Abstract
Förmågan hos maligna celler att undvika immunsystemet, som kännetecknas av tumör flykt från både medfödda och adaptiva immunsvar, är nu accepterat som en viktig kännetecken för cancer. Vår forskning om bröstcancer fokuserar på den aktiva roll som tumörinfiltrerande lymfocyter spelar i tumörprogression och patient utfall. Mot detta mål har vi utvecklat en metod för snabb isolering av intakta lymfoida celler från normala och onormala vävnader i ett försök att utvärdera dem intill deras naturliga tillstånd. Homogen framställda med hjälp av en mekanisk dissociator show både ökad lönsamhet och cell återhämtning samtidigt som ytreceptor uttryck jämfört med enzym-spjälkade vävnader. Dessutom har enzymatisk nedbrytning av det återstående olösliga materialet inte återskapa ytterligare CD45 + celler indikerar att kvantitativa och kvalitativa mätningar i primär homogenatet sannolikt verkligen speglar infiltrerande subpopulationer i vävnaden fragment. De lymfoida celler i dessa homogenat kan lätt karakteriseras med användning av immunologiska (fenotyp, proliferation, etc.) eller molekylär (DNA, RNA och / eller protein) närmar. CD45 + celler kan också användas för subpopulationen rening in vitro expansion eller kryokonservering. En ytterligare fördel med detta tillvägagångssätt är att den primära vävnads supernatanten från homogenaten kan användas för att karakterisera och jämföra cytokiner, kemokiner, immunoglobuliner och antigener närvarande i normala och maligna vävnader. Detta protokoll fungerar extremt väl för mänskliga bröstvävnad och bör vara tillämplig på ett brett utbud av normala och onormala vävnader.
Protocol
OBS: Alla exemplaren förvärvats med hjälp av ett protokoll som godkänts av medicinska etiska kommittén för Institutet Jules Bordet med skriftligt informerat samtycke från varje patient.
1. Beredning av vävnadshomogenatet
- Dissekera resekeras vävnader (malign och normal vävnad resekterades från operationssalen) är i patologi labb av utbildad personal för omedelbar upphämtning. Tumör, NANT (tagit längst avstånd från tumören som möjligt) och normala vävnadsfragment rutinmässigt behandlas inom 1-3 tim för kirurgisk excision i en BSL2 laboratorium med hjälp av standard biosäkerhet förfaranden för mänskliga vävnader. Ett flödesschema av protokollet illustreras i figur 1.
- Väg alla vävnadsfragment (normal, Nant och tumör) och mäta längd, bredd och höjd (längd x bredd x höjd). Detta är ett viktigt steg för den efterföljande normalisering av cellpopulationer, extraherade RNA, etc.
NEJTE: Utbudet av urvalsstorleken är 100 till 10.000 mm 3 med något fett om möjligt. - Kopiera in tumörfragment på en glasplatta för H & E-färgning för att verifiera att vävnaden är faktiskt en del av tumören.
- Gör detta genom att trycka på en glasobjektsglas på tumörfragmentet och ett lätt tryck med fingrarna för några sekunder.
- Fäst sliden med isopropanol under 2 min följt av ett tvättsteg i vatten. Motfärga vävnaden i 30 sekunder med Mayers hematoxylin.
- Tvätta objektglaset i sex bad vatten. Fläck i Phloxine B 2% för 15 sek.
- Tvätta i ett bad av vatten, följt av fyra bad av isopropanol och avsluta med ett bad av vatten.
- Inkubera i isopropanol under 1 minut och avlopp. Klart i två bad xylen.
- Montera med xylen baserat monteringsmedium. Undersök för tumör cellularitet (Figur 2).
OBS: Huvudsakligen, tumörceller fastnar på präglade slide - den stromal, lymfoid eller annonsipose celler sällan stannar kvar, lämnande utrymmen mellan tumörcellerna (Figur 2).
- Placera vävnaden fragmentet i en liten odlingsskål innehållande en ml av det kemiskt definierade, serumfritt hematopoetisk cellmedium (nedan kallad medium) vid rumstemperatur och tärna den i små bitar (~ 1-2 mm 2) med användning av en steril skalpell.
- Överför allt (vävnadsfragment + medium) till en mekanisk dissociator C röret.
- Skölj petriskål och skalpell med 2 ml medium med hjälp av en pasteurpipett och lägga detta till C röret (volym medium för dissociation = 3 ml).
- Använd den mekaniska dissociator programmet A.01 för C-rör (det mest skonsamma programmet) för att homogenisera de vävnadsfragment till en enda cell suspension. Placera C röret i apparaten och kör programmet två gånger i följd (en cykel = 25 sek).
OBS: Denna homogenisering förfarande har fastställts och godkänts för mänsklig bröstvävnad, andra tumeller eller vävnadstyper kan behöva använda ett annat program och bör testas först. - Avlägsna C röret från anordningen och dekan homogenatet direkt i en 40 | im cellfilter som placeras på en 50 ml tub. Med användning av samma pasteurpipett som i steg 1.6, överföra någon vätska kvar i C-röret till cellen silen.
- Överför den filtrerade vätskan in i ett 15 ml rör med användning av en 1 ml mikropipett spets. Hålla tillfälligt cellen sil och dess 50 ml tub.
- Skölj C rör med ytterligare 3 ml medium och överföra denna, igen med samma pasteurpipett som i steg 1.6, till cell sil fortfarande sitter på 50 ml tub. Pressa en maximal mängd restvätskan instängd i unhomogenized vävnaden i 50 ml tub genom att försiktigt flytta den runt silen med en ren Pasteur pipett eller 1 ml tips som därefter kastas bort för att undvika kontaminering av eluatet.
- Placera cellen silen upp och ned på than ursprungliga C röret och skölj med 3 ml medium, så att unhomogenized vävnaden faller tillbaka in i C-röret.
- Återhomogenisera som i steg 1,7 för två cykler av A.01-programmet.
- Häll denna andra homogenatet genom cell sil sitter på 50 ml tub, skölj C röret igen med 3 ml medium (som i steg 1.10) och överför med pasteurpipett till cellfilter sitter på 50 ml tub igen klämma högst mängd vätska från den kvarvarande bindväv fångade i cellen silen.
- Vid denna punkt, är en volym på ~ 2,5 ml i 15 ml tub och ~ 9 ml i 50 ml tub.
2. Separation av Tissue supernatanten och celler
- Centrifugera homogenaten i 15 ml och 50 ml rör i 15 min vid 600 xg vid rumstemperatur.
- Häll av SN från 15 ml rör in i ett rent rör och tillfälligt lagra vid 4 ° C. Denna supernatant = primärtumör, NANT eller normal tissue SN (slutlig volym 2,5 ml) därefter förtydligats och alikvoteras före lagring vid -80 ° C för framtida analyser (se nedan).
- Kassera supernatanten från 50 ml tub.
- Försiktigt resuspendera båda cellpellets i en slutlig volym av 1 ml medium. Kortfattat, först försiktigt bryta cellpelleten i båda rören (genom att knacka på röret på en hård yta). Resuspendera lös cellpelleten i 50 ml med 500 l av medium och överföra denna cellsuspension till 15 ml rör för att suspendera den andra pelleten. Upprepa detta steg en gång med den andra 500 l medium för maximal återhämtning av celler.
- Överför 10 ul av cellsuspensionen till ett litet rör, blanda med 10 pl av trypanblått (utspädning 1: 1) och räkna antalet livsdugliga celler med användning av en hemocytometer.
OBS: Vid denna punkt en bråkdel av cellsuspensionen kan också analyseras genom flödescytometri för att bedöma cellstorlek, granularitet och om så önskas ett begränsat antal subpopulation markörer för mer Precise bedömning av den relativa cellfördelningen i homogenatet före omfattande analys eller experiment. Alla analyser av flödescytometri införliva CD45 märkning för normalisering av subpopulationer. - Pellets cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid rumstemperatur. Cellerna från tumören, NANT, eller normal vävnad är nu redo för ytterligare rening eller analys. Dessa ytterligare steg är bäst när den utförs på samma dag som operation.
NOTERA: För flödescytometrisk analys men inte cellsortering de återstående röda blodkroppar bör lyseras efter märkning antikropp genom tillsats av 0,4 ml av röda blodkroppar lysbuffert till cellpelleten, omedelbart virvling under 1 sek och inkubering i minst 10 minuter vid rums- temperatur (skyddad från ljus) före analys.
3. Förtydligande av Tissue Supematant
- Centrifugera 1,5 ml rör med vävnads SN vid 15.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Försiktigt bort tHan supernatanten utan att röra eller störa pelleten. Överföring till ett rent rör (eller rör) beroende på antalet och volymen av portioner önskade.
- Förvara supernatanten vid -80 ° C för framtida användning.
4. Patient Blood
- Samla ett blodprov från varje patient som en kontroll genom venpunktion i hepariniserade rör dagen före operation. Centrifugera blodet vid 400 xg under 10 min vid 20 ° C med bromsen av för erhållande av plasma och en buffy coat.
- Avlägsna plasma och förtydliga den genom centrifugering vid 10.000 xg under 15 min vid 20 ° C. Alikvotera och lagra plasma vid -80 ° C för framtida bruk. Späd lättcellskoncentratet i medium
- Separera mononukleära celler genom att använda standard ficoU-hypaque gradientcentrifugering före omedelbar analys, underpopulation isolering, DNA / RNA / protein utvinning eller frysförvaring.
5. Flödescytometri
- Etikettceller enligt tillverkningenr instruktioner vid 4 ° C, skyddat från ljus. Lysera röda blodkroppar i cellsuspensioner från vävnadsfragment efter antikroppsmärkning genom att lägga 0,4 ml cell lysbuffert till cellpelleten.
- Vortex omedelbart i 1 sek och inkubera minst 10 minuter vid rumstemperatur, skyddat från ljus. Passera de märkta cellerna i en flödescytometer för datainsamling utan tvättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enzymatisk klyvning av vävnadsfragment med antingen kommersiellt tillgängliga vävnadsdissociering lösningar eller olika laboratorie blandningar av kollagenas, DNas och / eller hyaluronidas-inhibitorer, klyva en bred variation av receptorer på ytan av celler. Våra studier, till en början fokuserade på CD4 + T-celler infiltrerar brösttumörer, var snabbt presenteras med ett stort tekniskt problem på grund av klyvning av ytan CD4-receptorer med vanlig enzymatisk spjälkning protokoll 4-8. Vi testade en mängd kollagenas enzymer med eller utan DNas och hyaluronidas hämmare, fann att kollagenas I och II bort helt CD4 från cellytan, trots hög lymfocytviabiliteten (Figur 3A). En måttlig effekt på CD4 observerades med kollagenas IV vid korta inkubationstider (1-2 tim) med lägre CD4-antikropp märkning som detekteras i digererad lymfkörtel och tumörvävnad jämfört med osmält blod och benmärg från samma patient (Figur 3B; Observera att på grund av begränsningar i vävnaden vi får vi inte kunde jämföra smält och osmält lymfkörtel och tumörvävnad). Denna förlust av CD4 bekräftades vara en teknisk biprodukt av kollagenas IV matsmältningen genom att jämföra osmälta och smälta CD4 + T-celler som isolerats från frisk givare blod (data visas ej). Medan dessa CD4 lo T-celler kan isoleras från kollagenas IV-digererad vävnadsfragment med hjälp av magnetiska pärlor, de renade populationer innehåller ofta varierande mängder föroreningar av andra celler från tumörmikroomgivningen och därmed var suboptimal för våra experimentella syften.
I ett ständigt sökande efter en bättre metod, under 2008 testade vi en ny mekanisk dissociator utan att använda enzymer. Denna apparat producerade bröstvävnadshomogen snabbt och med ytreceptor integritet upprätthålls 9. Representativa flödescytometri punktdiagrammen för tumörcellen homogen follovinge dissociation och märkning med specifika antikroppar mot epitelceller (EpCAM) och leukocyter (CD45) visas i figur 3C. Dessa bilder är typiska rutin observationer för brösttumörhomogen. Detta protokoll är inte signifikant ändra livskraft CD45 + celler (4% döda celler); Det finns dock en betydande förlust av livskraftiga EpCAM + celler (38% döda celler i tumören visade, varierar mellan tumörer). Trots denna förlust, kan den viabla EpCAM + och CD45 + delmängder vara segregerade på basis av storlek och struktur i stora epitelceller (= tumörceller), små epitelceller och stora CD45 + celler och små CD45 + celler (de flesta celler , vilket är huvudsakligen lymfocyter; figur 3C).
Den betydande ökningen av livskraftiga CD45 + celler erhålls med hjälp av denna metod tillåter förvärv av reproducerbar multicolor flödescytometri uppgifter (med hjälpupp till tio färger) för att mer fullständigt karakterisera TIL delmängder vid bröstcancer. Representativa flödescytometri punktdiagrammen för de större TIL delmängder visas i figur 4, med våra senaste experiment som visar att det även är möjligt att detektera och kvantifiera små T- och B-celler delmängder infiltrerar tumören 10-12, inklusive intracellulär färgning för kanoniska T och B-cellstranskriptionsfaktorer 12. Gating strategier för lymfocyter bygger på livskraftiga CD45 + celler som identifieras med en lönsamhets fläck (obs:. Tumörer kan variera mycket i mängden cellulära skräp och döda epitelceller beroende på BC subtypen, klass, etc.). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att rena lymfocytsubpopulationer från homogenatet med magnetiska pärlor eller cellsortering för genuttrycksanalys använder mikromatriser eller QRT-PCR 9. Lösliga medlare i SN, inklusive cytokiner och immunoglobuliner, har kvantifierats med hjälp av en bead- Immunoassay med erhållna data normaliserades till storleken av vävnadsfragment. En jämförelse av cytokinexpression (en Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17 pool) eller totala immunoglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) i BC SN med SN från normal bröstvävnad avslöjar ökningar i både i samband med tumörvävnad (Figur 5). Dessa primära vävnads SN: s har också ett effektivt sätt analyseras med avseende på antigener 10-12 och används för att experimentellt behandla lymfocyter från friska donatorer och därigenom återge TIL fenotypen i normala celler 9.
Figur 1. Protokoll flödesschema. Vårt förfarande för bearbetning färska mänskliga vävnader och vissa analytiska metoder som sedan kan användas för att bedöma lymfocyter som infiltrerar mänskliga vävnader visas.
Figur 2. H & E färgade bilden av en brösttumörvävnad avtryck. Detta avtryck, tagen från en färsk brösttumörvävnad fragment, visar förekomst av tumörceller med öppna ytor reflekterande områden som inte överfördes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3. Optimering av bröstvävnad dissociation för lymfocytanalysregionen Flödescytometrisk analys av: (A) CD4 ytexpression på lymfocyter från osmält och kollagenas I / II digertumörvävnad; (B) CD4 uttryck på lymfocyter från lymfkörteln och tumörvävnad rötas with Kollagenas IV och jämfört med osmält blod och benmärgsceller från samma patient; och (C) analys av totala leukocyter (CD45 +) och epitelceller (EpCAM +) från tumörvävnad snabbt dissocierades mekaniskt med användning av protokollet som beskrivs här. Den livskraft epitelceller och CD45 + celler genom att använda våra protokoll bedöms via införlivandet av fastställbara livskraft färgämne. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. tumörinfiltrerande lymfocytundergrupper i homogenatet. Multicolor flödescytometrisk analys utfördes på dagen för kirurgi efter mekanisk dissociation användning av det protokoll som beskrivs här. Den livskraftiga celler och stora lymfocytsubpopulationer are visat: CD3 är en pan T-cellmarkör, CD4 och CD8 är stora T-cell delmängd markörer och CD19 är en pan B-cellsmarkör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Lösliga medlare i supernatanten. En panel av cytokiner (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) och immunglobuliner (IgA, IgE, IgG, IgM) bedömdes med hjälp pärla baserade immun att analysera SN härrör från normal och BC vävnader med användning av protokollet beskrivet här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie beskriver en optimerad metod för snabb beredning av normala och maligna bröstvävnadshomogen utan enzymatisk nedbrytning för efterföljande cellsortering, utvinning, frysförvaring och / eller fenotypisk analys av CD45 + subpopulationer. Målet med denna experimentella tillvägagångssätt är att producera bilder av TIL som nära återspeglar deras in vivo tillstånd och jämföra dem med normal vävnad med minimal manipulation av vävnader färska från operationssalen. Hittills har vårt laboratorium använt detta protokoll för att analysera> 250 färska BC vävnader (tumör och Nant),> 35 normala bröst vävnader från bröstreduktioner. I princip bör detta protokoll vara direkt tillämpliga på andra tumör eller vävnadstyper; kan dock viss optimering vara nödvändigt (dvs, den mekaniska dissociation programmet, antal cykler, medievolymen, etc.). För vävnader med låg lymfocytinfiltration, med hjälp av en större vävnadsfragment kan vara necessari, vilket är vad vi gör för normal vävnad där lymfocyter är låg. Alternativt skulle en densitetsgradientcentrifugering steg tillsättas för att berika leukocytsuspension. Denna analys av humana T- och B-cellspopulationer infiltrera brösttumörer omfattar en bedömning av> 100 markörer genom flödescytometri (flödescytometri uppgifter för 74 markörer finns i de kompletterande uppgifter av Gu-Trantien, et al. 9) och rening av specifika lymfocyter subpopulationer för efterföljande immunologiska och molekylära analyser. Vidare har vi utvärderat cytokiner, kemokiner, immunoglobuliner och tumörantigener i den primära tumören SN (jämfört med NANT och normal vävnad SN) 10,11 som en återspegling av dessa molekylära mediatorer i tumören mikromiljö. Vi har också testat effekten av behandling av perifera blodlymfocyter från friska donatorer med tumör SN och visat att många av de genexpressionsförändringar detekteras i TIL kan specifikt reproduceras <sup> 9.
I deras mikromiljö, är tumör och stromaceller mer tätt hölls i vävnadsmatrisen än immuncellerna, som är karakteristiskt vandrande. Den metod som beskrivs här ger ett enkelt och snabbt medel för att isolera och analysera TIL utan enzymatisk spjälkning. Våra många försök att gå med i denna mekaniska homogenisering tillvägagångssätt med en kort enzymatisk spjälkning att producera livskraftiga och receptorpositiv lymfoida och epitelceller från samma tumörfragmentet har varit misslyckade. Vävnads homogenisering släpper effektivt lymfocyter men resulterar i en betydande förlust av tumörcells livskraft. En kort enzymatisk nedbrytning av vävnaden frigör livskraftiga tumörceller (totala antalet ökar som en funktion av koktiden) men har till följd av en parallell minskning i uttrycket av många ytreceptorer, särskilt uppenbara på lymfocyter. Således, för jämförande analys av tumörceller och TIL från samma tumeller är det fortfarande nödvändigt att separat behandla två sekventiella tumörfragment.
För närvarande har de flesta studier konstruerade för att karaktärisera TIL anställd enzymatiska matsmältningen (timmar till O / N) ofta i kombination med någon form av mekanisk dissektion 4-8. Utbyggnad av TIL för vidare analys eller terapi innebär i allmänhet den efterföljande ex vivo odling av TIL eller tumörvävnadsfragment med stimulerande medel (dagar till veckor) 13-15. Den snabba, icke-enzymatisk metod för vävnadsdissociering beskrivs här ger ett enkelt och reproducerbara medel för att extrahera intakt CD45 + celler från normala och onormala vävnadsfragment före deras expansion eller analys. Denna snabba förvärv av CD45 + celler från patienter som genomgår tumorectomy skulle eventuellt kunna utvecklas för att användas i en prognostisk biomarkör analys. Dessutom kan det ge TIL med större potential för expansion ex vivo före adoptivrelationer immunotherapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag fromthe belgiska fond för vetenskaplig forskning (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer i Belgien, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson och Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
- Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
- McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
- Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
- Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
- Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
- Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
- Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
- Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).
