, но быть уверенным, чтобы обеспечить доступ к пище и воде в соответствии с установленной политикой учреждения. Будьте в курсе потенциал для обезвоживания мыши путем сбора большого количества крови.
- Продолжайте держать в клетке тепло с грелку или лампы, если мышь не появится на желание держаться подальше от жары. Если животное не усыпляют в нескольких часов после операции, осуществлять план после хирургического лечения животного, в том числе стерильные жилищных условий и лечения послеоперационной боли.
- Внимательно следить мыши, особенно в первые несколько минут, чтобы убедиться, что он не вытащить трубку через гиперактивности или раздражение от трубки (который может быть признаком плохой вставки). Если мышь не находится над-активных, постоянная MonitoКольцо может и не понадобиться, но проверить мышь обычно, чтобы убедиться, что животное не запутаться в трубке. Ремень и система троса имеются в продаже, но их использование выходит за рамки этого протокола.
- Сбор образцов.
- Соберите образцы крови через регулярные промежутки времени по подчелюстной или ретро-орбитальной кровотечений (Если ваш протокол не использует молочных моделях опухолей, считают сбора крови через яремную катетер, введенный в то же время, что и сонной катетера). Будьте осторожны, чтобы не тянуть на инфузионной линии. Если сбор по ретро-орбитальной кровотечений, слегка обезболить мышь с ингаляционного анестетика (например Метоксифлуран) так что нужно не захватить за шкирку, чтобы закрепить мышь.
- Спин кровь в hemocrit центрифуге, чтобы отделить клетки крови от плазмы. Используйте файл или алмаз-наконечник пера забить трубу на лице разделения фаз. Перерыв трубку и собирать плазму только, в маленькой, морозильной безопасный трубки. Хранить в -80 ° С до анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если hemocrit центрифуга не доступна, передать образец крови в микро-трубки центрифуги, и спина в микро-центрифуге на высокой скорости, чтобы отделить клетки крови от плазмы. Сбор плазмы во вторую пробирку, и хранить при -80 ° С. - Усыпить мышь по CO 2 удушья. Сбор ткани (около 20 - 50 мг) из органов, представляющих интерес и флэш замораживание в жидком азоте. Хранить при -80 ° С до анализа.
4. Анализ проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы для этого протокола были проанализированы с помощью внешней лаборатории с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC - MS / MS), который подсчитал концентрации паклитаксела следующим образом:
- Выписка паклитаксела из образцов. Однородный образец ткани в 0,1% -ной уксусной кислоты, 50% метанола до экстракции. Экстракта паклитаксела путем экстракции жидкость / жидкость, с использованием метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) укрепленный с внутренней аналог (доцетаксел) стандарта. Удалить МТБЭ и сухих образцов. Ресуспендируют в 50% ацетонитрила, 0,1% -ным раствором уксусной кислоты.
- Подготовка калибровочных стандартов. Добавить известную концентрацию паклитаксела на соответствующую C57BL / 6 матрицу, чтобы получить конечный диапазон стандартов (от 1 до 20000 нг / мл для образцов плазмы, от 0,1 до 5000 нг / мл для образцов ткани). Экстракт стандарты в двух экземплярах, используя тот же способ, что и для образцов исследуемых выше. Измерить паклитаксела в образцах пик с помощью ВЭЖХ / МС / МС с использованием ионизации электрораспылением.
- Рассчитать концентрацию с использованием коэффициента площади паклитаксела к внутреннему стандарту. Используйте калибровочные стандарты для создания калибровочной кривой, и интерполяции данных образцов исследование посадки на кривой. Нормализовать концентрации образцов исследование, проведенное начальным весом образца до гомогенизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распределение Паклитаксел следует предсказуемые схемы в течение 3 ч Режим дозирования от 15 минут высокой скорости инфузии, за которыми следует 165 мин на низкой скорости инфузии.
На рисунке 1 показано сравнение яремной вены-инфузионных концентрации в плазме паклитаксел и сонных артерий вливаний. Концентрации паклитаксел быстро падать в первые 15 мин после первоначального большого объема инфузии, а затем выравнивают в течение следующего 150 мин. Для сравнения, уровень паклитаксела в бедной инфузии начать относительно низким, и парить вверх и вниз по всей анализа. Это был, скорее всего, в результате закупоривания сосудов в соответствии начале в настое. Отчеты анализа показывают, мыши были практически нет внешнего реакции на вливание, подтверждающие идею низшей введения препарата. Рисунок 2 показывает относительные уровни паклитаксел в печени и ткани головного мозга, а также плазме крови, в конце 3 ч настой.
jove_content "л: держите-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 1:. Уровни паклитаксела в плазме в течение сонных и яремной вливаний Кривые представляют плазменные концентрации паклитаксела в отдельных мышей. Каждая мышь получила двухфазный настой, состоящий из начальной высокой скорости, 15 мин инфузии 0,42 мг / кг / мин, сразу же с последующим низкоскоростным, 165 мин вливание 0.021mg / кг / мин. Площадь под кривой (AUC) для сонной инфузии составляла около 59 мкг / мл ∙ мин по сравнению с AUC для яремной инфузии приблизительно 37 мкг / мл ∙ мин. Период полураспада паклитаксела рассчитывали по кривым, генерируемых на сонной инфузии был 10 мин и в течение яремной инфузии был 11 мин. Сонной настой показывает примерно эквивалентные уровни концентрации препарата по сравнению с яремной инфузии. Непрерывные низкие концентрации или концентрации, что цикл вверх и вниз, часто Represent плохой настой.
На рисунке 2:. Паклитаксел концентрации от ткани Сразу после 3 ч вливания паклитаксела и сбора последнего образца крови, мышь эвтаназии, и печень и мозг ткани образцы были собраны. Уровни концентрации паклитаксела в плазме и ткани были приобретены анализа масс-спецификации. Эти данные представляют образцы, собранные из сонной Infusion-Мауса на рисунке 1.
Рисунок 3: Хирургическое атрибутика. (А) Катетер Производство: Тяговая те собственные катетеры продолжает вниз материальные затраты, в то время как позволяет повторноискатель адаптировать размер и форму катетера в возрасте мыши и размера (B) Подготовить до хирургии:. 3 (трех) шелковые швы, примерно 8 см каждый; Стерильная пробка порт; Соленая шприц и свинец; Катетер, прикреплены к гепарина шприца.
Рисунок 4: Получение сонной артерии и катетера. (A) Вырезать через кожу, двигаться в сторону желез и использовать пинцет, чтобы грубо отдельный жира подвергать мышцы. (B) Используйте пинцет, чтобы аккуратно отдельная мышца выставить правую сторону трахеи. Сонной артерии становятся видимыми как крупнейший, толстостенных сосудов, идущей параллельно трахеи. (C) Перерыв фасции вокруг артерии. (D) Отдельные блуждающий нерв из сонной артерии. (E) Продолжайте удаление фасции до Carotid полностью изолирован вдоль полости. (F) шовный постоянный узел в передней конечности, и скольжение узел на задней конечности. (G) Третий шов резьбой под сонной артерии и очень свободно завязывают. (H) артерия порезал чуть выше переднего шва. ( Я) Вставьте катетер в самый последний в артерии. Захватите переднюю шов пинцетом вытащить артерии вниз по катетеру. (J) Secure катетер в сонную артерию со всеми тремя швами.
Рисунок 5:.. Размещение Шовный Схематическое изображение хирургического участка до и после установки катетера соответствует фотографию рис 4G, с добавлением ника в артерии, как показано на рисунке 4 часов.
Рисунок 6:. Схема настой установка Шприц заполняется препарата, и ограничен с тупой иглой. Полиэтилен линия придает шприца сонной катетера. Насос медленно сжимает шприц, чтобы доставить равномерное дозирование непосредственно в кровоток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вливание сонной артерии является важным методом в данном исследовании паклитаксела фармакокинетики. Настой сонной артерии является метод быстро распространять наркотик по всей кровеносной системе 14. 3 ч настой ближе имитировать клинической введения лекарственных средств, таких как таксанами чем болюсных инъекций. Операция может быть надежно выполняется одним человеком, раз операция является относительно коротким, и процент успеха> 75%. После того как образцы собраны, они должны быть проанализированы с помощью соответствующих методов. Мы использовали масс-спектрометрии для определения концентрации паклитаксела в образцах плазмы и тканей. Чтобы дополнительно подтвердить эту технику, мы направили образцы крови и тканей к независимому лабораторию для анализа. Эти данные были нанесены в виде отдельных кривых концентрация в плазме-паклитаксел для каждого испытания на животных (фиг.1), и распределение паклитаксела по сравнению в различных тканях (рисунок 2). В каждом случае, это имВАЖН рассмотреть наилучший метод для анализа распределения наркотиков и / или метаболизм, в зависимости от препарата и системы интересов. Другие варианты для измерения различных препаратов могут включать ВЭЖХ-УФ или иммунологических 2.
Двумя основными факторами, необходимые для успешного сонной катетеризации хорошо вылеплены катетеры и изоляция превосходит артерии. Вылепление катетеры в зависимости от размера модели мыши имеет первостепенное значение. Если диаметр катетера слишком толстая, вставка в артерию будет чрезмерно сложно, в то время как слишком тонкий катетер будет сложнее обеспечить и вероятность засорения до или во время инфузии. Угол и острота кончика катетера должен также быть в умеренном диапазоне; совет, который является слишком резким, может проколоть стенку артерии, в то время как совет, который является слишком скучно будет сложно вставить в артерию. Измерения, приведенные здесь, были получены с использованием десяти-недельных мышей C57BL / 6J, приблизительно 20 г, в качестве шаблона модели. Измерения должны быть расширенывверх или вниз эмпирически с учетом индивидуальных моделей.
Выделение сонной артерии должен быть тонким, преднамеренное процесс, чтобы избежать ненужного повреждения ткани и предотвратить крупномасштабную кровотечение. Подкожное-жира в общем случае могут быть легко разделены с низкого до среднего острых щипцов. Мышечная ткань над сонной артерии должны быть разделены среды для тонкой наконечником щипцов вдоль уклона мышечных волокон. Если более обширный разрыв необходимо, техник должен быть крайне осторожными, чтобы избежать разрыва мелких кровеносных сосудов. После того, как сонная видно, все еще будет изрядное количество фасции, которая должна быть tweezed от артерии с мелкими наконечником пинцетом. Наконец, блуждающий нерв должен быть отделен от сонной артерии без повреждения либо. Когда сонной правильно выделен, он должен быть возможно вставить под щипцы, с пустым пространством по обе стороны от артерии (рис 4Е).
Когда Трудаемых стрельба бедные настои, начнем с рассмотрения инструкциям на насосе, чтобы быть уверенным, что следователь неправильно запрограммирован насос для достижения ожидаемых дозировку. Затем тщательно рассмотреть вопрос об изменении объема, что будет вводить в подопытного животного. Разбавление препарата должна быть рассчитана таким образом, что объем лекарственной уместно: объем не должен быть слишком большим, чтобы животное могло терпеть, и в идеале не будет существенно влиять кровяное давление; еще объем должен быть достаточно большим для насоса, чтобы доставить надежно, и создаст устойчивый поток, чтобы избежать засорения на перекрестках. Если сабо стали обычным явлением, рассмотреть вопрос о переходе к меньшего калибра (большего диаметра) иглы и трубки. Кроме того, если содержание в плазме препарат не доходит до ожидаемых уровней, исследователь должен проверить мышей после смерти, чтобы определить, остается ли катетер хорошо помещается в артерию и сыпучий, и изменить форму / размер катетера по мере необходимости.
UsefulnESS этого метода может быть ограничено такими факторами, как размер и общее состояние здоровья субъекта, и предполагаемого периода времени инфузии. Операция и настой может перенапрягать уже проблемных тему. Даже в здоровом животном, катетер сонной артерии подходит только для краткосрочных вливаний, в общем случае нескольких часов до нескольких дней. Рассмотрим, какие методы обезболивания будет использоваться, если мыши обнаруживают признаки дискомфорта в ответ на введения препарата, такие как повторного применения местной анестезии в область раны, или упреждающих системных анальгетиков. Это будет необходимо иметь все животное работу утвержденный местной нормативной организации животного или IACUC, чтобы получить соответствующие разрешения для выполнения этой процедуры. Если это необходимо, чтобы иметь более длительный вливание, или иметь мыши выживают настой в течение длительного периода времени, альтернативные методы инфузионные должны быть изучены.
После того, как освоили перфузии сонной артерии в исследованиифармакокинетики паклитаксела, мы планируем использовать эту технику в будущем исследовать воздействие других препаратов, и Abcc10 модуляторы в C57BL / 6J и FVB мышей и других мышиных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность РКИК лабораторных животных фонду за поддержку в этом проекте. Мы благодарим Wolfe Laboratories, Inc. за помощь в анализе уровней паклитаксела в плазме и ткани. Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья предоставляемых этой K01CA120091 к Ehb и CA06927 к Fox Chase онкологического центра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
