Artigo de método

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

DOI:

10.3791/52298

⸱

28 de janeiro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

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Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Resumo

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Culturas neuronais específicos doenças humanas são essenciais para a geração de modelos in vitro para doenças neurológicas humanos. No entanto, a falta de acesso para culturas neuronais adultas humanas primárias coloca desafios. Desenvolvimentos recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) fornece uma abordagem alternativa para derivar culturas neurais a partir de fibroblastos da pele através de paciente iPSC específico, mas este processo é trabalhoso, exige conhecimentos especiais e grandes quantidades de recursos, e pode levar vários meses. Isso impede que a ampla aplicação desta tecnologia para o estudo de doenças neurológicas. Para superar algumas destas questões, temos desenvolvido um método para obter células-tronco neurais diretamente do sangue periférico humano adulto, ignorando o processo de derivação da IPSC. As células progenitoras hematopoiéticas enriquecidos a partir do sangue periférico humano adulto foram cultivadas in vitro e transfectadas com vectores de vírus Sendai contendo factores de transcrição Sox2, Out3/4, KLF4, e c-Myc. Os resultados de transfecção em alterações morfológicas nas células, que são ainda seleccionadas usando meio progenitora neuronal humana contendo factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). As células resultantes são caracterizadas pela expressão de marcadores de células estaminais neuronais, tal como a nestina e SOX2. Essas células-tronco neurais pode ser ainda mais diferenciado para os neurônios, astroglia e oligodendrócitos em media diferenciação especificado. Utilizando amostras de sangue periférico humano facilmente acessíveis, este método pode ser utilizado para derivar células estaminais neurais para uma maior diferenciação para células neuronais in vitro de modelagem de desordens neurológicas e pode avançar estudos relacionados com a patogénese e tratamento dessas doenças.

Introdução

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In vitro, as culturas neuronais têm sido utilizados como uma ferramenta fundamental para o estudo de doenças neurológicas. Animais primária (principalmente roedor) culturas neurais 1, 2 e linhas celulares neurais humanas derivadas de tumores ou outros gliomas são os mais vulgarmente utilizados em tais estudos. No entanto, tem sido reconhecido que existem diferenças significativas entre os roedores e células humanas. Muitos resultados baseados em roedores não pode ser traduzido para os seres humanos. Além disso, com a rápida evolução da análise de informação de massa genômica ea edição gene relativamente fácil e seqüenciamento do genoma inteiro, a tendência é cada vez mais orientada para a descoberta de genes de doenças propensas e delinear suas funções e papéis em doenças específicas, o que torna os poucos neuronal humana linhas celulares só têm limitado o uso. Teoricamente, as culturas neuronais primárias humanas derivadas a partir de amostras do sistema nervoso do paciente são a melhor escolha, mas eles são impossíveis de se obter; meth, portanto, alternativaods são necessárias. Nos últimos anos, algumas abordagens têm sido perseguidos, com dois sendo o mais distinguíveis. Seguindo o desenvolvimento da técnica de geração de células pluripotentes estaminais induzidas (IPSC) usando o rato e células somáticas humanas 3, 4, células neurais pode ser diferenciado a partir deles 5-7. No entanto, a geração e caracterização iPSC exige mão de obra intensiva, técnicas e tempo de entrada, às vezes até exageradamente. Pouco depois, foi desenvolvido outro método para transformar directamente as células neuronais a partir de células somáticas 8, 9. Como os neurónios resultantes são não-proliferativa, que limita a sua aplicação em estudos intensivos e rastreio de drogas, que requer uma grande quantidade de células. Para tirar vantagens de ambas as técnicas, derivação direta do tronco neurais / células progenitoras de células somáticas foi explorado por vários grupos de 10-12, que ignora o tedioso processo de geração iPSC e caracterização, mas ainda provides um número razoável de células-tronco neurais para diferenciação neural mais tarde. Mostrámos previamente que, após a introdução dos factores de transcrição Yamanaka em células progenitoras hematopoiéticas, células estaminais neurais podem ser gerados directamente utilizando uma célula progenitora neuronal seleccionando meio 13. Aqui, nós relatamos o método em detalhes.

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Protocolo

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1. O enriquecimento de células progenitoras hematopoiéticas a partir de Sangue Total Adulto

NOTA: progenitoras hematopoéticas ou células CD34 + podem ser purificados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o sangue do cordão umbilical, material de leucoferese e sangue total usando métodos baseados em gradiente de densidade de centrifugação. O método está aqui usa sangue total como um exemplo.

  1. Isolamento de PBMC a partir de Sangue Total:
    1. Adicionar 4,5 ml de meio de separação de linfócitos para o tubo SepMate pipetando-o através do orifício central do inserto.
    2. Dilui-se a amostra de sangue com um volume igual de DPBS estéril contendo 2% de soro humano (v / v). Por exemplo, dilui-se 5 ml da amostra com 5 ml de DPBS + 2% de soro humano.
    3. Adicionar a amostra diluída pipetando-o para o lado do tubo. Tome cuidado para não derramar a amostra diretamente através do orifício central.
    4. Centrifugar a 1.200 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    5. Remova cuidadosamente o sobrenadante acima da camada de PMBC.
    6. Recolher a camada de PBMC (turva) para um novo tubo.
    7. Adicionar 15 ml de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS) contendo 2% de soro humano no tubo e centrifugar a 150 xg durante 10 min à temperatura ambiente com o freio.
    8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 ml de DPBS contendo 2% de soro humano. Contar o número de células.
    9. Centrifugar a 690 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover todo o sobrenadante do tubo.
    10. Ressuspender as células em 1 x 10 7 células por 15 ml de Dulbecco modificado por Iscove, meio (IMDM) contendo 1% antibióticos (v / v) e 10% de soro humano (v / v).
    11. Incubar as células S / N a 37 ° C em 5% de CO2, antes do isolamento de células CD34 +.
  2. Selecção positiva de células CD34 + a partir de PBMC utilizando CD34 Multisort Kit:
    NOTA: Trabalhe rápido e usar soluções pré-arrefecido a tornar as células frio e evitar tamparde anticorpos na superfície da célula e rotulagem de células não-específica por o de instruções do kit.
    1. Recolhe todos os PMBC em um tubo de 50 ml e contar o número de células totais no meio.
    2. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 10 min. Remova todo o sobrenadante completamente.
    3. Ressuspender 8 até 10 células por 300 uL de tampão de talão (DPBS contendo 0,5% de soro humano (v / v) e EDTA 2 mM).
    4. Adicionar 100 ul de reagente de bloqueio FcR e adicionar 100 ul de MultiSortMicroBeads CD34.
    5. Misturar bem e incubar durante 30 min no frigorífico (2 - 8 ° C).
    6. Lavar as células por adição de 2 ml de tampão de talão 10 por 8 células e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante completamente.
    7. Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão.
    8. Coloque coluna MACS LS no campo magnético de um separador MACS e preparar a coluna por lavagem com 3 ml de tampão de grânulo.
    9. Aplicar a suspensão de células para center da coluna. Células não marcadas fluirá através do qual podem ser recolhidos, se preferir.
    10. Lavar a coluna três vezes com 3 ml de tampão de grânulo.
    11. Remova a coluna do separador e colocá-lo em um tubo de 15 ml.
    12. Adicionar 5 ml de tampão de talão para a coluna e lave imediatamente as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
    13. Adicionar 20 ul de Reagente de lançamento Multisort por 1 ml de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 10 min no frigorífico (2 - 8 ° C).
    14. Adicionar 1 - 2 ml de tampão de talão por 10 7 células e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante completamente.
    15. Ressuspender as células em 50 ul de tampão de talão por 10 7 células.
    16. Adicionar 30 ul de reagente de parada Multisort por 10 7 células e incubar durante 15 min no microondas.
    17. Adicionar 5 ml de tampão de grânulo e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante.

2. Determinação dos Induced Neurais células-tronco de células CD34 +

  1. As células CD34 + cultura:
    NOTA: medium recentemente preparado deve ser utilizado no prazo de 7 dias, quando armazenados na geladeira. Perda significativa de células CD34 pode ser observada após 24 h, mas a proliferação significativa de células deve ser perceptível, especialmente após o dia 5. Se o número de células diminui continuamente ou não existe proliferação, implica qualquer má qualidade de células médias ou CD34 e as células não deve ser utilizado no passo seguinte.
    1. Ressuspender as células e cultura de CD34 + em células CD34 mantendo médio (meio StemSpan SFEM contendo trombopoietina humana (TPO, 100 ng / ml), semelhante a fms tirosina quinase 3 (Flt-3) ligando (100 ng / mL) e factor de células estaminais (SCF, 100 ng / ml), interleucina-6 (IL-6, 20 ng / ml) e interleucina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) em uma placa de 24 poços (de até 3 x 10 5 / po em 1 ml de meio por poço), a 37 ° C em 5% de CO2.
    2. After 24 horas, recolher as células flutuantes e centrifugar as células a 110 xg à temperatura ambiente para se livrar de todas as células unidas e os resíduos celulares. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio fresco mantendo CD34 e sementes de uma nova placa de 24 poços (1 x 10 5 / po) a 37 ° C em 5% de CO2 durante 5 dias adicionais.
    3. Substituir metade do meio todos os outros dias por aspiração cuidadosamente a metade superior de sobrenadante enquanto as células CD34 + são flutuante sobre o fundo das cavidades (Figura 1A).
  2. Transfecção Sendai virus:
    1. No dia 5, as células CD34 recolher e centrifugar as células a 170 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante.
    2. Ressuspender as células em meio fresco a 1 x 10 5 / poço numa placa de 24 poços em 1 ml de meio.
    3. Descongelar um kit de reprogramação cytotune-iPS Sendai por primeira imersão das partes inferiores dos tubos num banho de água a 37 ° C durante 10 segundos e, em seguida, descongelar completamente umt RT. Resumidamente centrifugar os tubos e colocá-los no gelo. Prepare a mistura de vírus Sendai, misturando o volume recomendado de cada vírus listados no Certificado de Análise (COA) para o lote correspondente. MOI 15 é recomendado.
    4. Adicionar mistura de vírus Sendai a cada poço de células CD34. Misture os poços agitando suavemente. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    5. Observe a eficiência de transfecção após 24 horas. Note-se que a formação de agregados de células e esferas são indicadores para a transfecção bem sucedida (Figura 1B).
    6. Mudar metade do meio por transferência cuidadosamente a metade superior do meio de outro poço. Se existem esferas de células da nova cavidade, adicionar a mesma quantidade de meio fresco.
    7. Alterar meio cada outro dia repetindo o passo 2.2.6.
  3. Indução de células-tronco neurais:
    NOTA: Dependendo das condições de celulares, cerca de 5 ou 7 dias após a transfecção, as células aderentes monocamada chegará a 30 -50% de confluência (Figura 1C).
    1. Remove-se os sobrenadantes contendo células flutuantes e esferas e, em seguida, adicionar 1 ml de meio de células progenitoras neurais (Dulbecco Modified Eagle Médium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12), contendo suplemento 1x N2, 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino ( BSA), 1% (v / v) antibióticos, 20 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF)) para as células aderentes.
    2. Opcionalmente, dissociar as esferas de células por pipetagem suave e centrifugar as células a 170 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de células progenitoras neurais numa nova placa de 24 poços revestida com matrigel por instrução como back-up.
    3. Mudar a forma todos os outros dias, até as células chegar a 60 - 80% confluentes, geralmente após 1 semana.
    4. Desprezar o sobrenadante e adicionar em 1 ml de meio-tronco neurais de células (meio sem soro, NSC SFM). Dissociar as células usando um raspador de células seguidopor pipetagem muito gentil.
    5. Remover as células e semear todos eles para um poço de uma placa de 6 poços. Adicionar mais 1 ml de meio de células estaminais neurais para fazer 2 ml de meio para cada poço. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    6. Alterar meio cada outro dia.
    7. Quando as células atingiram 60% de confluência, dissociar e replate as células na proporção de 1: 3 seguindo os passos em 2.3.4 e 2.3.6.
  4. Congelamento de células-tronco neurais:
    1. Prepare célula estaminal neural meio de congelação pela adição de 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) para o meio de células estaminais neurais. Mantenha o meio de congelamento no gelo.
    2. Dissociar as células em uma placa de 6 poços, usando o raspador de células, seguido por pipetagem suave. Contar as células. Centrifuga-se as células a 170 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante.
    3. Ressuspender as células em meio de células estaminais neurais a 1 x 10 6 / ml. Adicionar o mesmo volume de meio de congelação de células.
    4. Adicionar 1 ml (5 x 15 0 número total de células) de células num frasco de congelação. Congelar as células utilizando um recipiente de congelamento Sr. Froster seguindo as instruções.

3. Neural Diferenciação Celular

  1. Células neuronais diferenciação:
    1. Quando as células-tronco neurais chegar a 80% de confluência, retire as células-tronco neurais usando um policial de borracha e depois dissociar pipetando suavemente.
    2. Contar as células e ajustar a concentração de 1 x 10 5 / ml em meio de células estaminais neurais.
    3. Para a diferenciação neuronal, as células na placa com poli-D-lisina / laminina lamelas revestidas em placas de 24 poços a 1 x 10 5 / poço. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    4. Substituir o meio com meio de diferenciação neuronal (DMEM / F12 contendo 1x suplemento N2, 1x suplemento de B27, 300 ng / ml de cAMP, 0,2 mM de vitamina C, 10 ng ml cérebro / factor neurotrófico derivado (BDNF) e 10 ng / ml de derivado de células gliais factor neurotrófico (GDNF)) after 24 h. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    5. Mudar meio de diferenciação neuronal, duas vezes por semana durante 2 semanas.
  2. Diferenciação astrogliais:
    1. Dissociar as células-tronco neurais por pipetagem.
    2. Contar as células e ajustar a concentração de células a 5 x 10 4 células / ml. Semente as células em placas de 24 poços. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    3. Substituir o meio com DMEM / F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e incuba-se as células a 37 ° C em 5% de CO 2 incubadora.
    4. Mudar meio duas vezes por semana durante 2 semanas. Se as células atingem confluência antes de 2 semanas, replate as células seguintes passos 3.2.1 e 3.2.2.
  3. Oligodendrocyte diferenciação:
    1. Dissociar as células-tronco neurais por pipetagem.
    2. Contar as células e sementes de 1 x 10 5 células em revestidas placas de 24 poços poli-L-Ornitina em 1 ml de oligodendrócitos diferenciaramção que consiste de meio DMEM / F12 contendo suplemento N2, 10 ng / ml de factor de crescimento derivado das plaquetas-AA (FCDP-AA), 2 ng / ml de neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), e 3 nM de tri-iodotironina (T3). Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO2.
    3. Mudar meio duas vezes por semana durante 2 semanas.
    4. Substituir o meio com DMEM / F12 com suplemento 1xN2 e 3 nM de T3 e da cultura das células durante uma semana adicional para a produção de proteína básica de mielina (MBP).

4. Imunofluorescência Coloração

  1. Substituir mídia com paraformaldeído 4% (PFA). Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  2. Descartar PFA e lavar com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 (PBS-T), 3 vezes, 5 min cada vez.
  3. Permeabilizar as células com PBS contendo 0,5% de Triton X-100 durante 10 min à TA.
  4. Bloquear as células com PBS-T contendo 4% de soro de cabra durante 20 min à TA.
  5. Incubar as células com Antibo primária correspondentemorre diluído em PBS-T contendo 0,1% de BSA durante 2 horas à temperatura ambiente ou O / N na sala fria.
  6. Lavam-se as células por três vezes com PBS-T, a 5 minutos de cada vez. Incubar as células com os correspondentes anticorpos secundários acoplados com um fluorocromo utilizando 1: 400 em PBS-T contendo 0,1% de BSA durante 1 hora num agitador no escuro.
  7. Lavam-se as células com PBS-T contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 10 min à TA.
  8. Lavam-se as células mais duas vezes com PBS-T, durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
  9. Observar as células marcadas utilizando um microscópio e tirar fotos (Figura 3).

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Resultados

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A qualidade das células CD34 é crítica para o sucesso da transdução de células estaminais neurais. As células CD34 alta qualidade proliferam durante o primeiro par de dias de cultura e aparecem como não aderentes, as células homogeneamente redondas, flutuando pouco acima do fundo de recipientes de cultura (Figura 1A). Os resultados de sucesso de infecção em agregados de células, que se expande ao longo do tempo (Figura 1B), enquanto os agregados de células não específicas podem ocorrer ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo detalhado para gerar directamente células estaminais neurais a partir de células progenitoras hematopoiéticas periféricas é fornecido.

Em comparação com células de fibroblasto, de sangue periférico humano é mais acessível. Usando o protocolo apresentado, mais do que 1 x 10 5 células progenitoras hematopoiéticas ou células positivas CD34, podem ser enriquecidos a partir de 10 ml de sangue total. Embora a contaminação com plaquetas normalmente não é prevenida, pode ser ...

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Divulgações

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O estudo é financiado por fundos internos do NIH.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de separação de linfócitosLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Soro humanoInvitrogen34005-100
AntibióticosGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS colunaMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM mediumStemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Kit de ReprogramaçãoLife TechnologiesA1378001
Raspador de célulasSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
Frascos CryoTubeThermo368632
recipiente Mr. FrostyThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
suplemento N2Life Technologies17502-0481x
albumina de soro bovinoSigmaA29340,1% (p/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFSuplemento PeprotechAF-100-15
B27Life Technologies17504-0441x
meio sem soro NSC LifeTechnologiesA10509011x
lamínulas revestidas com poli-D-lisina/lamininaBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Vitamina CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poli-L-ornitinaSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484%
PBSQualidade Biológica119-069-1011x
Soro de cabraSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Camundongo monoclonal anti-NestinMilliporeAB5922diluição 1:1.000
Anti-SOX2 anticorpoApplied StemcellASA0120Pronto para usar
Mouse anti-β Anticorpo III-tubulinaPromegaG712Adiluição 1:1.000
Anticorpo anti-GFAP de coelhoSigmaG4546Diluição 1:100
Anticorpo anti-O4R& D SystemsMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 anticorpo anti-coelho de cabraTecnologias de vidaA11012Diluição 1:400
Alexa Fluor 488 anticorpo anti-rato de cabraTecnologias de vidaA11001Diluição 1:400
Alexa Fluor 488 anticorpo anti-rato de cabra IgMTecnologias de vidaA21042Diluição 1:250
DAPISigmaD95421 μ g/ml

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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