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Artigo de método

Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

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⸱

DOI:

10.3791/52335

⸱

3 de fevereiro de 2015

 ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons bioortogonal foi aproveitada para criar uma estratégia de imagem PET pré-direcionada eficaz e modular para o câncer. Neste protocolo, as etapas desta metodologia são descritas no contexto de um sistema modelo que emprega o anticorpo direcionado ao câncer colorretal huA33 e um radioligante marcado com 64.

Resumo

Devido à sua afinidade e especificidade requintadas, os anticorpos tornaram-se vetores extremamente promissores para a entrega de radioisótopos a células cancerígenas para imagens de PET. No entanto, a necessidade de marcar anticorpos com radionuclídeos com meias-vidas físicas longas geralmente resulta em altas taxas de dose de radiação de fundo para tecidos não-alvo. Para contornar esse problema, empregamos uma estratégia de imagem PET pré-direcionada baseada na reação de cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons. A metodologia dissocia o anticorpo da radioatividade e, assim, explora as características positivas dos anticorpos, evitando suas desvantagens farmacocinéticas. O sistema é composto por quatro etapas: (1) a injeção de um conjugado mAb-trans-cicloocteno (TCO); (2) um período de tempo de localização durante o qual o anticorpo se acumula no tumor e desaparece do sangue; (3) a injeção da tetrazina radiomarcada; e (4) a ligadura por clique in vivo dos componentes seguida pela eliminação do excesso de radioligante. No exemplo apresentado no trabalho em questão, um radioligante tetrazina marcado com 64-NOTA e um anticorpo humanizado conjugado com transcicloocteno (huA33) foram usados com sucesso para delinear tumores de câncer colorretal SW1222 com alto contraste tumor-fundo. Além disso, a metodologia de pré-direcionamento produz imagens de alta qualidade com apenas uma fração da dose de radiação para tecido não-alvo criado por radioimunoconjugados marcados diretamente com 64ou 89Zr. Em última análise, a modularidade deste protocolo é um de seus maiores trunfos, pois a porção transcicloocteno pode ser anexada a qualquer anticorpo não internalizante e a tetrazina pode ser ligada a uma ampla variedade de radioisótopos.

Introdução

Ao longo dos últimos trinta anos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico e tratamento do câncer. Os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos emissores de positrões para tumores devido à sua afinidade e especificidade para requintado biomarcadores de cancro. 1,2 farmacocinética No entanto, a relativamente lenta in vivo de anticorpos exige a utilização de radioisótopos com multi-dia semi-vidas físicas. Esta combinação pode render altas doses de radiação para os órgãos não-alvo de doentes, uma importante complicação que é de especial importância clínica desde radioimunoconjugados são injetados por via intravenosa e, portanto, - ao contrário de tomografias corpo parciais - resultado em doses absorvidas em cada parte do corpo, independentemente dos tecidos interrogados.

A fim de contornar este problema, esforço significativo foi dedicado ao desenvolvimento de estratégias de imagem PET que dissociar o radioisótopo e do grupo alvo, o que reforça as propriedades vantajosas de anticorpos contornando simultaneamente suas limitações farmacocinéticos intrínsecos. Estas estratégias - mais frequentemente denominado pr�marca�o ou segmentação de várias etapas - empregam tipicamente quatro passos: (1) a administração de um anticorpo capaz de se ligar tanto a um antigénio e um radioligando; (2) a acumulação de anticorpos no tecido-alvo e a sua depuração do sangue; (3) a administração de uma pequena molécula radioactivo; e (4) da ligação in vivo do ligando radioactivo ao anticorpo, seguido pela rápida eliminação do excesso de radioligando 3-8 Em alguns casos., um agente de compensação adicional é injectado entre as etapas 2 e 3, a fim de acelerar a eliminação de qualquer anticorpo que ainda tem que se ligar o tumor e permanece no sangue. 5

Em termos gerais, twO tipos de estratégias pré-direccionamento são mais prevalentes na literatura. Embora ambos provaram ser um sucesso em modelos pré-clínicos, eles também possuem limitações fundamentais que têm impedido a sua aplicabilidade clínica. A primeira estratégia baseia-se na elevada afinidade entre os anticorpos e conjugados estreptavidina-radiomarcadores modificados com biotina; no entanto, a imunogenicidade dos anticorpos modificados com estreptavidina provou ser um problema preocupante no que diz respeito à tradução. 5,6,9,10 A segunda estratégia, em contrapartida, utiliza anticorpos biespecíficos que foram geneticamente modificadas para se ligarem tanto um cancro antigénio biomarcador e um pequeno hapteno marcado radioactivamente molécula. 3,11-14 Embora esta última via é certamente criativa, a sua ampla aplicabilidade é limitada pela complexidade, custo e falta de modularidade do sistema.

Recentemente, desenvolveu e publicou uma metodologia de imagem PET pretargeted baseado na procura de elétron inversa Diels-Alder (IEDDA) reação de cicloadição entre -cicloocteno trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Embora a própria reação tem sido conhecida há décadas, IEDDA química experimentou um renascimento nos últimos anos como uma técnica bioconjugação clique química, como ilustrado pelo o trabalho fascinante dos grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, e Peter Conti entre outros. 12-15 A IEDDA cicloadição foi aplicado numa grande variedade de configurações, incluindo imagiologia por fluorescência com péptidos, anticorpos e nanopartículas, bem como imagiologia nuclear . com ambas radiohalogens e radiometais 16-26 A ligação é de alto rendimento, limpo, rápido (k 1> 30.000 M-1 s-1), seletivo, e - criticamente -. bioorthogonal 27 E, enquanto uma série de tipos de clique química - incluindo cicloadições catalisada por Cu azida-alcino, cicloadições azida-alcino promoveu-deformação e Staudinger ligções -. bioorthogonal estão bem, é a combinação única de cinética de reação rápida e bioorthogonality que faz IEDDA química tão bem adaptado para pr�marca�o aplicações em organismos inteiros 28,29 Nesse sentido, é importante notar que o relatório recente da nossa laboratórios não foi o primeiro a aplicar IEDDA química para pr�marca�o: o primeiro relato da imagem pretargeted com IEDDA surgiu a partir do trabalho de Rossin, et al e contou com uma metodologia SPECT empregando um 111 tetrazina Em marcado 30..

Como discutimos acima, a metodologia pr�marca�o tem quatro passos bastante simples (Figura 2). No protocolo a mão, uma estratégia para a pretargeted imagens PET de cancro colo-rectal que emprega uma 64 Cu-NOTE-radioligando marcado tetrazina e um conjugado de TCO-modificada do anticorpo huA33 será descrito. No entanto, em última análise, a modularidade desta metodologia é um dos seus grEatest activos, como a porção -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo não de internalização, e o tetrazina pode ser ligado a uma vasta variedade de repórteres radioactivos.

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Protocolo

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Síntese de Tz-Bn-NOTA

  1. Num recipiente de reacção pequeno, dissolver 7 mg NH2-Bn-NOTE (1,25 x 10 ~ 2 mmol) em 600 ul de tampão de NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Verificar o pH da solução. Se necessário, ajustar o pH da solução para 8,1 utilizando pequenas alíquotas de 0,1 M de Na 2 CO 3.
  2. Adicionar a solução de NH 2-Bn-NOTE a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    NOTA: O Tz-NHS pode ser pesadas seco ou adicionado de uma solução de estoque de DMSO ou DMF seco (<50 ul).
  3. Permitir que a solução de reacção resultante a reagir durante 30 min à TAcom agitação moderada.
  4. Após 30 min, purificar o produto utilizando cromatografia em C 18 de HPLC de fase reversa, para remover não reagido NH2-Bn-NOTE. O NH 2 -Bn-NOTA pode ser monitorado em um comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-NHS e Tz-Bn-NOTA são melhor monitorados em um comprimento de onda de 525 nm.
    NOTA: Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 0: 100 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) até 100: 0 de MeCN / H2O ao longo de 25 min e uma analítica de 4,6 x 250 mm coluna C 18 é usada , os tempos de retenção de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH2-Bn-NOTE será de cerca de 15 min, 16,5 min e 10 min, respectivamente. O produto pode ser purificado a partir de outros componentes da reacção em um único ou múltiplos de execução é executado utilizando uma coluna C 18 preparativa ou semi-preparativa de HPLC. 1 H-RMN, analytical HPLC e ESI-MS são todos os métodos que podem ser utilizados para verificar a pureza do precursor de completada Tz-Bn-NOTE 11.
  5. Congelar o eluente HPLC coletados utilizando nitrogênio líquido.
  6. Enrole o tubo de coleta congelado em papel de alumínio opaco.
  7. Colocar o tubo de recolha congelado num recipiente de liofilização S / N para remover a fase móvel de HPLC.
  8. Armazenar o produto purificado (um sólido cor de rosa claro) no escuro a -80 ° C.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor Tz-Bn-NOTE concluída é estável durante pelo menos 1 ano, sob estas condições.

2. Preparação de huA33-TCO Imunoconjugado

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar um 1 mg / ml de solução de TCO-NHS em DMF seca (2,7 mM).
  2. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de (13,3 mM) de huA33 em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (0,01 M de PO 4 3- 2 mg / ml, 0,154 M de NaCl).
  3. Usando pequenas alíquotas (<5 ul) de 0,1 M de Na 2 CO 3, ajustar o pH da solução de anticorpo para 8,8-9,0. Utilize um papel de pH ou um medidor de pH com uma microeletrodos para monitorar o pH, e ter cuidado para não permitir que o pH a subir acima de pH 9,0.
  4. Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de TCO-NHS correspondentes a 8 equivalentes molares do éster activado. Por exemplo, adicionar 7,9 mL de solução a 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) para 1 ml de solução de 2 mg / mL de anticorpo huA33 (1,33 x 10 -8 moles huA33). Não ultrapasse 5% em volume em DMF a solução.
  5. Misturar suavemente a solução invertendo o tubo várias vezes microcentrífuga.
  6. Enrole o tubo de microcentrífuga em papel de alumínio opaco.
  7. Permitir que a solução a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente com agitação suave.
  8. Após 1 h à temperatura ambiente, purificar o imunoconjugado resultante utilizando um siz descartável pré-embaladoe exclusão coluna de dessalinização. Em primeiro lugar, lavar a coluna de exclusão de tamanho tal como descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Em seguida, adicione a mistura de reacção para a coluna de exclusão de tamanho, lavar a coluna com 1,5 ml de 0,9% de solução salina estéril, e em seguida recolher o produto utilizando-se 2 ml de solução salina estéril a 0,9%, como o eluente.
    NOTA: Esta etapa irá produzir o concluída huA33-TCO como uma solução de 2 ml.
  9. Medir a concentração da resultante huA33-TCO em um espectrofotómetro de UV-Vis.
  10. Se uma concentração mais elevada é desejada, concentra-se a solução huA33-TCO utilizando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
    NOTA: É importante observar que enquanto huA33 e uma variedade de outros anticorpos conhecidos (por exemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) são muito tolerantes de ser concentrada, agregação e precipitação pode ocorrer após concentração em outros casos. Pesquisadores de tentar esta procedure com um novo anticorpo deve confiar na literatura ou o seu próprio conhecimento do anticorpo em questão diz respeito à possibilidade ou não de se concentrar o anticorpo.
  11. Guardar o imunoconjugado completado huA33-TCO a 4 ° C no escuro.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O conjugado mAb TCO preenchido deve ser estável durante pelo menos 3 meses sob estas condições de armazenamento.

3. 64 Cu Radiomarcação de Tz-Bn-NOTA

NOTA: Este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos - ou realizar qualquer outro trabalho com radioatividade - pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de Tz-Bn-NOTE 0,5 mg / ml (723 uM).
  2. Numa MicroC 1,7 mlentrifuge tubo, adicionar 10 ul da solução Tz-Bn-NOTE (5 ug) a 400 uL de tampão NH4OAc 0,2 M pH 5,5.
  3. No interesse do bom radioquímica nota-keeping, medir e registrar a quantidade de radioactividade na amostra usando um calibrador de dose antes e depois das etapas que se seguiram no protocolo abaixo (3,4-3,8). Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica.
  4. Adicionar 2.000 �i (74 MBq) de 64 Cu à solução Tz-Bn-NOTA.
    NOTA: Tipicamente, [64 Cu] CuCl 2 é fornecido em um pequeno volume (<30 ul) de HCl 0,1 N, e, por conseguinte, apenas pequenas quantidades (<10 ul) desta solução de estoque são necessários para a reacção de marcação radioactiva. Se forem necessárias maiores volumes do [64 Cu] CuCl2 estoque, a reacção de marcação radioactiva é tolerante de aumentar o volume de reacção total. No entanto, o pH da solução de reacção radiomarcação devem ser cuidadosamente monitorizados para assegurarque ele não caia abaixo de pH 4.0.
  5. Permitir que a solução a incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  6. Após 10 min de incubação, purificar o produto usando cromatografia de HPLC de fase reversa C-18. Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 de MeCN / H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 95: 5 de MeCN / H2O ao longo de 15 min é usada, o tempo de retenção de 64 Cu-Tz- Bn-NOTA deve ser em torno de 9,8 min, enquanto livre, não complexada 64 Cu eluirá com a frente do solvente em cerca de 2-4 min.
  7. Usando um evaporador rotativo, remover o eluente de HPLC.
  8. Recolher o produto de 64 Cu-Tz-Bn-NOTA em 0,9% de solução salina estéril.
    NOTA: Tendo em conta a 12,7 h meia-vida física de 64 Cu, este não é um ponto de paragem no processo aceitável. Realizar a síntese de 64 Cu-Tz-Bn-NOTUm imediatamente antes da injeção do radioactivo, e siga o passo a passo 3.7 imediatamente 4.5.

4. In Vivo Pretargeted de imagem PET

NOTA: Como no Protocolo Secção 3, esta etapa do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

  1. Em um rato nu atímica feminino, implante subcutâneo 1 x 10 células de câncer colorretal 6 SW1222 e ​​permitir que estes se transformar em um 100-150 mm 3 heterólogo (9-12 dias após a inoculação) 11.
  2. Dilui-se uma alíquota da solução-huA33 TCO Protocolo de secção 2 para uma concentração de 0,5 mg / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  3. Injectar 200 ul da solução-huA33 TCO (100 ug) na veia da cauda do rato xenoenxerto de rolamento.
  4. Permitir que 24 horas para a acumulação do huA33-TCO no tumor do mouse.
  5. Dilui-se a 64 de Cu-Tz-Bn-NOTE radioligando para uma concentração de 1,5 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril.
  6. Injectar 200 ul da solução de ligando radioactivo 64 Cu-Tz-Bn-NOTE (300 uCi; 11,1; 1,6 MBq de 64 nmol de Cu-Tz-Bn-NOTA, assumindo uma actividade especifica de 6,7 MBq / nmol) na veia da cauda do camundongos portadores de xenotransplante.
  7. No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 2, 6, 12, ou 24 horas após a injecção), anestesiar o rato com uma isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio.
  8. Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal. Manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e aplicar pomada veterinária aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  9. Adquirir os dados de PET para o mouse através de um estáticodigitalizar com um mínimo de 20 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência.

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Resultados

Os três primeiros passos da experiência - a síntese de Tz-Bn-NOTA, a conjugação da TCO para huA33, e a marcação radioactiva do Tz-Bn-NOTE construir (Figuras 3 e 4) - são altamente fiáveis. No caso do processo acima descrito, o construto Tz-Bn-NOTE foi sintetizado com elevado rendimento e pureza. O anticorpo foi modificado com huA33 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, e Tz-Bn-NOTE foi marcado radioactivamente com 64 Cu, para se obter o radioligando purificada em> 99% de pureza radioquímic...

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Discussão

A principal vantagem desta estratégia de imagem PET pretargeted é que ele é capaz de delinear com tumores alvo-fundo-de contraste de imagem em apenas uma fracção da dose de radiação de fundo produzida por anticorpos marcados directamente. Por exemplo, no sistema de imagem do cancro colo-rectal descrito aqui, os dados obtidos em experiências de biodistribuição agudas foram utilizados para realizar os cálculos de dosimetria para a estratégia de pré-direccionamento com base de Cu-64, juntamente com directamente ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Ralph Weissleder, Dr. Pat Zanzonico e Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty pelas conversas úteis e ao NIH pelo financiamento (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tetrazina NHS EsterSigma-Aldrich764701Store em -80 ° C
Trans-cicloocteno NHS EsterSigma-Aldrich764523Store em -80 ° C
p-NH2-Bn-NOTAMacrocíclicosB-601Armazenar a -80 ° O

Referências

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Reimpressões e permissões

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Rea o BioortogonalConjugado de Trans CiclooctenoRadioligante de TetrazinaMarca o com Cobre 64Cromatografia de Exclus o MolecularHPLC de Fase ReversaPET de Pequenos AnimaisRaz o Tumor Fundo
Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem
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