A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

Resumo

Aqui descrevemos uma técnica para canular o ducto linfático mesentérico em ratos que permite a quantificação do transporte de lipídios e drogas através do sistema linfático após a administração intestinal. A técnica pode ser adaptada para avaliar as concentrações de linfa mesentérica e/ou transporte de fluidos, células imunes, peptídeos, proteínas e moléculas lipofílicas.

Resumo

O sistema linfático intestinal desempenha um papel-chave no transporte de fluidos, a absorção de lipídios e função imunológica. A linfa flui directamente a partir do intestino delgado através de uma série de vasos linfáticos e dos nodos que convergem na conduta de linfa mesentérica superior. A canulação do canal linfático mesentérico permite assim a obtenção de linfa mesentéricos que flui a partir do intestino. Linfático mesentérico consiste de uma fracção celular de células imunitárias (99% de linfócitos), fracção aquosa (fluido, péptidos e proteínas, tais como as citoquinas e as hormonas do intestino) e fracção de lipoproteína (lípidos, moléculas lipofílicas e apo-proteínas). O modelo de canulação ducto linfático mesentérico pode, portanto, ser usadas para medir a concentração e velocidade de transporte de uma variedade de factores a partir do intestino, através do sistema linfático. Alterações a estes factores em resposta a desafios diferentes (por exemplo, dietas, antigénios, medicamentos) e na doença (por exemplo, doença inflamatória do intestino, HIV, diabetes) pode também be determinada. Uma área de interesse é expandir o papel do transporte linfático na absorção de drogas e pró-drogas lipofílicas administrados por via oral que se associam com as vias de absorção intestinal de lipídios. Descrevemos aqui, em detalhe, um modelo de rato canulado ducto linfático mesentérico, que permite a avaliação da taxa e extensão de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático, durante várias horas, após a libertação intestinal. O método é facilmente adaptável para a medição de outros parâmetros de linfa. Nós fornecer descrições detalhadas das dificuldades que podem ser encontradas ao estabelecer esse método cirúrgico complexo, bem como dados representativos de experiências fracassadas e bem sucedidas para fornecer instruções sobre como confirmar o sucesso experimental e interpretar os dados obtidos.

Introdução

A linfa flui a partir do intestino delgado através de um processo unidireccional que se origina no lacteals únicos que estão contidos dentro de cada pequena vilosidades intestinais ^1. Lacteals são relativamente permeáveis ​​a fluidos, macromoléculas e as células e, assim, a formação de linfa começa com a entrada destes factores em lacteals. A linfa inicial nos lacteals flui posteriormente a partir do intestino através de uma rede de microvasos linfáticos, coletando (aferentes) vasos linfáticos, uma série de linfonodos mesentéricos e, finalmente, os vasos linfáticos pós-nodal (eferente). Dentro dos nodos, linfa passa através de uma série de cavidades medulares onde a troca ocorre com as células imunitárias residentes nó assim como o material que entram no nó do sangue. Todos linfa flui do intestino delgado, eventualmente, converge para o ducto eferente linfa mesentérica superior e, posteriormente, a cisterna do quilo. A cisterna do quilo também recolhe drenagem linfática os tecidos periféricos caudais, intestinal, regiões hepáticas e lombar e junta-se o duto linfático torácico, juntamente com a linfa do mediastino e partes do crânio do corpo. O ducto linfático torácico esvazia linfa diretamente no sistema venoso na junção das veias jugular interna e subclávia esquerda. O protocolo aqui descrito, o que permite a recolha de linfa directamente a partir da conduta de linfa mesentérica superior, facilitando, assim, a análise de vários factores que transitam directamente a partir do intestino para a circulação sistémica (geral) através do sistema linfático intestinal.

As principais funções fisiológicas atribuídos ao sistema linfático intestinal são para manter o equilíbrio de fluidos, para facilitar a absorção de lípidos e molécula lipofílica, e para permitir que as respostas imunes adequadas ^1. As células tumorais e vírus também se propagar através dos vasos linfáticos intestinais ^2-4 e principais mudanças ocorrem dentro dos vasos linfáticos em várias patologias inflamatórias e metabólicas ^5-7. Latanulation do ducto linfático mesentérico para recolher linfa dentro do mesentério permite uma análise de fluxo de fluido a granel através dos vasos linfáticos intestinais, bem como a quantificação da taxa de concentração e transporte de várias células e moléculas. Alterações na concentração ou o trânsito desses fatores na resposta a vários desafios (por exemplo: dietas, antígenos, drogas) e em modelos de doenças (por exemplo, colite, HIV, diabetes) podem também ser avaliadas. Embora seja impossível para descrever exaustivamente cada componente de linfa, que podem ser analisados ​​e comparados aqui, linfa mesentéricos simplista consiste aquosa, de lípidos e fases celulares. Os componentes de interesse na fase aquosa incluem péptidos e proteínas tais como antigénios ou tolerogénios ^8, mensageiros imunes, tais como citocinas e mediadores de mastócitos, e mediadores ⁹ metabólicas tais como as incretinas ^10. A fração celular da linfa mesentérica pós-nodal é composto quase inteiramente (mais de 99%) de lymphocytes ^11. Várias células imunológicas (células dendríticas, mastócitos, etc.) penetram nos vasos linfáticos mesentéricos pré-nodais, mas permanecem dentro do nó ^12. Se as células dentro da linfa aferente são de interesse, é possível recolher essas células por meio de remoção dos gânglios linfáticos mesentéricos de vários dias antes da canulação da conduta de linfa mesentéricos ^12. Desta forma, as condutas linfáticos aferentes e eferentes são directamente ligados e as células linfáticas em linfa aferente passar directamente para o tubo linfático mesentérico. O trânsito e fenótipo de várias células do sistema imunológico que passam através dos vasos linfáticos intestinais podem, assim, ser examinado. Talvez a razão mais comum citada para a coleta de linfa mesentérica, até à data, no entanto, é estudar o processamento intestinal, absorção e transporte de lipídios na dieta e moléculas lipofílicas ^10.

Após a ingestão, os lípidos da dieta são digeridos (por exemplo, a partir de triglicéridos de ácidos gordos e de monoglicérido, phospholipid de ácidos gordos e de lisofosfolípido, e éster de colesterol de ácido gordo e de colesterol, etc.) e dispersos no lúmen intestinal em pequena das micelas e vesículas através da adição de compostos anfifílicos de bílis (fosfolípidos, colesterol e sais biliares) e a acção de enzimas pancreáticas ^10,13. De lá eles são absorvidos enterócitos. A proporção dos componentes absorvidos são re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos e ésteres de colesterol no interior das células de absorção (enterócitos). Estes lípidos re-esterificados são montados a partir de uma combinação de componentes lipídicos exogenamente ingerida e componentes lipídicos endógenos da bílis segregada, piscinas ou lípidos da mucosa intestinal o fornecimento de sangue ^13. A partir daqui os lípidos estéril içados são armazenados dentro de enterócitos ou montados em lipoproteínas intestinais (quilomicrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL)) em conjunto com várias outras apoproteínas e moléculas lipofílicas ( , por exemplo, vitaminas) ^10,13. Depois de sair enterócitos, lipoproteínas são especificamente transportados a partir do intestino para a circulação sistémica através do sistema linfático mesentérico como lacteals intestinais são mais permeáveis ​​a sua entrada do que os capilares sanguíneos intestinais. A proporção de componentes lipídicos são também absorvidos transportados a partir do intestino para o sistema circulatório através dos capilares sanguíneos e veia porta como, não só lipoproteína associados, ¹⁴ moléculas. Em geral, no entanto, a via de transporte da veia portal é apenas um actor importante na absorção de lípidos de comprimento de cadeia curto e médio prazo.

A recolha de linfa mesentéricos permite assim a avaliação do transporte de lipoproteínas e os componentes associados (lípidos, moléculas lipofílicas, apo-proteínas) a partir do intestino. As lipoproteínas podem ser quantificados e caracterizado com a vantagem de que as lipoproteínas linfáticos mesentéricos, em geral, estão em uma nascenestado t, uma vez que não foram extensivamente modificado por enzimas sistêmicas tais como lipoproteína lipase ^15. Embora o modelo de rato canulada linfático mesentérico foi talvez historicamente sido mais extensivamente descrito para a análise de transporte de lípido / lipoproteína a partir do intestino, uma área de expansão interesse é o papel de vasos linfáticos no transporte de fármacos lipofílicos, pró-drogas e outros xenobióticos ^13,16 que é o foco do modelo descrito aqui. Fármacos lipofílicos (geralmente aqueles com log P> 5 e solubilidade em cadeia longa triglicéridos> 50 mg / g, embora exceções são aparentes) ^17,18, pró-drogas ¹⁹ e outros xenobióticos ^13,16 pode ter acesso aos vasos linfáticos intestinais passivamente ou por integrar activamente em lipoproteínas intestinal vias de transporte ^19.

O rato linfa mesentérica técnica de punção, portanto, tem muitas aplicações. Bollman et al. Descreveu pela primeira vez um technique para canular a conduta de linfa mesentéricos de ratos em 1948 ^20. Desde então um certo número de variantes do modelo foram descritos. Por exemplo, a coleta pode ocorrer quando o rato é anestesiados com vários anestésicos ^21,22, ou no estado consciente enquanto conteve ¹⁵ ou mover livremente ^23,24. Os ratos podem ser administrados diferentes soluções de reidratação e outras substâncias, tais como lípidos e de formulações de drogas em taxas diferentes no estômago, intestino ou parentérica (tipicamente 0-5 ml / h) ^25. Em alguns estudos, o ducto torácico linfático em vez de ducto linfático mesentérico é canulada para estimar o transporte a partir do intestino através dos vasos linfáticos, embora isto possa subestimar o trânsito do intestino delgado, dependendo o factor de interesse, como a conduta de linfócito torácico recebe também a partir de linfa outra regiões ^22,26. Modelos de canulação linfáticos também foram descritos em várias outras espécies, incluindo ratos ^15,27, mini-pigs ^{12, 28,29} ovelhas, porcos e cães ^{30 31.} No entanto, o modelo de rato é o mais amplamente e de forma consistente citados. Protocolos detalhados para canulação do ducto linfático mesentérica seguido da coleta de linfa no consciente ²⁵ ou anestesiados ²² ratos e camundongos ^15,27 foram publicados anteriormente e o leitor interessado é direcionado para estes protocolos. Este protocolo é o primeiro a demonstrar a técnica em um formato visualizado.

O modelo de rato linfa cânula tem vantagens sobre animais de grande porte em termos de despesa, a facilidade da cirurgia e considerações éticas. Quando comparado com o modelo do rato, mesentérica linfa cirurgia cannulation também é mais fácil no rato, embora o modelo de rato permite estudos mais detalhados em animais transgênicos ^27. No entanto, existem algumas limitações do modelo de rato, particularmente aqueles associados com diferenças na fisiologia, esse limite extrapolatião positivo para outras situações pré-clínicos e clínicos. Por exemplo, o fluxo de bílis no rato é constante e independente da ingestão de alimentos enquanto que na maior comida lipídios espécies ou estimular o fluxo de bílis ^32. Isso cria desafios para a obtenção de ambientes de pré e pós-prandial representativos no rato que refletem o que é visto em espécies e seres humanos maiores. Para os estudos de distribuição de drogas, espécies maiores também podem ser preferidos na avaliação dos transportes linfática após a administração da dose humana realista forma ^25. Em um estudo recente, as taxas de transporte de lipídios na linfa mesentérica foram encontrados para ser comparáveis ​​entre espécies (rato, cão) após a administração de uma massa equivalente e tipo de lipídio que fornece alguma confiança na extrapolação de dados de transporte de lipídios entre espécies ^27. No entanto, o transporte de um modelo lipofílico de drogas, halofantrina, classificados em ordem de tamanho do animal (ou seja, cão> rat> mouse). Um fator de escala pode, assim, ser obrigado a extrapolate dados de transporte de drogas linfáticos de rato a outras espécies.

Uma limitação dos modelos de canulação de linfa, em geral, é que a recolha de linfa passiva directamente a partir de uma conduta linfático pode modificar o fluxo linfático e de transporte uma vez que os vasos linfáticos trabalhar contra um gradiente de pressão que é alterada uma vez que o recipiente ³³ é canulada. O modelo cannulation linfático também pode ser difícil de estabelecer, em laboratórios que não estão familiarizados com a técnica. Modelos alternativos têm sido assim descrito. Por exemplo, o transporte de factores através do sistema linfático intestinal, tais como lipoproteínas e moléculas lipofílicas, foi estudado indirectamente através de recolha do sangue. Um desses modelos envolve a comparação de concentrações de lípidos no sangue e / ou drogas, após a administração oral, na presença e na ausência de inibidores (por exemplo, colchicina, Pluronic L81, ciclo-heximida) produção de lipoproteína intestinal que bloqueie o transporte linfático ^34. Uma vantagemde modelos que quantificam transporte linfático indiretamente por meio da coleta de amostras de sangue é que ele permite alguma avaliação do transporte linfático em humanos como cirurgia invasiva não é necessária ^35. No entanto, os inibidores de transporte linfático não são específicas e factores que são transportados através dos vasos linfáticos são diluídos e modificado na circulação sistémica que complica estas avaliações. In vitro alternativas também têm sido descritos. Por exemplo, Caco-2 celulares ou isolado enterócitos culturas têm sido utilizados para estudar mais detalhadamente a secreção intestinal de moléculas que entram nos vasos linfáticos ^36-38. Um modelo avançado in vitro que é mais representativo do microambiente intestinal humana também foi descrita recentemente ^39. Neste modelo, uma camada de células endoteliais linfáticas é co-cultivadas com células Caco-2, que permite uma análise mais detalhada da transferência de substâncias a partir do intestino para o sistema linfático. No entanto, em vitro sistemas de células não possuem fluxo cambial e transferir ou seja, a interligação com um lúmen intestinal e sangue subjacente e suprimento vascular linfático. Em uma abordagem alternativa, Kassis et al. Estabeleceram um dual-channel (alta velocidade vídeo de campo brilhante e fluorescência), em sistema de imagem situ que permite comparações quantitativas entre contração dos vasos, o fluxo de linfa e concentrações de lipídios fluorescentes em vasos linfáticos mesentéricos ^33. Uma vantagem deste modelo sobre o acima mencionado em sistemas in vitro é que ele permite a localização precisa da passagem de células do sistema imunológico através dos vasos linfáticos. Medições absolutas de massa de lípidos (ou medicamento) de transporte são, no entanto, ainda não está estabelecida utilizando métodos de imagem. Estudos in vitro e in silico abordagens especificamente para prever o grau de transporte da droga lipófila através dos vasos linfáticos intestinais foram também publicados ^40-42. Por exemplo, a afinidade ex vivo de vários compounds para chylomicrons plasma correlacionou-se razoavelmente bem com o seu transporte linfático in vivo ^41. Posteriormente, o mesmo grupo estabeleceu um modelo em silico para prever a afinidade da droga para chylomicrons com base em múltiplos ^{de 40} propriedades físico-químicas. Holm et al., Também estabelecida uma relativamente complexo no modelo para prever silico imediato transporte linfático de compostos lipofílicos em função dos descritores moleculares ^42. Estes modelos podem proporcionar uma abordagem útil para prever a extensão de transporte linfático de drogas desconhecidas. A validação dos modelos com uma grande variedade de drogas e em diferentes laboratórios, no entanto, ser necessário para confirmar a sua precisão e reprodutibilidade.

A canulação do canal linfático mesentérico permanece, assim, os únicos meios para examinar directamente o conteúdo de drenagem linfática do intestino delgado e a velocidade de trânsito do complexo conjunto de factores (células, proteínas,peptídeos, lipídios, medicamentos) a linfa em uma situação in vivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a canulação do ducto linfático e carótida artéria mesentérica, que permite a coleta de linfa mesentérica e arterial sistêmica de ratos anestesiados. Os dados representativos demonstram como o modelo pode ser usado para examinar o transporte de lípidos e de drogas a partir do intestino, através do sistema linfático mesentérico. Isto é seguido por uma discussão das dificuldades que podem ser encontradas no estabelecimento do modelo e um guia de resolução de problemas. Uma vez estabelecido o modelo é uma ferramenta poderosa para investigar transporte linfático intestinal.

Protocolo

Os estudos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo comitê de ética animal local e foram conduzidos de acordo com a Austrália e Nova Zelândia Conselho para o tratamento de animais em diretrizes pesquisa e ensino. Antes de iniciar qualquer procedimento animal, garantir que a permissão adequada é obtida através do local de instituição / organização. Tal como acontece com todas as cirurgias de animais, assegurar que a cirurgia é realizada por operadores devidamente treinados, sob condições assépticas e que os anestésicos, analgésicos e antibióticos são administrados quando necessário para garantir um resultado ético e bem sucedida.

1. Preparações do dia antes do procedimento cirúrgico

1. Velocidade com que o rato a noite antes da cirurgia, se necessário. Verifique se o rato tem livre acesso à água.
2. Preparar as soluções a ser administrada ao rato.
   1. Prepare uma solução de reidratação, como solução de Ringer ou soro fisiológico estéril.
   2. Prepare umsoluções estéticas como requerido. O anestésico utilizado nas experiências descritas aqui consistiu em "Cocktail 1" preparado por combinação de 1,9 ml de cetamina 100 mg / ml, 0,5 ml de xilazina 100 mg / ml, 0,2 ml de acepromazina 10 mg / ml e 2,5 ml de solução salina e " 2 cocktail "que consiste em 1 ml de cetamina 100 mg / ml e 0,1 ml de acepromazina 10 mg / ml. NOTA: isoflurano inalado ou sevoflurano pode ser preferido, uma vez que pode fornecer um plano cirúrgico de anestesia durante um longo período de tempo.
   3. Opcionalmente preparar uma formulação que contém o fármaco, por exemplo, uma emulsão de lípidos. Realizar estudos de estabilidade adequados para garantir a estabilidade da formulação ao longo do período de armazenamento e administração.
      NOTA: A natureza exacta da formulação e da droga a ser administrada irá variar de acordo com cada um dos estudos, como o objectivo de estudos de transporte de fármacos linfáticos é mais frequentemente para avaliar a eficiência do transporte da droga linfático como uma função da formulação da droga e administered.
      1. A formulação utilizada nas experiências representativas na Figura 4 e 5 aqui é preparado, tal como descrito anteriormente ^43. Resumidamente, incorporar o ácido oleico ¹⁴ C (2-5 uCi) e halofantrina (200 ug) em 40 mg de ácido oleico antes da dispersão em 5,6 ml de uma fase aquosa que consiste de taurocolato de sódio a 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9).
      2. Para formulações contendo de 2-mono-oleína, adicionar 7,1 mg de 2-mono-oleína juntamente com outros componentes, para a fase aquosa, ao mesmo tempo que a fase de ácido oleico contendo halofantrina. Preparar as formulações que contêm 2-monooleína imediatamente antes da administração ao rato de 2-mono-oleína é relativamente instável e isomerises de 1-mono-oleína.
      3. Subsequentemente emulsionar as formulações por ultra-sons durante 2 minutos à temperatura ambiente.
         NOTA: Como tem sido descrita anteriormente ^43, monitorar a estabilidade das formulações por i) inspecção visual da emulsion, sob luz polarizada para assegurar que a emulsão não é de fase separada, ii) análise do tamanho de partícula imediatamente após a preparação e após a dosagem utilizando dispersão de luz dinâmica para proporcionar uma indicação de quaisquer mudanças de fase e / ou a separação, e iii) análise de concentrações usando halofantrina um ensaio de HPLC validado.
3. Preparar a solução de anti-coagulante contendo 10 mg / ml de EDTA em água estéril ou 10 UI / ml de heparina em solução salina para lavar a cânula linfa. Também preparar solução de anti-coagulante contendo 2,5-10 UI / ml de heparina em solução salina para expulsar da cânula da artéria carótida.
4. Preparar as cânulas de polietileno para a inserção dentro da conduta de linfa mesentéricos (0,8 mm de diâmetro externo, 0,5 mm de DI), artéria carótida (0,96 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de diâmetro ou 0,8 mm de diâmetro externo, 0,5 mm de diâmetro) e do duodeno (0,96 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de DI )
   1. Corte as cânulas para o comprimento requerido (tipicamente 25 - 30 cm para a artéria carótida e a cânula duodenal e 10 - 15 cm, para a linfa cânula) e colocar um chanfro na ponta das cânulas utilizando uma lâmina cirúrgica estéril (ver Figura 1).
      NOTA: Isto aumenta a facilidade de inserção de cânula e reduz a incidência da cânula bloqueio pós-inserção.
   2. Coloque um ponto de ancoragem na forma J cânula intraduodenal passando uma pequena porção da cânula para trás sobre si mesma, aquecendo-o com uma placa mais leve ou a quente e, em seguida, o corte de tamanho (ver Figura 1).
5. Anexar a cânula linfa para uma agulha de 25 G e seringa contendo uma solução de anti-coagulante (preparado no passo 1.3). Encher a cânula linfa com a solução de anti-coagulante e deixar a solução na cânula O / N para reduzir a incidência de formação de coágulo dentro da cânula durante a colheita de linfa linfa.
6. Prepare tubos para coleta de linfa e amostra de sangue. Pré-pesar tubos de coleta de linfa, tubos de etiqueta para a coleta de linfa e amostra de sangue e adicionar solução anti-coagulante. Adicionar solut anti-coagulante suficientede iões para atingir uma concentração final de 1 mg / ml de EDTA em água estéril ou de 10 - 20 UI / ml de heparina no sangue ou linfa recolhida.

2. Preparações Imediatamente antes de iniciar o procedimento cirúrgico

1. Verifique todas as cânulas por lavagem com solução anti-coagulante salina estéril ou para garantir que eles são patentes.
2. Prepare o rato para o procedimento cirúrgico.
   NOTA: A conduta de linfa mesentérica é mais visível em ratos que comeram ou foram administrados uma dose de óleo como a linfa mesentérica torna-se leitoso e opaco com maior carga lipídica. Alguns operadores, particularmente aqueles que são novos para a cirurgia, portanto, acham mais fácil cannulate o duto de linfa mesentérica quando os ratos são pré-tratados com um óleo (cerca de 0,1-1 ml), tais como azeite ou óleo de soja 0,5-2 horas antes da cirurgia com início . No entanto, o óleo de pré-dosagem, afecta o transporte linfático de lípidos, drogas lipofílicas e de outros factores na linfa de tal modo que ele não pode ser ideal para pré-dose de petróleoconsoante o objectivo da experiência.
   1. Anestesiar o rato durante todo o período de coleta de cirurgia e amostra.
      1. Por exemplo, iniciar a anestesia por meio de injecção subcutânea de 1,5 ml / kg de cocktail I (a partir do passo 1.2.2) numa prega da pele na parte de trás do pescoço ratos utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25. Manter a anestesia por meio de injecção intraperitoneal de 0,44 ml / kg de cocktail 2 (a partir do passo 1.2.2) aproximadamente cada hora, conforme necessário, utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 25.
      2. Antes de iniciar a cirurgia assegurar que a profundidade da anestesia é suficiente observando taxa respiratória, o movimento suiça, tónus muscular e respostas a estímulos, tais como comprimindo de pé. Administrar anestesia adicional conforme requerido.
   2. Raspar a pele das regiões cirúrgicas, que incluem o lado direito do abdómen para a linfa e canulação duodeno, e a região pescoço e clavícula esquerda para a cânula da artéria carótidação.
   3. Limpe as regiões cirúrgicos assepticamente utilizando solução solução de clorexidina ou povidine-iodo e um matagal etanol 70%. Repita 3 vezes para cada região, terminando com uma limpeza final com etanol 70%.
3. Colocar o animal em decúbito dorsal numa folha limpa de cima de uma almofada cirúrgico aquecido (37 ° C).

3. A canulação da linfa mesentérica Duct

1. Colocar o animal com o lado direito virado para o operador. Realizar a cirurgia, com ou sem o auxílio de um microscópio cirúrgico, conforme necessário.
2. Abrir a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão de 4 cm linear se prolonga a partir da linha média (processo xifóide) para o flanco direito de aproximadamente 2 cm abaixo da caixa torácica (RCD) usando uma lâmina de bisturi estéril (ver Figura 2B).
3. Abra as restantes camadas da parede muscular abdominal 4-5 mm lateral à linha média para o flanco direito com um pequeno parde tesouras cirúrgicas (ver Figura 2B).
4. Recolha o intestino delgado sob a parede muscular abdominal esquerdo e mantê-lo no lugar usando 2-3 pedaços de gaze estéril saturadas com soro fisiológico normal.
5. Ponte do rato ao longo de um seringa de 10 ml de plástico colocada horizontalmente por baixo das costas do rato ao nível de rim direito para facilitar a visualização do ducto linfático mesentérico.
6. Localizar o ducto mesentérica superior linfa: um vaso aproximadamente 0,5-1 mm de diâmetro, que é perpendicular ao rim direito e imediatamente rostral e paralelo à artéria mesentérica (um vaso sanguíneo vermelho escuro pulsante; ver Figura 2C).
   NOTA: Em ratos pré-doseadas sem jejum ou oleosas do vaso é branco, opaco e mais fácil de visualizar do que em ratos em jejum em que é bastante transparente.
7. Inspeccionar a área imediatamente caudal ao ducto linfa mesentérica superior e artéria mesentérica para determinar se uma segunda conduta de menor linfa, é acessóriopresente. Se estiver presente, bloquear o fluxo de linfa através da conduta por meio do corte da conduta e ocluir com supercola, ou atar um fio de sutura em torno da conduta, para garantir que todo o volume do fluxo de linfa do intestino é recolhido a partir da conduta de linfa mesentérica superior.
8. Passar por um par de fórceps rectas através do leito de gordura peri- renal na margem inferior do rim direito, e através das camadas de tecido conjuntivo imediatamente abaixo da veia cava, numa direcção paralela com a conduta de linfa mesentérica superior.
9. Com a ponta do fórceps, ter de segurar a cânula linfa e puxá-lo através do leito de gordura peri-renal com uma extremidade imediatamente adjacente à conduta de linfa mesentéricos e o outro exteriorizada do animal ao nível do rim direito.
10. Isolar a conduta de linfa mesentérica de sobrepondo camadas de tecido conjuntivo e gordura por dissecção romba. Tome cuidado para não furar ou danificar o ducto linfático.
11. Após o isolamento do duto linfático, faça um pequeno hole no duto linfático tanto com micro-tesoura, a ponta afiada de uma pinça de joalheiro ou uma agulha 25 G. Tome cuidado para não cortar completamente o vaso.
12. Assegure-se que a cânula de linfa é completamente cheio com a solução de anti-coagulante (usando uma seringa e uma agulha de 25 G), sem lacunas de ar. Inserir a cânula linfa aproximadamente 2-4 mm para dentro da conduta de linfa mesentéricos, através do pequeno orifício com a ajuda de um pequeno par de fórceps.
13. Observe a cânula de linfa por um par de minutos. Observar um fluxo gradual da linfa intestinal a partir do final de recolha livre da cânula se a punção é bem sucedida. Se a punção não é bem-sucedida, repita os passos 3,8-3,12.
14. Se o punção é bem sucedido, segurar a cânula, colocando uma pequena gota de cola veterinária sobre o orifício de entrada para a conduta de linfa. Tome cuidado para não obstruir o vaso através da aplicação de excesso de adesivo veterinária.
15. Enquanto espera para o adesivo veterinário para definir, observe o fluxo de linfa durante vários minutos para assegurar que o procedimento de canulação foi bem-sucedida. Uma vez determinado o sucesso da canulação, remover as peças de gaze que foram colocadas na cavidade abdominal cuidadosamente e colocar o intestino delgado na sua posição original.
16. Coloque um tubo de recolha de linfa contendo anti-coagulante (ver passo 1.6) na extremidade da cânula para recolher a linfa de fluxo livre.
17. Em seguida, canular o duodeno para a infusão de soluções de re-hidratação e / ou formulações.

4. A canulação do duodeno

1. Anexar o duodeno cânula para uma seringa (por exemplo, 10 ml) cheio com a solução de re-hidratação.
2. Identificar o duodeno como o rosa brilhante (com mais vasos sanguíneos) seção do intestino delgado, que após suave para baixo puxando revela o estômago.
3. Fazer um pequeno orifício de punção no duodeno com aproximadamente 2 cm abaixo da junção do estômago e do duodeno (a piloro) usandoum estéril 23 G agulha.
4. Insira a extremidade em forma de gancho J da cânula duodenal através do orifício da punção. Segura no lugar com uma gota de cola de cianoacrilato.
5. Começando a hidratação do rato, anexando a cânula à seringa reidratação carregado na bomba de infusão. De acordo com a literatura as taxas de re-hidratação variam 0,5-3 ml / hr ^15,25.
6. Após a conclusão da linfa e canulação duodeno, fechar a incisão na parede muscular abdominal com sutura. Em seguida, fechar a incisão na pele por aplicação de algumas gotas de adesivo de tecido (cianoacrilato) ao longo do lado da incisão e comprimindo a pele de ambos os lados da incisão em conjunto.

5. A canulação da artéria carótida

A canulação da artéria carótida pode ser realizada antes ou após a canulação do canal linfático mesentérico. Alguns operadores preferem para canular a artéria carótida antes da canulação da conduta de linfa, de modo a reduzir pocialmente a retirada da cânula linfa ao mover o animal.

1. Colocar uma marca na cânula na artéria carótida 2,5 cm da ponta cónica para identificar a porção da tubagem para inserir dentro da artéria. Ligar-se a outra extremidade da cânula (isto é, sem bisel) de uma agulha G 23 ou 25 ligada a uma seringa cheia com solução de anti-coagulante e encher a cânula com a solução de anti-coagulante para garantir que não há intervalos de ar estão presentes.
2. Para facilitar a punção, coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal com o pescoço esticado e cabeça apontando para o operador. Note-se que alguns operadores preferem realizar esta técnica com a cauda do rato apontando para o operador.
3. Coloque um 1 - 1,5 centímetros incisão longitudinal através da camada de pele por cima da esquerda da traqueia no plano sagital.
4. Dissecar o tecido conjuntivo subcutâneo usando uma pinça ponta romba para expor os músculos do pescoço emparelhados subjacentes.
5. Retrair os músculos do pescoço to revelar a artéria carótida esquerda (localizado ~ 1 cm abaixo da superfície da pele e pulsação). Limpar o tecido conjuntivo sobrejacente da artéria por dissecação romba.
6. Isolar um cm secção da artéria usando cuidadosamente uma pinça sem corte, tomando cuidado para não danificar a pista nervo vago ao lado ~ 1. Realize esta abrindo e fechando a pinça ponta romba verticalmente ao longo de ambos os lados da artéria para libertá-la a partir do tecido circundante e nervo vago.
7. Utilizando uma pinça de ponta fina, passe duas suturas de seda por baixo da artéria carótida e colocá-los em cada extremidade da secção da artéria isolado. Amarrar a sutura mais próxima do operador e mais afastadas do coração e clavícula (Figura 3A) do rato.
8. Oclusão do fluxo de sangue através da artéria, colocando um par de pinças de ponta fina rectas debaixo da artéria (Figura 3B).
9. Usando as tesouras finas ponta da íris, colocar uma pequena incisão na superfície superior do vaso (cerca de 1/3 docaminho para baixo a partir do topo da área isolada). Lave todo o sangue derramado na superfície da artéria com solução salina heparinizada e limpe cuidadosamente usando cotonetes.
10. Inserir a ponta da cânula na artéria com um par de pinças de ponta curva. Uma vez inserido, remover a pinça de ponta fina rectas oclusão o fluxo de sangue e fazer avançar a cânula de 2,5 centímetros na artéria utilizando dois pares de pinças, uma para manter a cânula no interior da artéria, para impedir fugas de sangue para trás e para a outra para inserir a cânula.
11. Use uma pinça pequena artéria para segurar a cânula dentro da artéria e retirar a pinça de ponta fina retas que foram colocados abaixo da artéria no passo 5.8 para ocluir o fluxo de sangue.
12. Confirme a desobstrução da cânula através da injeção de solução anti-coagulante na cânula e puxando para trás uma pequena quantidade de sangue (Figura 3C). Em seguida, o expulsar da cânula com solução anticoagulante e vedar a extremidade utilizando a chama de um isqueiro ou de um tampão cânula.
13. Amarre the cânula no lugar com as duas suturas colocadas sob a artéria na etapa 5.8.
14. Retire o grampo artéria e garantir uma terceira sutura em torno da artéria e cânula. Feche o pescoço enrolado com suturas.

Período 6. Pós-cirúrgico e Formulação Infusion

1. Continuar a manter o rato sob anestesia e na almofada aquecida.
2. Reidratar o rato via infusão de solução de reidratação para o duodeno, durante pelo menos 0,5 horas após a realização das cânulas. Observe a diminuição da taxa de fluxo de linfa (~ 0,1-0,5 ml / h) durante o período inicial após punção e em breve aumentar a uma linha de base estável (0,4-2,5 ml / h dependendo da taxa de reidratação).
3. Após o período de recuperação, infundir a formulação de interesse (contendo lípidos, drogas, etc.) para o duodeno através da cânula. Opcionalmente, usar uma bomba de infusão para regular o caudal da formulação. NOTA: No protocolo descrito aqui os animais permanecem Anaesthetised durante todo o período de recolha de cirurgia e linfático e são sacrificados sob anestesia de tal modo que a analgesia adicional não é necessária. Se o protocolo é modificado e animais estão habilitadas a recuperar a consciência depois analgesia adequada e cuidados pós-operatórios serão necessários.
4. Após a conclusão da infusão de formulação continuam a re-hidratar o rato a uma taxa de 1,5-3 ml / h com uma solução salina normal para o duodeno, para evitar a desidratação.
5. Continue a manter o rato sobre o bloco cirúrgico aquecida 37˚C para manter a temperatura (como por passo 2.3), urina expressa da bexiga através de pressão descendente suave na parte inferior do abdômen, conforme necessário e reaplicar pomada oftálmica a cada hora (conforme passo 2.2. 3). Mudanças posturais, regulares são recomendados se o animal está a recuperar a consciência após o procedimento.

7. Recolha de linfa e amostras de sangue para avaliar Lipid e absorção da droga

1. Recolha linfa continuamente emtubos contendo anti-coagulante. Mudança de tubos com os intervalos de tempo necessários (por exemplo, de hora em hora).
2. Coletar amostras de sangue em pontos de tempo set.
   1. Oclusão do fluxo de sangue através da cânula, dobrando de volta a cânula aproximadamente a 2 cm da extremidade selada. Desselar a cânula cortando a extremidade selada ou retirar o tampão de uma cânula.
   2. Usando uma seringa vazia, retirar salina heparinizada a partir da cânula até o sangue enche toda a cânula.
   3. Usando uma nova seringa vazia, retirar o volume desejado de sangue e coloque em um tubo contendo anti-coagulante.
   4. Usando a primeira seringa, substitua o sangue colhida antes da amostragem para reduzir a perda de sangue desnecessário. Antes da injeção, passe rapidamente a seringa, mantendo-o na vertical para garantir que não há bolhas de ar entrar na cânula.
   5. Usando uma seringa, substituir o volume de sangue retirado do rato com uma solução de anti-coagulante. Certifique-se de que nenhum resíduo de sangue é visível na cânula como qualquer restante pode coagulare bloquear a cânula.
   6. Curvatura da cânula com aproximadamente 2 cm a partir da extremidade não selada para bloquear o fluxo de sangue e remover a seringa. Usando a chama de um isqueiro ou de um tampão cânula, selar a cânula.
3. Após a conclusão do sangue e linfa coleção do rato, eutanásia do rato via intraperitoneal de> 100 mg / kg pentobarbital de sódio.
4. Determinar a taxa de fluxo da linfa através da medição da massa de linfa recolhida durante cada período de tempo.
5. Medir a concentração de droga e de lípido na linfa e sangue utilizando, por exemplo, HPLC, HPLC-MS ou utilizando kits comerciais, de lípidos e para avaliar a eficiência de absorção do fármaco.
6. Calcule o transporte de massa da droga e lipídios na linfa a partir do produto das concentrações medidas e volume de linfa recolhidos.

Resultados

Os resultados de uma experiência representativa para quantificar a extensão cumulativa e taxa de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático intestinal após o parto utilizando o modelo de canulação da linfa mesentéricos são mostrados na Figura 4 e na Figura 5. Nesta experiência, 200 ug do modelo lipofílico halofantrina fármaco foi administrado dentro do duodeno de ratos ao longo de 2 horas, em uma formulação contendo 40 mg de ácido oleico (incluindo 2-5 uCi de ¹⁴

Discussão

O modelo de rato canulação linfático mesentérico permite a quantificação directa da concentração e da taxa de transporte de várias células e moléculas (tais como lipidos e medicamentos) a partir do intestino para a linfa e as modificações dos mesmos que ocorrem em resposta ao desafio de várias substâncias (dieta , antigénios, fármacos, formulações, etc.) e ^10,27 doença (cancro, vírus, colite, resistência à insulina, etc) ^5-7. Os componentes recolhidas na linfa também pode ser aind...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina estéril	Baxter healthcare	AHB 1307	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Baxter 100 ml sacos de solução salina, caixa de 50
70% etanol em água	Qualquer		marca pode ser usada
Solução de gluconato de clorexidina (Microshield 4)	Livingstone International	JJ60243L	Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Solução de Betadine	Livingstone International	BU0510	Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Cetamina 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injeção (Acepromazina 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Pentobarbitone de sódio	PROVET VICTORIA	24529	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Lethabarb® 325 mg/ml de pentobarbital sódico, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparina (35000I.U. em 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) sal dissódico di-hidratado	Sigma-Aldrich	E1644	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o sal dissódico de EDTA da Sigma.
Cânula de polietileno (PE) o.d. 0,96 mm x i.d. 0,58 mm	Extensões de microtubos	PE8050	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,96 x0,58 mm, cânula
polietileno (PE) de 30 m o.d. 0,8 mm x i.d. 0,5 mm	Extensões de microtubos	PE9658	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,8 x0,5 mm, 30 m
Régua	Qualquer		marca pode ser usada
Marcadores	Qualquer		marca pode ser usada
Isqueiro	Qualquer		marca Qualquer marca pode ser usada
Adesivo veterinário	Qualquer		marca pode ser usada
Agulhas de calibre 23	Livingstone International	DN23GX0.75LV	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV
Agulhas de 25 gauge	Livingstone International	DN25GX1.0LV	Qualquer marca pode ser usada. O exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
Seringa de 1 ml	Livingstone International	T3SS01TA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
seringa de 10 ml	Livingstone International	T3SS10SA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Cotonetes de gaze	Livingstone International	GSC075	Qualquer marca pode ser usada e cortada no tamanho necessário. Exemplo aqui é cotonetes de gaze de algodão preenchidos 7,5x7,5 cm, 8 camadas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Cotonetes	Livingstone International	CTAST075DP	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o aplicador de algodão Livingstone com ponta dupla de plástico. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP
Almofada de aquecimento	Ratek	WT1	Qualquer marca que mantenha a temperatura em 37C pode ser usada. Exemplo aqui é a bandeja de aquecimento Ratek.
Aparelho Harvard de luz cirúrgica		72-0215 com 72-0267	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o aparelho Harvard V-Lux 1000 Cold Light Source com guia de luz bifurcada Gooseneck, preto, 4,7 mm de diâmetro de fibra (cada braço). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail e  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___
Microscópio cirúrgico	Zeiss	495005-0014-000	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o estereomicroscópio Zeiss Stemi 2000-C com suporte S Double Spot e KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Sutura de seda	Livingstone International	DTSK163019F4	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é   3/8 Círculo Reverso Sutura de Seda 3/0 Fio 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Lâminas de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	10020-00	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a lâmina de bisturi FST # 20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Cabo de bisturi	Fine Science Tools (FST)	10004-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o cabo de bisturi FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Tesoura cirúrgica pequena	Fine Science Tools (FST)	14060-09	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura fina FST, 9 cm com aresta de corte de 21 mm, afiada, reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Fórceps com ponta curva serrilhada	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	11001-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça de padrão padrão FST de 13 cm com ponta curva de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Tesoura de Iridectomia	Fine Science Tools (FST)	15000-08	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura de mola FST Vannas - aresta de corte de 2,5 mm, reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16
1 x Fórceps com ponta serrilhada reta	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	11650-10	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é FST Graefe 10 cm reto com ponta serrilhada de 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Fórceps com ponta fina reta lisa e afiada	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	11251-10	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça FST Dumont #5 reta de 11 cm com ponta de 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Pinça com pinça curva fina e lisa	Ferramentas de Ciência Fina (FST)	11063-07	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça FST Delicate 9 cm com ponta lisa de 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Ferramentas	Ciência Fina Hemostats (FST)	13010-12	Qualquer marca pode ser usada. Nem todos os operadores usam os hemostáticos. Exemplo são os hemostáticos Micro-Mosquito FST de 12 cm com ponta serrilhada e reta de 20 mm de comprimento x 1,3 mm de largura. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suporte de agulha de sutura	Fine Science Tools (FST)	12001-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o porta-agulhas FST 13cm Hasley com ponta de 16 mm de comprimento x 1,9 mm de largura. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Grampo de artéria	Fine Science Tools (FST)	18050-28	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é FST Bulldog Serrefines reto, 28 mm de comprimento, dimensão de mandíbula de 9x1,6 mm com prensa de grampo médio. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Ácido oleico	Sigma Aldrich	O1008	Quando necessário, qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é 99% de ácido oleico puro. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
ácido 14C-oleico	Perkin	NEC317050UC	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é Ácido Oleico, [1-14C]-, 50µ Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Taurocolato de sódio	Sigma Aldrich	T4009	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o hidrato de sal de sódio do ácido taurocólico ≥ 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU
Halofantrine	Glaxo Smith Kline		Halofantrine foi gentilmente cedida como um presente da Glaxo Smith Kline
Fosfato de sódio monobásico	Sigma Aldrich	71507	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o fosfato de sódio monobásico monohidratado, BioXtra, para biologia molecular, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU
Fosfato de sódio dibásico	Sigma Aldrich	71643	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é fosfato de sódio dibásico di-hidratado, BioUltra, para biologia molecular, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU