Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores

Resumo

O registro do potencial de ação muscular composto avalia quantitativamente a inervação funcional do diafragma pelos neurônios motores frênicos. A imuno-histoquímica do diafragma de montagem total avalia a inervação morfológica em junções neuromusculares individuais. O objetivo deste protocolo é demonstrar como essas duas metodologias poderosas podem ser usadas em vários modelos de roedores de doença da medula espinhal.

Resumo

Este protocolo se concentra especificamente em ferramentas para avaliar a inervação do neurônio motor frênico (PhMN) do diafragma nos níveis eletrofisiológico e morfológico. O registro do potencial de ação muscular composto (CMAP) após a estimulação do nervo frênico pode ser usado para avaliar quantitativamente a inervação funcional do diafragma por PhMNs da medula espinhal cervical in vivo em ratos e camundongos anestesiados. Como os CMAPs representam o registro simultâneo de todas as miofibras de todo o hemidiafragma, é útil examinar também os fenótipos de axônios motores individuais e miofibras na JNM do diafragma, a fim de rastrear alterações morfológicas relevantes para a doença e a terapia, como desnervação parcial e completa, germinação regenerativa e reinervação. Isso pode ser feito por meio de imuno-histoquímica total (IHQ) do diafragma, seguida por uma avaliação morfológica detalhada de NMJs individuais em todo o músculo. A combinação de CMAPs e análise NMJ fornece uma abordagem poderosa para estudar quantitativamente a inervação diafragmática em modelos de roedores da doença do SNC e do SNP.

Introdução

Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) é uma doença debilitante neurónio motor associado com a perda de ambos os neurónios motores superiores e inferiores e consequente paralisia muscular. Após o diagnóstico, a sobrevida do paciente é, em média, apenas 2-5 anos ^1. Frênico perda do neurônio motor (PhMN) é um componente crítico da patogénese da ALS. Os pacientes morrem em última análise, devido à perda de PhMN inervação do diafragma, o músculo primário de inspiração ^2,3. Traumática lesão medular (LM) é também um problema grave com dificuldades respiratórias associadas. Aproximadamente 12.000 novos casos de SCI ocorrem cada ano ⁴ devido a d....

Protocolo

Procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de Thomas Jefferson University cuidados com os animais e uso institucional e conduzida em conformidade com a directiva Comunidades Europeias Conselho (2010/63 / UE, 86/609 / CEE e 87-848 / CEE), o Guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, ea Sociedade de Políticas de Neurociência do Uso de Animais em Neuroscience Research.

1. potenciais de ação composto do músculo (MCs)

1. Preparando o animal:
   1. Anestesiar o rato usando um inalante (isoflurano) em 1-2% entregue ao efeito ou por injecção (cetamina, xilazina, acepromazina). Dosagem de anestesia injectável ....

Resultados

Adulto ratos Sprague-Dawley receberam laminectomy somente (controle ileso) ou unilateral hemi-SCI contusão na medula espinhal nível C4 ^10-12. Ao fim de 5 semanas após a cirurgia, o pico de amplitude CMAP gravado a partir do hemi-diafragma ipsilateral ao local da laminectomia / lesão foi significativamente reduzida em ratos SCI (Figura 2C), em comparação com o controlo só de laminectomia (Figura 2B). Todos os NMJs no hemi-diafragma foi completamente intacta no controlo não-doe.......

Discussão

Como a função respiratória é comprometida em ambos traumático SCI e ALS, desenvolver terapias que visem a respiração e, especificamente, a inervação do diafragma são clinicamente relevantes ^5,6. A fim de estudar de forma abrangente função respiratória, deve ser utilizado um método de abordagem combinada. CMAPs medir o grau de inervação funcional do diafragma por meio da estimulação do nervo frênico externo, mas o impulso respiratório bulbospinal não endógeno ^8. Além disso, estas gravações não permi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Paraformaldeído	Fisher	T353-500	Faça a solução a 10% primeiro em água destilada desionizada; faça 4% com 1x PBS, ajuste o pH para 7,4
1x solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	Invitrogen	10010049
2% Albumina de soro bovino (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Dissolva 2 g de BSA em 100 ml de 1x PBS
0,2% Triton X100 em 2% BSA / PBS (tampão de bloqueio)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Dissolver 0,2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0,1 M Glicina	Sigma-Aldrich	G-7126	Adicionar 0,185 g a 25 ml de 2% BSA/PBS
α-bungarotoxina	Invitrogen	T1175	Concentração 1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonais	SMI312	Concentração 1:1.000
SV2	Estudos de Desenvolvimento Banco	de HibridomaSV2-Concentração de Sobrenadante	1:10
FITC cabra anti-rato IgG1	Roche	3117731001	Concentração 1:100
Borracha de silicone	Sylgard, Dow Corning	Parte # 184	Siga as instruções que vêm com o kit: pode usar placa de cultura de vários tamanhos (30 mm, 60 mm, 100 mm) dependendo das necessidades
Meio de montagem fluorescente Vectashield	Vector laboratories	H-1000	Este não é um meio rígido. Você precisará prender a lamínula com esmalte transparente.
Tesoura de mola pequena	Ferramentas de Fine Science	15002-08
Pinça de dissecação	Ferramentas de Fine Science	11295-51
Software para gravações CMAP	Escopo 3.5.6; ADI
Eletrodos de superfície do disco	Natus neurologia	019-409000
Eletrodos de agulha subdérmica	Natus neurologia	019-453100
Gel condutor	Aquasonic	122-73720
Estimulador/sistema de gravação para gravações CMAP Estimulador			ADI Powerlab 8SP
Amplificador para gravações	CMAPBioAMP