Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Resumo

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos. Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Resumo

As células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs) são consideradas o padrão-ouro para aplicações de engenharia de tecidos baseadas em células-tronco. No entanto, o processo pelo qual eles devem ser colhidos pode estar associado a uma morbidade significativa da área doadora. Em contraste, as células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs) são mais facilmente abundantes e mais facilmente colhidas, tornando-as uma alternativa atraente às BM-MSCs. Como as BM-MSCs, as ASCs podem se diferenciar em células de linhagem osteogênica e podem ser usadas em aplicações de engenharia de tecidos, como semeadura em andaimes para uso em defeitos esqueléticos craniofaciais. As ASCs são obtidas a partir da fração vascular estromal (SVF) do tecido adiposo digerido, que é uma mistura heterogênea de ASCs, células endoteliais e murais vasculares, células musculares lisas, pericitos, fibroblastos e células circulantes. A análise por citometria de fluxo mostrou que o perfil do marcador de superfície para ASCs é semelhante ao das BM-MSCs. Apesar de vários relatos publicados estabelecerem marcadores para o fenótipo ASC, ainda há falta de consenso sobre os perfis que identificam células osteoprogenitoras nessa população heterogênea. Este protocolo descreve como isolar e usar uma subpopulação de ASCs com capacidade osteogênica aprimorada para reparar defeitos de calvária de tamanho crítico.

Introdução

A natureza heterogênea das populações de células-tronco ainda não é totalmente compreendida e continua sendo um grande impedimento para o desenvolvimento de aplicações terapêuticas baseadas em células-tronco clinicamente eficazes. Uma das maneiras mais comuns de caracterizar uma população heterogênea de células-tronco é empregar um método de classificação celular, como a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), para separar as células com base em seus perfis de expressão de marcadores de superfície. À medida que os métodos de classificação se tornam mais complexos, torna-se possível identificar subpopulações funcionais de células mais distintas. As tecnologias baseadas em microfluídica estão se tornando cada vez mais utilizadas na análise da expressão gênica no nível de uma única célula. A reação em cadeia da polimerase quantitativa multiplexada (qPCR) dentro de um chip microfluídico permite uma análise transcricional de célula única de alta resolução eficaz e confiável. ^1-5

Em um estudo anterior usando perfil transcricional de célula única de 48 genes, foi observada uma heterogeneidade transcricional considerável entre os ASCs. ⁶ No entanto, a distribuição dos genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exibiu uma forte associação com um aglomerado de células que possuem perfis transcricionais altamente osteogênicos. Para isolar as células de acordo com esse perfil de expressão gênica osteogênica, os padrões de expressão de antígenos de superfície foram correlacionados com os padrões de transcrição e a expressão do marcador de superfície da endoglina (CD105) foi posteriormente descoberta como intimamente correlacionada com o potencial de diferenciação osteogênica aprimorado das ASCs. Independentemente da expressão de CD105, a expressão do receptor de superfície Thy-1 (CD90), uma proteína de membrana ligada a glicosil-fosfatidilinositol previamente demonstrada por Chen et al. estar associada a células osteoprogenitoras, também foi correlacionada com a expressão gênica osteogênica. ^6,7 Esses achados oferecem a oportunidade de isolar prospectivamente subpopulações dentro do conjunto heterogêneo maior de ASCs com maior capacidade osteogênica para aplicações de engenharia de tecido ósseo baseadas em células.

Protocolo

NOTA: Todas as amostras dos pacientes foram obtidos com o consentimento informado, e os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Stanford University Institutional Review Board (Protocolo nº 2188 e # 9999).

1. Isolamento celular e Cultura:

1. Obter tecido adiposo subcutâneo humano de pacientes saudáveis ​​do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletiva do abdômen, flanco, e / ou região de coxa sob anestesia local / geral. Certifique-se de que Institutional Review Board (IRB) a aprovação foi obtida para o protocolo de isolar ASC de tecidos humanos, e siga as precauções de segurança institucionais ao trabalhar com esses materiais.
2. Para obter o SVF a partir do tecido adiposo lipoaspirated, lava-se a primeira lipoaspirado três vezes com volumes iguais de solução salina tamponada 1x com fosfato estéril (PBS). Aspirar cuidadosamente e descartar a camada aquosa inferior.
3. Preparar o tampão de digestão de colagenase: 0,075% de colagenase do Tipo I em HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampão de FACS: 2% de FBS, 1% P188 e 1% de Pen-Strep em PBS. Filtrar ambas as soluções através de um tamanho de poro de 0,22 um fluxo rápido filtro polietersulfona disponível comercialmente.
4. Para digerir o tecido adiposo lavada, adicionar um volume igual de tampão de digestão com colagenase e colocar vaso de digestão de forma segura em um banho de água com agitação durante 60 min a 37 ° C (cerca de 180 agitações / min).
   NOTA: É melhor utilizar um vaso de digestão volume maior do que o necessário, pois isso permite uma digestão durante a agitação máxima (isto é, 250 ml de tampão de digestão com colagenase, de 250 ml de tecido adiposo lavado em um frasco estéril 1L).
5. Neutraliza-se a actividade enzimática por adição de um volume igual de tampão de FACS e permitindo a sentar-se à TA durante 5 min. Em seguida, centrifugar a 233 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o SVF pellet de alta densidade.
7. Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de RT vermelhocélulas de tampão de lise, com base no tamanho da pelota. Deixar a solução sentar à temperatura ambiente durante 5 min e centrifugar a 233 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento, adicionando 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho da pelota (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS a 10% / 1% de solução de penicilina-estreptomicina [pen-strep]).
9. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm de nylon para remover os detritos celulares.
10. Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
11. Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho do sedimento.
12. Coloque 2 x 10 ⁶ células em uma placa de cultura de 15 centímetros padrão e estabelecer culturas primárias O / N a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO _2. Mantém-se a níveis sub-confluente para impedir a diferenciação espontânea a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO ₂ em meio de crescimento.
    A densidade celular em um plenamente: NOTAconfluente 15 centímetros da placa é de aproximadamente 4-6 x 10 ⁶ células.

2. Coloração

1. ASC Cultura em meio de crescimento tradicional, a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO _2, por 36 horas antes da coloração / classificação.
2. ASC carona de placas de cultura utilizando Accutase (de acordo com o protocolo do fabricante).
3. Lave as células uma vez com tampão de FACS (PBS com 2% de FBS e 1% de pen-strep).
4. Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender as células em 0,5-1 mL de tampão de FACS (dependendo do número de células e a quantidade de anticorpo desejado).
   NOTA: O volume da suspensão de células, de acordo com as recomendações do fabricante do anticorpo FACS, determina a concentração de anticorpos. No entanto, a titulação da concentração de anticorpo, utilizando uma concentração de partida de 1: 100, é normalmente aconselhada se é a primeira vez que a utilização de um anticorpo.
6. Contar o número total decélulas utilizando um hemocitómetro.
7. Reserva alíquotas de 100 ul em tubos de 1,5 ml de centrífuga a ser utilizado para uma amostra não corado e controlos de cor única (de acordo com o número de anticorpos fluorescentes utilizados).
8. Adicionar os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência adequados (em concentrações pré-determinadas, segundo as instruções do fabricante) e incubar durante 20-30 minutos em gelo, protegida da luz.
   1. Para etiquetar subpopulação osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humano (endoglina)) em tampão de SCAF até uma concentração de 1:50.
   2. Para identificar as outras populações de células (por exemplo, hematopoiética e células endoteliais): Diluir anti-CD45 (anti-CD45 humano do Pacífico azul), anti-CD34 (anti-CD34 humano APC), e / ou anti-CD31 (anti-humano CD31 PE ) em tampão de FACS para uma concentração de 1:50.
   3. Se não utilizando anticorpos directamente conjugados, utilizar um anticorpo primário biotinilado com um segundo conjugado de estreptavidina-apropriadaanticorpo ária, tal como estreptavidina PE-Cy7, a uma diluição de 1: 100.
9. Após a incubação, lavar as células duas vezes: encher os tubos com tampão de SCAF e centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, o sobrenadante por aspiração.
10. Ressuspender as células em 400-500 amostras ul FACS tampão e filtro através de um 70 um filtro de células nylon para remover aglomerados de células.
11. Transferir células marcadas em tubos de FACS com topo do filtro e manter as amostras em gelo durante a duração da análise.

3. activadas por fluorescência celular

NOTA: Os passos seguintes mandato conhecimento prévio em células activadas por fluorescência (FACS) ou a assistência de um técnico especializado.

1. Usando o software FACS adequadas, parcelas de análise de projeto para examinar dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Blue Pacific, Fluorescein Isothiocyanate (ITCF), aloficocianina (APC) e qualquer outro uso fluorophored para marcar as células.
2. Antes de carregar no separador de células, brevemente vórtice cada amostra para voltar a suspender as células.
3. Começar com a análise da amostra não corado, de modo a definir portas para a população total de células, para excluir os detritos celulares, e para determinar a linha de base da autofluorescência.
4. Adiciona-se iodeto de propídio (PI) para a amostra não corado e analisá-lo, a fim de visualizar a população de células vivas na população total de células. Construir um portão em torno desta população.
5. Analisar uma amostra de controlo de cor única para cada fluorocromo, a fim de definir a compensação de fluorescência.
6. Analisar a amostra corada para definir a posição de portas para a classificação.
7. Adicionar PI para a amostra corada de forma a corar as células mortas.
8. Organize as populações de células marcadas. Separar por quer tubos de 1,5 ml de centrífuga ou tubos cónicos (15 ml) contendo meio de cultura.
9. Cessar a triagem manual, uma vez a quantidade necessária de células foi obtido.
10. Nósing FACS, executar uma verificação de pureza por análise de uma pequena fracção (por exemplo., células 500) da população de células obtidas.
    NOTA: Este passo confirma a pureza das populações de células classificadas. Idealmente, a pureza deverá ser superior a 90-95%.
11. Centrifugar células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C imediatamente após a conclusão de triagem e ressuspender em 1 ml de meio fresco contendo 10% de FBS.
    NOTA: A quantidade de material utilizado pode ser aumentado com base no tamanho do sedimento celular.
12. Placa em placas revestidas com gelatina para melhorar a viabilidade celular. Dependendo do rendimento celular final, a placa de 300.000 células por cavidade em uma placa de 6 poços, 100000 células por poço numa placa de 12 poços.

Resultados

Usando CD90 como um marcador para células com melhores resultados de osteogénese no isolamento de uma população altamente enriquecidas de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC foram coradas com azul-Pacífico CD45 conjugado anti-humano, conjugado com FITC anti-CD105 humano, e CD90 anti-humano conjugado com APC. Após a separação, o nível de pureza foi superior a 98%, tal como quantificado por análise post-tipo.

Definição de grupos de células com base em perfis de transcrição permit...

Discussão

Actualmente, o isolamento de subpopulações homogéneas de ASC de SVF de tecido adiposo humano continua a ser um desafio embora objectivo desejável. Isolamento de subpopulações ASC pró-osteogénicas é particularmente desejável, uma vez que tais células podem ser utilizadas para estudar a formação e a homeostase do tecido esquelético. No entanto, o SVF de tecido adiposo abriga heterogeneidade significativa no que diz respeito a conter capacidade celular e potencial de diferenciação. ¹¹ A base molecular para esta ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos Cônicos Descartáveis de 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX Gibco		10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Solução Antisséptica Povidona/Iodo	Purdue;	PFC-67618015017
Solução de Sal Balanceada Hank's, 1X	Cellgro	21-023-CV
Soro Fetal Bovino, Certificado, Origem dos EUA	Gibco	16000-044
Colagenase de  Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Solução de Desprendimento de Células	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (substituição do Azul Pacífico)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Estreptavidina PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrumento	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences