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Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

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DOI:

10.3791/52427

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9 de março de 2015

 ,  , 
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Resumo

A fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR) é um membro de formação de canal único da ATP Binding Cassette (ABC) superfamília de transportadores. A atividade do canal fosforilação e nucleotídeos cloreto dependente de CFTR foi freqüentemente estudada em sistemas de células inteiras e como canais de solteiro em pedaços de membrana extirpado. Muitas mutações causadoras de fibrose cística têm sido mostrados para alterar esta actividade. Embora um pequeno número de protocolos de purificação foram publicados, um método de reconstituição rápida, que retém a actividade de canal e de um método adequado para o estudo da actividade do canal de população num sistema purificado têm faltado. Métodos aqui descritos são rápidos para a purificação e a reconstituição funcional da proteína CFTR de comprimento completo em proteolipossomas de composição lipidico definido que retém a actividade como um canal de halogeneto regulamentado. Este método de reconstituição em conjunto com um ensaio baseado em fluxo romance de actividade de canal é um sistema adequado paraestudando as propriedades do canal população do tipo CFTR selvagem e os causadores de doenças mutantes F508del- e G551D-CFTR. Especificamente, o método tem utilidade em estudar os efeitos directos da fosforilação, os nucleótidos e as moléculas pequenas, tais como potenciadores e inibidores sobre a actividade do canal CFTR. Os métodos também são passíveis ao estudo de outros canais de membrana / transportadores para substratos aniónicos.

Introdução

Transporte de cloreto através das membranas apicais das células epiteliais em tais tecidos como o pulmão, intestino, pâncreas e glândulas sudoríparas é mediado principalmente pela fibrose cística condutância transmembrana regulador (CFTR), um ATP e membro regulada por fosforilação do ABC (ATP Binding Cassete) C subfamília de proteínas de membrana (revisto em 1). Tal como outros membros da subfamília ABCC, CFTR é um multi-medindo proteína de membrana grande, integrante que se liga ao ATP dois locais de ligação de nucleótidos formadas na interface dos seus domínios de ligação a nucleótidos (NBDs), onde possui a actividade de ATPase modesta em uma única site. No entanto, ao contrário de outros membros da subfamília ABCC, CFTR evoluiu como um canal Cl regulamentado único e não como um transportador de soluto ativa.

Mutações em causa CFTR a fibrose cística, uma doença que afeta vários órgãos, incluindo os pulmões, o trato gastrintestinal, pâncreas e trato reprodutivo, levando a morbidity e mortalidade em adultos jovens. Doença pulmonar normalmente representa mortalidade precoce em fibrose cística e, na maioria dos casos é causada pela perda de função de CFTR no epitélio superficial das vias aéreas condutoras. A falta de actividade do canal de cloreto CFTR, causa uma redução no ambos Cl - e o movimento da água através do epitélio da superfície de modificar a camada de fluido sobre a superfície apical do epitélio respiratório ciliado. Isso resulta em um líquido viscoso superfície das vias aéreas que prejudica a capacidade das células epiteliais respiratórias ciliadas para efetivamente patógenos limpar das vias aéreas. Como consequência, a maioria dos pacientes com FC sofrem de crises recorrentes de infecção pulmonar e lesão pulmonar devido à inflamação.

Como esperado, os estudos do mecanismo de acção da proteína CFTR normal, focado primariamente em estudos electrofisiológicos detalhados da sua actividade de canal de propagação. Estudos de canal único mostraram diretamente que funções CFTR como PKA-dependente Cl- Canal que possui um portão regulamentado ATP 2. Estudos eletrofisiológicos detalhados fornecem uma grande quantidade de informações sobre os canais CFTR individuais 1,3, no entanto, pode haver preocupação quanto a saber se as características de qualquer canal único especial, que tem sido estudado é o reflexo de toda a população de canais CFTR e, portanto, o único canal resultados devem ser sempre considerados, juntamente com métodos para estudar a população macroscópica. Ensaio direta da atividade do canal população de CFTR purificado tem o potencial de fornecer informações sobre o defeito molecular associado com mutações causadoras de doenças e de conduzir a descoberta de moduladores químicos que reparo proteínas CFTR mutante. Até o momento, existem mais de 1.900 mutações diferentes em CFTR pensados ​​para causar fibrose cística 4. A mutação major, F508del-CFTR, encontrado em pelo menos um alelo em aproximadamente 90% dos pacientes na América do Norte e Europa conduz a uma proteína misfoldingnd retenção no retículo endoplasmático 5. F508del-CFTR também tem outras consequências, incluindo a atividade do canal com defeito 6-9. A ausência resultante de CFTR a partir da superfície da célula está associada a doença grave. G551D-CFTR, uma mutação menos comum, é pensado para ser ainda devidamente dobrada é disfuncional como um canal de cloro na superfície da célula 6. O desenvolvimento de pequenas moléculas e correctores de potenciadores tem o objectivo de corrigir dobragem e / ou o tráfico de mutantes tais como F508del-CFTR à superfície da célula, e de potenciação ou aumentando a actividade do canal de mutações tais como G551D quando presente na superfície da célula, respectivamente . Enquanto os corretores VX-809 e VX-661 (ainda não está aprovado para uso em pacientes, o potenciador Kalydeco (ivacaftor; VX-770) está sendo usado em 150 mg a cada 12 horas em pacientes com FC> 6 anos com pelo menos um G551D -CFTR mutação, e, mais recentemente, para os pacientes com um dos G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco é seguro e resulta em melhoria das medidas clínicas da doença CF 10, no entanto, o mecanismo de ação desta pequena molécula foi mal compreendida no momento da aprovação do FDA para uso em pacientes.

Um punhado de métodos de purificação de CFTR foram descritos anteriormente 2,11-18, muitos dos quais exigem um considerável período de tempo para completar. Numa publicação recente 19, um método único de purificação e rápida reconstituição foi descrito para CFTR superexpresso no sistema de expressão de S f 9 célula, e esta proteína purificada em sistemas lipidicos definidos foi utilizada para desenvolver um ensaio de actividade de canal de halogeneto de CFTR para uma população de CFTR moléculas. O ensaio recapitula os efeitos conhecidos da fosforilação, nucleotídeos e inibidores sobre a função CFTR. O sistema foi utilizado para interrogar os efeitos do potenciador VX-770 / Kalydeco em WT (tipo selvagem), F508del- e G551D-CFTR e foi mostrado para o primeirovez que o fármaco interage directamente com a proteína CFTR para potenciar a sua actividade de canal de uma forma independente de ATP, demonstrando a utilidade e aplicabilidade destes métodos para o estudo da interacção de CFTR e os mutantes com nucleótidos e pequenas moléculas a partir de uma perspectiva de população responder a perguntas clinicamente relevantes sobre a proteína. Os métodos também têm sido utilizados para estudar outras moléculas potenciador e seus derivados 20, bem como os efeitos de uma pequena molécula corrector sobre a actividade da proteína de 21.

Os ensaios de efluxo de ter sido usado em muitos estudos anteriormente para investigar a actividade de mutantes CFTR e os efeitos dos compostos de CFTR-moduladores sobre a sua actividade, incluindo ensaios de células inteiras usando eléctrodos, marcadores radioactivos e fluoróforos 22,23, vesículas de membrana com eléctrodos selectivos de iões 24 e purificado CFTR reconstituído com traçadores radioativos 25. No entanto the utilização de eléctrodos selectivos de iões para estudar CFTR reconstituído purificado foi relatada pela primeira vez recentemente 19. Uma adaptação do método actual tem sido utilizada para a reconstituição e caracterização funcional de duas proteínas de membrana em Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico comum CF. Reconstituição de proteína de membrana purificado Alge exterior juntamente com medidas de efluxo iodeto foram utilizados para apoiar um modelo para a secreção de alginato aniônicos através deste transportador 26. A reconstituição e medições de efluxo de iodeto foram aplicados à proteína purificada Wzx, o que permitiu um modelo a ser proposto que sugere um mecanismo antiporte dependente de H + para o oligossacárido ligado a translocação-lípido através da membrana interna bacteriana por esta proteína de 27. Em ambos os casos foi utilizado o iodeto como um substituto para o substrato aniónico, embora em menor rendimento do que se poderia esperar de um substrato nativo. O método pode ser adequado para adaptação a outras proteínas com ctransporte ou condução ationic caminhos para substratos aniônicos.

Aqui, um processo de purificação rápida é descrito para a proteína CFTR, e sua reconstituição em proteolipossomas de lipidico definido. O procedimento de reconstituição rápida pode ser facilmente adaptado para utilização com CFTR purificado por outros métodos, desde que o tipo de detergente utilizado na purificação é passível de remoção através dos métodos utilizados aqui ou podem ser trocados por um detergente adequado, antes do procedimento de reconstituição. O método de efluxo de iodeto para medição da actividade de canal de purificado e reconstituído proteína CFTR é descrito em pormenor e alguns resultados típicos, que podem ser obtidos com este método são apresentados.

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Protocolo

1. A purificação de CFTR

NOTA: Por favor, consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos para uma lista de equipamentos e materiais utilizados neste protocolo. Existe um protocolo detalhado para a sobre-expressão de CFTR humano WT-e mutantes no S f sistema de expressão de baculovírus 9-17,28. Overexpress CFTR e preparar pellets de S f 9 células de acordo com este protocolo.

  1. Preparação de membrana em bruto
    1. Obter um doce ou uma descongelar S f 9 sedimento de células congelado a partir de uma cultura de 500 ml de células sobre-expressando wildtype-, proteína F508del-, ou G551D-CFTR com um C-terminal His-tag 10, crescidos por métodos padrão de cultura de células, como descrito anteriormente 17,28. Os sedimentos celulares terá um volume de aproximadamente 5 ml e um peso molhado de aproximadamente 5 g.
    2. Ressuspender S f 9 células em 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7,4 com cocktail inibidor de protease (1 comprimido por 50 ml) a 4 ° C, garantindo oamostra aparece visualmente homogêneo e não há aglomerados de células permanecem.
    3. Lyse células usando um disruptor de células de alta pressão (Tabela de Materiais e Equipamentos), atingindo um mínimo de 10.000 psi (de preferência 15.000-20.000 psi) por 2 min por passagem. Manter a amostra a 4 ° C durante a lise.
      1. Recolher a amostra para um tubo em gelo, após o período de lise em seguida, recarregar imediatamente a amostra no disruptor celular. Procedimento de lise Repita 3 vezes. Examinar ao microscópio para garantir menos que 10% permanecem intactos.
        NOTA: outros métodos para lisar as células, tais como contas de vidro, etc, não têm sido rigorosamente examinadas para este sistema, contudo, um utilizador pode encontrar uma alternativa adequada tal método.
    4. Centrifugar o material de lise celular a 4 ° C numa centrífuga de alta velocidade a 2000 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante e dispor do pellet. Divide-se o sobrenadante 20 entre os tubos e centrifugar as amostras durante 1 hora a 4 ° C a 125,000 xg em um tampo de mesa ultracentrifuge.
    5. Remova e descarte do sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e armazenar pelotas nos mesmos tubos a -80 ° C para menos de 2 meses até a sua utilização, ou manter no gelo e continuar com a purificação imediatamente.
  2. CFTR solubilização
    1. Obter 1-4 S f 9 peletes de membrana em bruto frescos ou congelados e ressuspender em cada 1 ml de tampão 1 (2% fos -choline; ver Quadro 1 para a receita completa) a 4 ° C em gelo, utilizando uma agulha de 25 G e 1 ml seringa até que a solução é homogênea por olho, sem aglomerados de membrana celular visíveis. Quando mais de uma pastilha é ser solubilizado, continuar a tratar cada amostra de acordo com as instruções para um único pellet abaixo em paralelo, de junção de amostras no passo 1.3.2.
    2. Dissolve-se um mini-comprimido de inibidor de protease em 1 ml de tampão 2 (imidazol 10 mM; ver Tabela 1), que carece de fos -choline detergente 14 (inibidores da protease são mais 10x concentclassificado do que a sua diluição recomendada neste ponto) e adicionar 100 ul para a pelete de membrana em bruto ressuspenso (inibidores da protease são a sua diluição recomendada neste ponto). Situado no gelo por 45-60 min, com mistura por inversão 5 vezes a cada 5 min.
    3. Centrifugar sedimento ressuspenso membrana em bruto em uma ultracentrífuga tampo da mesa durante 25 minutos a 125.000 xg e 4 ° C. Manter o sobrenadante, que contém CFTR solubilizado e descartar o pellet.
  3. Coluna de ligação, fosforilação e eluição
    1. Lavar 400 ul de níquel-NTA (ácido nitrilotriacético) ou lama de agarose resina equivalente com 1 ml de tampão 2 (imidazol 10 mM; ver Tabela 1), que carece de detergente, para remover o solvente e tampão a 4 ° C. Repita lavagem mais duas vezes.
    2. Combinar CFTR solubilizado, permanecendo inibidor de protease (900 ul) e a resina de níquel (suspensão de 400 ul) para um total de 10 ml com tampão 2 (10 mM de imidazole; ver Tabela 1) which carece de qualquer detergente acrescentou. Os fos -choline 14 concentração eficaz é diluída para 0,2% (w / v) neste passo. Se houver vários tubos, reunir todas as amostras contendo CFTR solubilizado, inibidores da protease, resina de níquel-NTA e 0,2% (w / v) fos -choline-14 neste ponto. Incubar durante 60 min a 4 ° C com agitação suave.
    3. Passa solução NTA-CFTR inibidor da protease-níquel para baixo de uma pequena coluna de triagem (Tabela 1) ou uma coluna vazia equivalente.
    4. Lava-se a resina NTA de níquel, que é retida na coluna, com 4 ml por pelete inicial de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1), que carece de fos -choline mas contém 14 mM de 1 DDM (detergente maltósido de dodecilo), a 4 ° C. A adição de detergente DDM não altera significativamente o pH desta tampão.
    5. Preparar a solução de PKA-MgATP adicionando 25 ul (5 mM, concentração final) de MgATP, 2.500 L de cAMP-dependente da proteína cinase A, da subunidade catalítica (PKA) a 475 ul de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) para a coluna. Fosforilar a proteína por meio de selagem da extremidade de fundo da coluna com um tampão ou Parafilm, e adição de 500 ul de solução de PKA-MgATP para cada pelota inicial utilizado.
    6. Incubar à temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 min com agitação suave e ressuspensão da resina utilizando uma pipeta de 1 ml cada 2 minutos para assegurar que a PKA entrar em contacto com toda a superfície da resina NTA níquel.
    7. Remover o tampão e elui-se a solução de PKA / MgATP a partir da coluna. Lava-se a coluna com 2 ml de tampão 3 (10 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) a 4 ° C.
    8. Multiplicar o número de peletes utilizados no experimento por 4. Lavar a coluna com este número de ml da solução tampão 4 (50 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) a 4 ° C, por adição de 4 ml de tampão à coluna, permitindo ele flua através e imediatamente a adição de 4 ml de aliquota próxima à coluna.
    9. Eluir a proteína passando 1 ml de tampão de 5 (600 mM de imidazole + DDM; ver Tabela 1) a 4 ° C por pelete inicial utilizado através da coluna, 1 ml de cada vez, sem uma pausa para permitir que a coluna para secar, e recolher todo o eluato contendo CFTR purificado num único tubo.
    10. Concentrado de proteína de amostra para remover imidazole e baixo peso molecular, produtos de degradação utilizando um dispositivo de filtro de centrifugação (100.000 de peso molecular cut-off) tal como descrito na Tabela de Materiais e Equipamento ou outro dispositivo semelhante, num total de 10 ml de tampão 6 (75 mM KI + DDM; ver Tabela 1), ou outro tampão de escolha DDM contendo 1 mM (Tampão tais como 7 para experiências de efluxo não-iodeto, 25 mM de HEPES + DDM; ver Tabela 1), por centrifugação a 2.000 x g e 4 ° C durante cerca de 20 min até que a amostra se concentra a 200 ul. Diluir a amostra para 10 ml e repetir o passo de concentração.
      NOTA: Em nossa experiência (não publicado), imidazol significativamente inhios bits a actividade de ATPase de CFTR e deve ser removido neste passo de diluição e concentração, pelo menos, duas vezes, se a amostra irá ser utilizado para medições funcionais.
    11. Recolha concentrado CFTR purificado. Manter a 4 ° C na presença de tampão de DDM até à sua utilização no prazo de 1-2 dias ou continuar imediatamente para a etapa de reconstituição. Não congelar a proteína purificada, como em nossa experiência, observamos atividade reduzida.

2. Reconstituição de CFTR

  1. Preparação Lipid
    NOTA: CFTR foi reconstituída com sucesso em PC de ovo, POPC, 2: 1 (w / w) de PC de ovo: POPC (1: 1 w / w) de uma mistura, ou uma mistura de PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. Para as experiências de efluxo iodados, seco 5 mg de PC de ovo (200 ul de 25 mg / ml, ver Tabela de Materiais e Equipamento) sob uma corrente de árgon gasoso, durante 20 min à temperatura ambiente em um Pyrex ou outro resistente (não-borosilicato ) tubo de vidro.
    2. Usando a absorvância a 280 nm, de um ELISA de umssay ou outro método, o cálculo da concentração da amostra de proteína CFTR purificada. Para as experiências de iodeto de efluxo com o tipo selvagem de CFTR, utilizar uma proteína: lípido de 1: 300-1: 3000 (w / w) para produzir um sinal suficiente. Para G551D- e F508del-CFTR, utilizar uma proteína: lípido de cerca de 1: 200-1: 1200 (w / w) de modo a detectar a actividade de efluxo.
    3. Optimizar a relação proteína: lípido para cada sistema particular. Calcular o volume de proteína purificada necessária. Calcula-se o volume de tampão com 1 mM de DDM necessária para fazer um volume final de 1 ml, ou seja, 1 ml - (volume de solução de proteína necessária) = volume de tampão.
      1. Adicionar o volume calculado do sistema tampão desejado com DDM 1 mM para o lípido seco (mas não adicionar a proteína CFTR no momento) e cobrir o tubo de vidro com Parafilm. Para experiências de efluxo iodeto, ressuspender lipídios no tampão 6 (75 mM KI + DDM, ver Tabela 1). Para outros experimentos ressuspender em tampão 8 (25 mM HEPES + DDM, consulteTabela 1) ou outro buffer interno desejado contendo DDM 1 mM.
      2. Vortex durante 2 minutos à temperatura ambiente para ajudar na suspensão do lípido no tampão de DDM. Alternativamente, a amostra é aquecida a 37 ° C durante 1-2 minutos antes da agitação em vórtice.
    4. Suspender o lípido repetidamente à temperatura ambiente com uma seringa de 1 ml e agulha de 25 G até que nenhum filme lipídico é visível nos lados do tubo. Evitar a injecção de ar para dentro da solução que iria produzir bolhas finas e auxiliar na oxidação de iodeto e lípidos.
    5. Sonicar o lípido suspenso no Parafilm coberto tubo para uma explosão de 20 segundos num banho de ultra-sons contendo gelo, e, em seguida, transferir imediatamente em gelo durante 1 min. Repita 3 vezes.
      NOTA: sonicação Intense transforma soluções de iodeto amarelo devido à oxidação. Portanto evitar excessiva sonicação. Monitorar a amostra para mudanças de cor. Se uma mudança de cor é observado, descartar a amostra e preparar novamente. A mudança de cor devido à oxidação de algunso iodeto resultaria da oxidação dos lípidos nas mesmas condições. Deslocando o ar a partir do tubo com gás árgon antes da sonicação da solução irá ajudar a impedir a oxidação de lípidos e iodeto. Sonicação intenso pode quebrar má qualidade ou tubos de vidro, resultando em perda de riscado da amostra.
    6. Adicionar o volume de CFTR purificado calculado no passo 2.1.3 para a amostra ultra-sons a um lípido atingir um volume final de 1 ml. Misturar a proteína com a solução de lípido e detergente por ressuspensão 10 vezes com uma agulha 25 G e seringa de 1 ml.
    7. Definir lípido e proteína da amostra em gelo durante 30 min com agitação de tubo para misturar 5 vezes a cada 5 min.
  2. Preparação da coluna de ligação detergente
    1. Obter um uso único comercial coluna spin-obrigatório detergente (ver Tabela de Materiais e Equipamentos), com uma capacidade de volume de 1 ml e quebrar a guia inferior para iniciar a coluna fluindo.
    2. Centrifuga-se a coluna durante 2 minutos a 2000 xg para remover o armazenamento buffer, e descartar este buffer.
    3. Adicionar 5 ml de Tampão 7 (Kl 75 mM, ver Tabela 1) para a coluna e depois centrifugar a 200 xg durante 4 min para eluir o tampão de lavagem. Repetir este passo mais 2 vezes para um total de 3 lavagens para remover todos os vestígios do tampão de armazenamento. Descartar tudo flow-through.
      NOTA: É fundamental que o buffer usado para lavar a coluna não conter DDM ou qualquer outro detergente. A coluna tem uma capacidade de ligação finito para o detergente e se um tampão contendo detergente é utilizada, a coluna será ineficaz na remoção de detergente a partir da amostra de proteína-lípido-detergente.
    4. Aliquotar cuidadosamente todos os 1 ml da amostra de lípido-detergente-proteína para o topo da resina da coluna e incuba-se a amostra do topo da coluna durante 2 minutos à temperatura ambiente.
    5. Centrifuga-se a amostra à temperatura ambiente durante 4 min a 2000 xg e recolher a amostra num proteolipossoma turva 1,5 ou 2 ml tubo de microcentrífuga limpo ou um tubo de vidro e coloque o samsoas em gelo.
    6. Recolhe proteolipossomas restantes na coluna por adição de 200 ul de tampão 7 (Kl 75 mM, a Tabela 1), ou outro tampão (sem detergente) para o topo da coluna e repetir o passo de centrifugação durante 2 min.
    7. Adicionar o segundo fluido à amostra proteolipossoma se parece nublado.
    8. Armazenar a amostra a 4 ° C durante a noite ou usar imediatamente para medições de efluxo de iodeto.

3. Medições de Iodeto de efluxo para purificada, CFTR reconstituída

  1. Geração de um gradiente de iodeto através da membrana proteoliposomal
    1. Grânulos pré-inchamento Sephadex G50 em tampão de 9 (75 mM de K-Glu; glutamato de potássio, ver Tabela 1), (cerca de 5 g de pérolas secas em tampão de 50 ml) ou tampão externo desejado, à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou a 4 ° C durante a noite.
    2. Prepare 4 colunas de Sephadex G50 saturados em Tampão 9 (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) ou outrostampão em pequenas colunas de rastreio por carga de resina para pelo menos até ¾ na coluna.
    3. Centrifugar durante 4 min a 2000 xg para remover o excesso de tampão a partir da resina. Não devem ser, aproximadamente, 2,25 mL de resina hidratada embalado na coluna no final do passo de centrifugação.
      NOTA: resina deve ser levemente hidratado mas não imerso em líquido e um breve rodadas não deve eluir volumes significativos de buffer. É fundamental para o sucesso de eluição da amostra proteolipossoma que a resina coluna não é nem muito úmido, nem muito seco e o usuário pode precisar experimentar com as colunas, a fim de familiarizar-se com as condições de maior sucesso de câmbio buffer.
    4. Adiciona-se cuidadosamente 125-150 ul de proteolipossoma amostra ao topo de cada coluna e centrifugar durante 4 minutos a 2000 x g.
    5. Piscina proteolipossoma eluatos juntos para uso imediato em efluxo iodeto ou outras experiências.
      NOTA: O volume de fluido a partir de cada coluna deve ser mais ou menos150 ul da amostra e deve ser um pouco turva, mas menos turva do que a amostra original. Volumes maiores ou eluatos claras sugerem que as colunas não ter sido suficientemente seco, ou foram secos em demasia, respectivamente, e não resultará num experimento de iodeto de efluxo bem sucedida.
  2. Ensaio de efluxo iodeto
    1. Lave um eletrodo micro seletivo iodeto (Tabela de Materiais e Equipamentos) extensivamente com água deionizada, e, em seguida, incubar por 20 min antes do experimento em tampão 10 (15 mM KI, ver Tabela 1). Lave o eletrodo novamente extensivamente com água deionizada.
    2. Adicionar 150 ul de droga (20 uM de concentração típico para produzir uma concentração final de 10 uM no ensaio em tampão 9) (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) ou veículo em tampão 9 para um poço de uma placa de 96 poços com um pequeno bar de pulgas mexa.
      1. Certifique-se que não há bolhas de presentes. Use a ponta da pipeta para remover straybolhas. Se uma solução de um fármaco está a ser utilizado, garantir que a concentração final de DMSO no poço é inferior a 1% (v / v) (tipicamente 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Adicionar 150 ul de proteína CFTR reconstituída que foi produzido na secção 3.1 em tampão 9 (75 mM de K-Glu, ver Tabela 1) para o poço com droga ou de tampão para produzir um volume total de 300 uL no poço da placa.
    4. Colocar a placa de 96 poços numa placa de agitação e agita-se a 130 rpm (ou a uma velocidade moderada de cerca de ¼ da velocidade máxima).
    5. Inserir a ponta do eléctrodo selectivo de iodeto cuidadosamente para dentro do poço, com a amostra de tal modo que a ponta não estiver em contacto com o fundo do poço, ou ser atingido pela barra de agitação. Certifique-se de que o eléctrodo de referência, se separado, está também em contacto com a solução no poço.
    6. Traçados gravar usando um programa de computador caseiro ou comercial que faz a interface com o eletrodo (ver Tabela de Materiais e Equipamentos para detalhes).Uma taxa de amostragem de 2 Hz, com filtragem do sinal através de um filtro passa-baixo.
    7. Deixar a amostra equilibrar durante 5 min para produzir uma linha de base plana e estável plano, ou próximo durante a gravação.
    8. Adiciona-se 3 ul MgATP (100 mM de estoque preparadas em dH 2 O e ajustou-se a pH 7 com KOH; 1 mM de concentração final) para a amostra para activar a proteína. Permitir ~ 5 min para chegar a uma nova linha de base estável. Sempre ajustar o pH do estoque 100 mM e MgATP neutro antes da utilização para evitar alterações no pH do tampão externo.
    9. Adicionar 3 mL de valinomicina estoque (2 uM; 20 nM de concentração final) para a amostra para curto-circuitar alterações na diferença de potencial gerada por iodeto de condutância-selectiva através do CFTR. Grave o declive decrescente (diminuição em mV) devido à actividade iodeto de efluxo mediado por CFTR por pelo menos 5 min.
    10. Para assegurar que o aprisionamento de iodeto no lúmen proteolipossoma foi suficiente, adicionar 3 mL de 10% (v / v) de Triton X-100 para a amostra. Significant e liberação iodeto de imediato indica que o iodeto suficiente foi preso nas vesículas de tal forma que não estava prendendo o fator limitante para as mudanças na inclinação determinados em 3.2.9, mas sim a atividade mediada pelo CFTR.
    11. Lava-se a barra do eléctrodo e agitar cuidadosamente com água desionizada após o tratamento das amostras com drogas ou com Triton X-100 para assegurar que todos os vestígios destes reagentes foram removidos para evitar a contaminação da amostra seguinte.
    12. Prepara-se uma série de concentrações diluídas KI na gama nanomolar a micromolar em tampão 9 (tampão K-Glu, ver Tabela 1). Grave mV a resposta do eléctrodo para cada concentração de 0 a mais alta concentração preparado. Preparar uma curva padrão, onde a resposta da sonda (mV) é representada graficamente contra o logaritmo da concentração molar de iodeto. Utilizar uma curva padrão para converter a resposta mV da sonda durante a experiência de efluxo de concentração de iodeto libertado.
      NOTA: Prepare um cur calibraçãove numa base semanal até que um utilizador tem a certeza de quão rapidamente a resposta das alterações de sonda. Haverá um desvio na resposta e sensibilidade da sonda ao longo do tempo. Como as idades da sonda, a resposta irá degradar. Isto pode ser parcialmente anulada pela alterar as soluções internas periodicamente e extensa lavagem da ponta da sonda em água após a sua utilização, o que limita susceptíveis a adesão de moléculas para a superfície da sonda.
    13. Determinar a inclinação média da linha da concentração vs. tempo para cada amostra proteolipossoma para os últimos 30 segundos antes da adição de MgATP, e após a adição de valinomicina, mas antes da adição de Triton X-100. Subtrair o declive da linha de base a partir do valinomicina para determinar a actividade de iodeto de efluxo mediado por CFTR para aquela amostra.

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Resultados

Descritos nesta publicação escrita são métodos para purificar, reconstituir e medir a atividade do canal regulamentado da proteína CFTR. Figura 1a mostra o fluxo de trabalho para a purificação, a reconstituição e procedimentos de efluxo de iodeto. Os métodos para a reconstituição e por medições de actividade do canal de fluxo iodeto também são mostrados em maior detalhe no vídeo associado.

Purificação e reconstituição do CFTR em proteoliposomes

C...

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Discussão

Houve um número limitado de protocolos de purificação de comprimento completo, o isolamento de CFTR funcional, a partir de uma variedade de sistemas de sobre-expressão celulares. O método descrito aqui é vantajosa, pois permite rápida purificação do WT-CFTR ou altamente enriquecido de F508del- e G551D-CFTR em quantidades moderadas, que é altamente funcional em ensaios, incluindo ATPase e medidas diretas de função de canal, incluindo medições de canal único em bicamada planar sistemas e medidas comprovados da função do c...

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Divulgações

Os autores reconhecem o conselho do Dr. Mohabir Ramjeesingh durante o desenvolvimento dos métodos de purificação descritos aqui. Estes estudos foram apoiados por subvenções de funcionamento a CEB dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) e fibrose cística Canadá (CFC). PDWE foi apoiado em parte pela Irmandade prêmios através do CIHR e CFC. Os autores reconhecem a prestação de corrector, potenciador e compostos inibidores de Dr. R. Pontes (Rosalind Universidade de Medicina e Ciência) e distribuição pelos Fundação de Fibrose Cística Therapeutics (CFFT). Os autores reconhecem também um excelente serviço pela facilidade de cultura celular Baylor (NIH concessão P30 CA125123) em expressar Wt e proteína CFTR mutante usando o sistema de baculovirus. O inativo VX-770 analógico, V-09-1188, foi um presente de Vertex Pharmaceuticals.

Agradecimentos

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
fos-colina 14detergente Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Anatrace Products; CAS#  :77733-28-9
comprimidos de cocktail de inibidores de protease sem EDTA completosRoche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001comprimidos de cocktail de inibidores de protease sem EDTA (1 em 50 ml ou mini: 1 em 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, sem EDTA, EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA AgaroseQaigen GmbH1018240
Fisherbrand Colunas de triagemFisher Healthcare11-387-50
Amicon Ultra Filtros centrífugos, Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
Proteína quinase A dependente de cAMP (PKA), subunidadecatalíticaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce PKA também é adequado
PC, Ovo de galinhaAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS, Brain SuínoAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840032CO CFTR foi reconstituído com sucesso em Egg PC, POPC, 2:1 (p/p) Ovo PC:POPC, ou uma mistura de PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (p/p)
PE, Ovo de GalinhaAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
ErgosterolSigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce Coluna de rotação de remoção de detergenteThermo Scientific87779Colunas de capacidade de 1 ml
valinomicinaSigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770 (ivacaftor)Selleck ChemicalsS1144
microeletrodo seletivo de iodetoLazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[header]
Software Clampex 8.1Axon Instruments (www.axon.com)usamos componentes do sistema ClampX com um filtro caseiro para monitorar e registrar a resposta ao nosso eletrodo
Software Alternativo: Sistema ArrowLabb Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSA Lazar Research vende um medidor que pode interagir com um computador e software para registrar a resposta da sonda.  Este software deve ter uma função semelhante à nossa configuração.
pequenas barras de agitaçãoBig Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMBescolha uma barra de agitação pequena o suficiente para caber facilmente em um poço de uma placa de 96 poços
Sephadex G50, finaGE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
SonicatorLaboratory Supplies Co, Inc.G112SP1GSonicadores de banho de outros fabricantes também devem ser adequados

Referências

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