A ressecção ileocólica é comumente realizada em várias doenças humanas; no entanto, pouco se sabe sobre o impacto da ressecção intestinal nas doenças cirúrgicas. Este artigo fornece instruções sobre a execução do procedimento em camundongos com alto sucesso, fornecendo um meio de estudar os efeitos da ressecção ileocólica em modelos de doença.
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Artigo de método
Murino ileocolic Bowel ressecção com anastomose primária
Neste artigo
Resumo
Resumo
As ressecções intestinais são frequentemente necessárias para o tratamento de doenças que envolvem o trato gastrointestinal, sendo a doença de Crohn e o câncer de cólon dois exemplos comuns. Apesar da frequência desses procedimentos, permanece uma lacuna significativa de conhecimento na descrição dos efeitos inerentes da ressecção intestinal na fisiologia do hospedeiro e na fisiopatologia da doença. Este artigo fornece instruções detalhadas para uma ressecção ileocólica com anastomose primária término-terminal em camundongos, bem como aspectos essenciais dos cuidados perioperatórios para maximizar o sucesso pós-operatório. Quando seguido de perto, esse procedimento produz uma taxa de sobrevida de 95% a longo prazo, sem falha no crescimento e minimiza as complicações pós-operatórias de obstrução intestinal e vazamento anastomótico. Os desafios técnicos de realizar o procedimento em camundongos são uma barreira para seu uso generalizado em pesquisas. As habilidades descritas neste artigo podem ser adquiridas sem experiência cirúrgica prévia. Uma vez dominado, o procedimento de ressecção ileocólica murina fornecerá uma ferramenta reprodutível para estudar os efeitos da ressecção intestinal em modelos de doenças humanas.
Introdução
A ressecção ileocólica (RCI) é um procedimento comum realizado em situações emergentes e eletivas para uma variedade de doenças. A doença de Crohn e o câncer de cólon são as duas indicações mais comuns para ICR. Em ambas as doenças, a recidiva no intestino no local da cirurgia representa um grande problema clínico. As taxas de recorrência local para câncer de cólon continuam sendo um problema, mesmo com as ressecções mais agressivas1. Após a RCI na doença de Crohn, a doença recidiva com mais frequência (em até 80%) no íleo neoterminal 1 ano após a cirurgia2. Dado o impacto dessas duas doenças e sua recorrência após a cirurgia, é importante entender os fatores intestinais locais após a RCI, que podem ter influências intrínsecas na história natural dessas doenças. Além disso, também é importante considerar a cicatrização da anastomose após a RCI. No pós-operatório inicial, os vazamentos anastomóticos podem ter consequências devastadoras para os pacientes, resultando em cirurgias repetidas, criações de estoma, morbidade significativa e até mortalidade3. Apesar da importância deste tópico, nossa compreensão atual da cicatrização anastomótica permanece em sua infância como objeto de pesquisa. Modelos animais de ICR, em particular camundongos, são uma excelente plataforma para estudar a cicatrização intestinal e anastomótica após a cirurgia.
Um modelo de camundongo de ICR foi inicialmente desenvolvido por Helmrath et al. para ser usado como modelo de síndrome do intestino curto4. Os autores experimentaram vários regimes de dieta e tamanhos de sutura para otimizar a sobrevivência dos animais após a RCI. Concluíram que a alimentação com dieta líquida no período perioperatório e o uso de suturas monofilamentares 9-0 resultaram em uma sobrevida pós-operatória ótima de 88%. Desde esta publicação inicial, a RCI em camundongos removendo 50% do intestino delgado tem sido usada em vários estudos para explorar a dinâmica da ressecção maciça do intestino delgado e a resposta adaptativa do crescimento na tentativa de desenvolver novas terapias para a síndrome do intestino curto5,6.
A primeira aplicação do modelo de camundongo ICR à doença de Crohn usou o modelo de camundongo IL-10-/-, que desenvolve colite 7 espontaneamente. Os autores verificaram que, após a RCI, esses animais desenvolveram inflamação no íleo neoterminal semelhante à observada em pacientes com doença de Crohn no pós-operatório, e que essa inflamação era dependente da presença de bactérias7. Mais recentemente, esse modelo foi usado para explorar as alterações bacterianas induzidas pela RCI. Na doença de Crohn, há uma disbiose associada com diminuição relativa de bactérias conhecidas por terem propriedades anti-inflamatórias e aumento de espécies invasoras de bactérias8,9. A associação é verdadeira nos casos de recidiva pós-operatória10. Dois estudos buscaram identificar alterações microbianas decorrentes da RCI. O primeiro usou camundongos IL-10 nulos e realizou eletroforese em gel desnaturante para comparar a semelhança bacteriana entre o intestino delgado e o cólon após o ICR11. Este estudo demonstrou que as populações bacterianas tornaram-se semelhantes no intestino delgado e no cólon após a ICR. Um estudo subsequente usou camundongos selvagens e pirosequenciamento 16s para classificação filogenética de espécies bacterianas no pós-operatório. Este estudo demonstrou uma mudança acentuada nas espécies bacterianas resultante da cirurgia isolada, com as espécies de Clostridium se tornando dominantes, bem como um aumento nas Υ-proteobactérias. Os resultados também confirmaram os achados do estudo anterior com populações semelhantes encontradas no intestino delgado e cólon após a RCI12.
ICR é um procedimento comum para pacientes com câncer de cólon envolvendo o ceco e o cólon ascendente, e está se tornando cada vez mais reconhecido que a resposta do hospedeiro à cirurgia provavelmente contribui para a recorrência do tumor local e à distância13. Apesar dessa observação, os modelos de RCI não têm sido utilizados para o estudo do câncer colorretal e da recidiva pós-operatória. Compreender as alterações imunológicas sistêmicas e locais resultantes da RCI será importante na investigação de terapias futuras. As vias potenciais envolvidas na recorrência do câncer pós-RCI incluem a regulação dos fatores de crescimento, que podem resgatar as células da apoptose e estimular a proliferação, a ruptura mecânica do tumor com a liberação de células e a perda de vigilância imunológica por meio da imunossupressão pós-operatória13,14.
Modelos de camundongos de ICR têm o potencial de ser uma ferramenta poderosa para a investigação da síndrome do intestino curto, doença de Crohn e câncer de cólon. Eles também podem fornecer lições sobre como prevenir complicações anastomóticas pós-operatórias precoces, definindo ainda mais as vias celulares e bioquímicas envolvidas na cicatrização da anastomose recém-construída. Uma grande barreira na utilização do modelo ICR murino é a dificuldade técnica. A anastomose intestinal requer o uso de 8-0 ou sutura 9-0, microscópio cirúrgico e treinamento em técnicas microcirúrgicas. O objetivo deste artigo é fornecer instruções claras sobre como realizar ICR em camundongos com o objetivo de utilizar esse procedimento em modelos de doença.
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Protocolo
Protocolos de uso de animais foram aprovados pelo Animal Care and Use comissão de Ciência da Saúde da Universidade de Alberta.
1. Preparação de Instrumentos, Animais e Setup operativo
- Transferir os animais para uma nova, ausente gaiola limpa de todos os materiais sólidos de comida 24 horas antes do procedimento. Eles podem ter livre acesso à água e dieta líquida ad lib até o momento do procedimento.
- Autoclave todos os instrumentos necessários para o procedimento. Superfície operacional limpo e cone do nariz anestésico com etanol 70%.
- Defina-se a superfície de operação com microscópio cirúrgico, anestésico e material de máquina de uma maneira que é confortável para o cirurgião. Os cotovelos do cirurgião deve ser autorizado a descansar confortavelmente na mesa de operação, com as mãos e os braços desobstruídas por equipamento. Instruments, suturas, cotonetes, e uma seringa de 10 ml deve ser colocado num local que permite fácil acesso durante o procedimento.
- Estabelecerlâmpadas de calor gerais para proporcionar tanto calor para o animal durante o procedimento e luz para a superfície operacional.
- Encher um tubo de 50 ml com 0,9% de soro fisiológico, e um tubo de 1,5 ml com geleia de petróleo e lugar perto da superfície do operacional.
NOTA: Esterilizar todos os instrumentos e materiais cirúrgicos. Uma vez que o intestino é seccionado, o próprio procedimento não é estéril. É considerada limpa-contaminada. Tomar medidas para evitar a introdução de fontes exógenas de infecção.
2. ileocolic ressecção com anastomose
- Induzir a anestesia pela administração de 4% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L / min através de nariz cone do vaporizador de isoflurano até o animais freqüência respiratória diminui para cerca de 30-40 ciclos / min. Aplique pressão moderada para a pata traseira do rato para garantir que não haja resposta da dor antes de iniciar o procedimento. Neste ponto, desligue o isoflurano a 2% e fluxo de oxigênio para 0,5 L / min. Intermitentementeverificar a resposta à dor durante o procedimento e ajustar a taxa de fluxo de isoflurano em conformidade.
- Aplique vaselina para os olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia, e imobilizar o mouse na posição supina, com membros garantidos usando fita adesiva transparente.
- Limpe o abdômen com solução povodine / iodo, e transformar-se em novas luvas estéreis.
- Faça uma incisão na pele 1,5 centímetros na linha média superior do abdómen, utilizando ponta afiada dissecando tesoura para expor a fáscia e peritônio. Abra a camada da membrana fibrosa / peritoneal, de uma forma similar através da linha alba para expor o conteúdo peritoneal.
- Em contraste com os seres humanos, o ceco do rato é tipicamente encontrado no quadrante superior esquerdo do abdómen. Uma vez identificados, compreender o ceco suavemente com uma pinça e entregá-lo através da incisão. Use cotonetes de algodão humedecido para fora do ventilador de aproximadamente 3 cm do íleo terminal que se projecta a partir do ceco ao longo de um gaze estéril envolto sobre a superfície abdominal (Figura 1A).Assegurar o intestino expostos é mantida húmida com 0,9% de soro fisiológico durante a totalidade do procedimento.
- Identificar a artéria ileocecal ramificando-se a artéria mesentérica superior ao longo do cólon (Figura 1A) usando o microscópio de operação. Dissecar os tecidos avasculares adjacentes à artéria ileocecal, cercar e ligar a artéria com um laço de seda 5-0. Em seguida, localize o suprimento de sangue regional para o íleo terminal e escolher um ponto transection 1,5-2 cm proximal à junção ileocecal. Ligadura dos ramos para esta seção do íleo como acima. Divida as artérias com micro dissecando tesoura.
- Divida as porções isquêmicas de íleo eo cólon garantir que haja fornecimento de sangue adequado para os fins transeccionados (Figura 1B). Muitas vezes, é útil para spatulate o íleo, dividindo-o em um ângulo de 30 graus para aumentar o diâmetro do lúmen de modo que corresponda mais estreitamente do cólon. Uma vez que a porção de ileocecal do intestino foi removido, a alinhartranseccionados extremidades do íleo e do cólon na gaze, garantindo as fronteiras de cada mesentéricos estão alinhados.
- Confecção da anastomose, através da aproximação do fim seccionado do íleo para o final seccionado de cólon usando interrompido 8-0 suturas de polipropileno (Figura 1C). O primeiro ponto é colocado na borda mesentérica, com suturas posteriores colocados a cada 0,5 milímetros até a anastomose íleo-colônica é estanque. Ao passar a agulha de sutura através do íleo eo cólon, garantir que a borda do corte não é enrolado, e picadas de agulhas são 0,5 milímetros a partir das bordas do corte do intestino. A anastomose típico vai exigir 14-16 suturas interrompidas. Teste a integridade ea desobstrução da anastomose após a conclusão rolando uma proximal para distal cotonete sobre o íleo para forçar o conteúdo através da anastomose. Conteúdo do intestino delgado deve passar livremente para o cólon sem deiscência de anastomose.
- Lavar o intestino expostos com 3-4 ml de solução salina a 0,9% a partir da seringa de 10 mlpara lavar fezes a partir da superfície do intestino, e entregar do intestino de volta para dentro da cavidade peritoneal. Usando 2 ml de solução salina a 0,9% lavar a cavidade peritoneal, e, em seguida, este fluido escorra através da aplicação de uma pressão suave para a parede abdominal lateralmente.
- Feche a incisão com uma corrida de seda 3-0, e interromper o fluxo de isoflurano. Administrar 0,1 mg / kg de ópio longa ação -buprenorphine- por via subcutânea para controle da dor pós-operatória.
- Observe os animais sob a lâmpada de calor até que eles são móveis, em seguida, transferi-los para uma gaiola continuamente aquecido.
Cuidado 3. pós-operatória e Monitoramento
- Monitorizar os animais em uma gaiola aquecida continuamente para detectar sinais de desconforto para o resto do dia. Transferir os animais de volta para a facilidade de cuidado animal em uma nova gaiola estéril com acesso a dieta líquida e água ad lib. Os animais podem ser alojados em grupos de 3-4.
- Execute uma verificação sobre os animais no pós-operatório, na manhã seguinte,garantir que os animais não aparecem em perigo. Alimente apenas dieta líquida. Se eles parecem desconfortáveis (ou seja, a postura curvada ou atividade mínima) administrar uma dose adicional de buprenorfina subcutânea. Confira os animais mais uma vez à tarde em dia de pós-operatório 1.
- Na manhã do dia pós-operatório 2 os animais deve aparecer totalmente recuperado. Provas do consumo de alimentos e stooling são sinais positivos de recuperação. Agora, retomar uma dieta de comida sólida para os animais.
NOTA: Sinais de perigo incluem postura arqueada, má higiene e atividade mínima. Se os sinais de perigo são proeminentes os animais devem ser sacrificados. - Eutanásia dos animais através da indução de anestesia profunda com 4% de isoflurano a uma taxa de fluxo de O2, de 2 L / min até que os animais não respondem à pressão do pé. Realizar deslocamento cervical, e observar se há sinais de eutanásia adequada.
- Orientações variam, por isso consulte as recomendações das instituições quanto às suas indicaçõespara os métodos adequados de eutanásia em camundongos.
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Resultados
As taxas de mortalidade e alteração de peso no pós-operatório.
As taxas de mortalidade seguintes ICR em 129S1 camundongos selvagens são geralmente ~ 5%. A causa mais comum da moralidade é obstrução intestinal na anastomose. Outras causas de mortalidade incluem fístula e hérnia interna que leva à obstrução intestinal.
A perda de peso pode ser visto até 14 dias de pós-operatório, mas é geralmente não-significativo. Ratos tendem a recuperar completamente peso pré-operatório pelo p...
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Discussão
O murino ICR é um poderoso modelo que pode ser usado para estudar os efeitos da cirurgia em doenças intestinais. Este artigo descreve um método de realizar ICR em camundongos com uma taxa de sucesso de 95% e sem problemas com déficit de crescimento que se reflete por pesos estáveis até 28 dias após o procedimento. Os desafios mais significativos para o sucesso ICR incluem evitar obstruções intestinais da anastomose e fístulas.
Elementos técnicos para a cirurgia para prevenir a obstrução vi...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer as contribuições de financiamento do Fundo Canadense de Pesquisa Cirúrgica, do Fundo de Assistência à Pesquisa dos Funcionários Cívicos de Edmonton e do Consórcio IBD de Alberta por meio de uma doação da Alberta Innovates.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dieta líquida para roedores LD101 | testdiet.com | ||
| 0,9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injeção de solução salina |
| de qualidade Microscópio Cirúrgico | Vaporizador | ||
| Harvard Apparatus | 34-0483 | ||
| Isoflurano | Abbott | 05260-05 | |
| Placa | para superfície operacional | ||
| Cotonetes | |||
| Micro Castroviejo Suporte de agulha, curvado | Instrumentos de precisão mundial | 503377 | |
| tesoura reta Castroviejo | Instrumentos | 555530S | |
| Tesoura de dissecação Instrumentos de | precisão mundial | 15922 | |
| Pinça de Curativo x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 suturas pré-cortadas de seda | Ethicon | A182H | Para ligadura de vasos |
| 8-0 Prolene em agulha BV130-5 | Ethicon | 8732H | Para anastomose |
| 3-0 Seda em agulhas FS-2 | Ethicon | 8665G | Para fechamento da parede abdominal |
| Vaselina de vaselina | |||
| Seringa de 10 ml | BD biosciences | ||
| Povidona-iodo 7,5% esfoliante cirúrgico | betadine.com | ||
| Lâmpadas de | |||
| buprenorfina 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
Referências
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Reimpressões e permissões
