Artigo de método

Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 de novembro de 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um ensaio colorimétrico simples e quantitativo que mede especificamente a atividade proteolítica da Granzyme B (GzmB) humana, de camundongo ou de rato. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para determinar a atividade da protease de outras proteases de serina de grânulos pela hidrólise de outros substratos peptídicos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada.

Resumo

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A serina protease Granzyme B (GzmB) medeia a apoptose da célula-alvo quando liberada por linfócitos T citotóxicos (CTL) ou células natural killer (NK). GzmB é a granzima mais estudada em humanos e camundongos e, portanto, os pesquisadores precisam de ferramentas específicas e confiáveis para estudar sua função e papel na fisiopatologia. Isso requer especialmente ensaios que não reconheçam proteases, como caspases ou outras granzimas, que estão estrutural ou funcionalmente relacionadas. Aqui, aplicamos a preferência de GzmB por clivagem após resíduos de ácido aspártico em um ensaio colorimétrico usando o peptídeo tioéster Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB é a única serina protease de mamíferos capaz de clivar esse substrato. O substrato é clivado com eficiência semelhante por GzmB humano, de camundongo e de rato, uma propriedade não compartilhada por outros substratos peptídicos disponíveis comercialmente, mesmo alguns que são anunciados como adequados para esse fim. Este protocolo é demonstrado usando lisados não fracionados de células NK ativadas ou CTL e também é adequado para proteases recombinantes geradas em uma variedade de sistemas procarióticos e eucarióticos, desde que os controles corretos sejam usados. Este ensaio é um método altamente específico para determinar a potencial atividade pró-apoptótica de moléculas citotóxicas em linfócitos de mamíferos e de suas contrapartes recombinantes expressas por uma variedade de metodologias.

Introdução

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Granzimas são uma família de serina-proteases encontradas nos lisossomas secretoras de células assassinas naturais (NK) e linfócitos T citotóxicos (CTL) 1. Cinco granzimas diferentes existem em seres humanos (A, B, H, K e M), e dez ratos (A - G, K, M e N) 2,3. Granzyme A e B Granzyme (GzmA, GzmB) são os mais abundantes e têm sido amplamente estudados no cenário humano e roedores.

A função clássica de GzmB é a indução de apoptose em células alvo executadas em conjunto com a proteína perforina de formação de poros, o que permite a granzima para aceder ao citosol da célula alvo 4. Embora a expressão GzmB é inequivocamente encontrada em linfócitos citotóxicos, os estudos recentes têm-se debruçado sobre uma variedade de outros tipos de células que expressam GzmB, incluindo mas não se limitando aos queratinócitos 5, 6 basófilos, mastócitos, células dendríticas 7 plasmocitoides 8, 9 e células B, 10.Neste contexto, as funções GzmB não apoptóticas foram revelados desde a participação em processos inflamatórios, remodelação de tecidos e outras propriedades imunomoduladoras 11-14.

Tendo em conta que um papel biológico mais amplo tem sido proposto para GzmB do que se suspeitava anteriormente, os pesquisadores necessitam de ferramentas confiáveis ​​e específicos para a sua detecção. De vantagem é requisito específico da GzmB para clivar no lado carboxilo dos resíduos de ácido aspártico, uma propriedade únicas entre as proteases de serina 15 eucarióticas. Rato, humano e de rato GzmB são estruturalmente muito semelhantes, no entanto, a especificidade do substrato prolongado de rato GzmB subtilmente diferente daquele de ambos humano e de rato 16, o que significa que certos substratos genéricos com Asp no terminal (P1) pode ser clivado eficazmente por GzmB de todas as três espécies, enquanto que outros substratos com sequências mais complicadas montante de P1 pode dar resultados muito variáveis. Tanto no passado e li mais recenteterature, este fato tem causado confusão e má interpretação do significado biológico de alguns achados experimentais considerável, embora cuidadosamente controlados, estudos cinéticos têm procurado corrigir a situação 17.

Neste trabalho procuramos ilustrar esses pontos usando dois substratos disponíveis no mercado, ou seja, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl e N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Os dois reagentes fazer gerar diferentes grupos reativos após a clivagem (a sulfidrila livre versus um paranitroanilida livre fluorescente), mas isso não tem nenhum efeito sobre a clivagem proteolítica. O protocolo descrito é uma adaptação moderna de um protocolo muito velho 18, mas deve ajudar os pesquisadores a utilizar os diferentes substratos GzmB adequadamente, além de fornecer um quadro metodológico para detectar a atividade de outros granzimas, como GzmA e GzmH.

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Protocolo

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NOTA: Os baços foram derivadas de ratinhos (6-10 semanas de idade) e todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as orientações éticas animais de MacCallum Cancer Centre, Peter (E486).

1. Preparação de Amostras.

  1. Preparação das células de rato NK ativadas.
    1. Isolar células NK ingênuas primários de uma única célula suspensões dos baços de C57BL / 6 ou B6.GrzmB - / - (null gene GzmB) ratos por seleção negativa usando kits disponíveis no mercado.
    2. Siga o protocolo dos fabricantes. Resumidamente, magneticamente marcar células NK "não", tais como as células T e B, células dendríticas, granulócitos, macrófagos e células vermelhas do sangue, utilizando anticorpos conjugados com biotina contra os seus marcadores de superfície específicos. Use separação magnética com contas anti-biotina para destruir as células "não-NK".
    3. Cultura isolada células NK durante 5-7 dias em meio contendo IL-2 (1000 U / ml) a 700.000 células / ml em placas de 24 poçosa 37   ° C.
    4. Alternativamente, as células T activadas utilização 19, antígeno-primária de CTL restrito a partir do receptor de células T OT1 ratinhos transgénicos 20, os CTL gerados em culturas de linfócitos mistas, 21 ou sobrenadantes de células NK activadas para determinar a actividade de secretada GzmB 19.
  2. Manutenção da linha de células NK humana e o isolamento de células NK primárias.
    1. Manter leucemia NK humana (células YT) no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. Em alternativa, purificar as células NK primárias a partir do sangue periférico de indivíduos saudáveis ​​e estimular durante 2-3 dias em meio contendo IL-2 a 100 U / ml como previamente descrito 22.
  3. Geração de lisados ​​celulares.
    1. Lave as células três vezes em PBS (pH 7,4), seguida de suspensão em P-40 tampão de lise Nonidet (0,1% de NP-40, NaCl 250 mM, Hepes 25 mM, EDTA 2,5 mM). Idealmente, lisar um mínimo de 5 x 10 6 células NK, ou 1 x 10 7 células T em 100 ul de tampão. Não adicionar inibidores da protease, como muitos são inibidores irreversíveis das proteases de serina, e em particular, tais como triptases GzmA. Incubar em gelo durante 20 min, e em seguida sedimentar os núcleos numa microcentrifugadora a 15.000 xg durante 10 min. Descartar o sedimento nuclear e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  4. Determinar a concentração de proteína dos lisados.
    1. Usar um protocolo disponível comercialmente de escolha, tal como, Bradford ou ácido bicinconínico (BCA) e determinar a concentração de proteína. Certifique-se de que a concentração é de aproximadamente 2 mg / ml mínimo. Armazenar em lisados ​​de -20 ° C até ser necessário (granzima actividade é estável durante vários meses a -20 ° C).

2. A granzima B Ensaio de Actividade

  1. Preparação dos Reagentes
    1. Preparar um estoque 10 mM dos substratos (Boc-AAD-S-Bzl ou Ac-IEPD-pNA) em DMSO (~ 5 mg / ml) e armazenam-se em aliquotas a -20 & #176; C. Prepara-se uma diluição de trabalho acabado e descartar depois de cada dia, como Boc-AAD-S-Bzl hidrolisa parcialmente em armazenamento em DMSO.
    2. Preparar um estoque 250 mM do reagente colorimétrico (5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico), DTNB) em DMSO (0,09 g / ml) e armazenar a -20 ° C. Prepare uma diluição de trabalho de fresco todos os dias. Este reagente é necessária apenas para substratos com grupos de indicadores SBzl, não pNA.
    3. Make up tampão fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) a cada 2-3 semanas.
  2. Traga o DTNB e substratos sintéticos para a temperatura ambiente. Diluir, substratos (1:16, por exemplo, 100 ml em 1,6 ml de tampão) e DTNB (1: 250, por exemplo, 10 jul em 2,5 ml de tampão) e misture bem.
  3. Dilui-se um mínimo de 100 ug de proteína de lisado de cada amostra em tampão para um volume final de 160 ul. Usando uma pipeta multicanal adicionar 50 ul por poço em triplicado (~ 33,3 ng / cavidade) em um '' U '' vinilo inferior placa de 96 poços.Incluir um "tampão-only" controle (também em triplicado).
  4. Adicione 100 ml de diluída DTNB para o controle samples / tampão (omitir esta etapa quando se trabalha com Ac-IEPD-pNA.
    NOTA: A clivagem de Ac-IEPD-pNA por GzmB liberta fluorogénico directamente pNA (Figura 4B).
  5. Usar uma pipeta de canais múltiplos para adicionar rapidamente 50 ul de substrato diluído para cada conjunto de triplicados, começando com o tampão, em seguida, todos os controlos negativos e terminando com amostras positivas esperadas.
  6. Colocar a placa no leitor de placas. Medir a actividade Asp-ase por hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA em um leitor de microplacas a OD 405 nm. Use um protocolo de ensaio cinético, levar 25 leituras, a cada 15 segundos (cerca de 6 min de tempo de leitura total).
  7. Use as leituras de absorvância gerado em cada ponto de tempo para calcular manualmente a taxa de clivagem do substrato caso o software do leitor de placas não podem gerar um valor de Vmax.

3. Análise de Data

NOTA: Os dados gerados são apresentados como a velocidade máxima, definida como a mudança de OD ao longo do tempo (mOD / min).

  1. Para analisar os dados, determinar o valor máximo de clivagem do substrato, o qual é calculado a partir da taxa de variação de absorvância. Faça isso usando automaticamente o software leitor de placas, que normalmente tem essa opção.
  2. Como alternativa, depois de ver as parcelas cinéticos de variação de absorvância, que são gerados durante o ensaio de cinética no leitor de placa, manualmente selecionar os pontos de dados que dão a mais íngreme linha reta. Para a maioria dos ensaios, a taxa máxima é obtida dentro da primeira 2 minutos de ensaio.
  3. Subtraia a leitura OD inicial da maior leitura OD nesta linha reta e dividir pelo intervalo de tempo. Transferência de dados brutos para o Microsoft Excel / Gráfico pad para análise estatística e display gráfico.

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Resultados

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O substrato Boc-AAD-S-Bzl é específico para GzmB

O GzmB protease serina é um dos principais constituintes de linfócitos citotóxicos (CTL e as células NK) e é predominantemente responsável pela indução da morte apoptótica rápida em células alvo, tais como células transformadas ou infectadas com vírus. Isto é, em grande parte devido à sua preferência de substrato para a clivagem após certos resíduos de aspartato específicas em proteínas selecionadas, um atributo compartilhado ...

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Discussão

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Historicamente os granzimas foram identificados como moléculas efectoras principais de linfócitos citotóxicos (CTL e as células NK), capazes de induzir uma rápida morte apoptótica em células alvo. Isto foi devido principalmente à ação de GzmB, que clivada moléculas de substrato-alvo em aspartato (D) os resíduos e, assim, foi capaz de ativar a cascata caspase por ambas clivagem pró-caspases, assim como vários de seus alvos a jusante. No entanto, é agora apreciado que a expressão GzmB não está confinada a células linfóide...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho recebeu apoio através da bolsa HA 6136/1-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) para MH. O JAT é apoiado por Subsídios de Programas e Projetos do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Granzyme B substrato (camundongo e humano)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B substrato (apenas humano)
N-α-CBZ-L-lisina-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A substrato
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H substrato
5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Kit
de isolamento de células NK reagente II mouseMiltenyi Biotec GmbH130-096-892kit de seleção negativa
Kit de isolamento de células NK humanoMiltenyi Biotec GmbH130-092-657kit de seleção negativa
Leitor de placasBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Versão do software MPM6.3
Placa de vinil de 96 poços com fundo em U SeroclusterCorning, MA, EUA2797

Referências

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