3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Resumo

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

Resumo

Desenvolvimento de células T intra-timo requer uma malha tridimensional complexa composta por várias células do estroma, ou seja, células não-T. Timócitos atravessar este andaime em uma ordem temporal e espacial altamente coordenada enquanto sequencialmente passar pontos de verificação obrigatórios, ou seja, T compromisso linhagem de células, seguido de geração repertório receptor de células T e seleção antes da sua exportação para a periferia. Os dois tipos de células residentes principais que formam este andaime são células epiteliais do timo corticais (CTECs) e medular (células mTEC). Uma característica chave de células mTEC é o chamado promíscuo expressão de numerosos antigénios restrita a um tecido. Estes antigénios restrita a um tecido são apresentados para os timócitos imaturos, directa ou indirectamente por células mTEC ou células dendríticas do timo, respectivamente, resultando em auto-tolerância.

Adequados in vitro modelos emulando as vias de desenvolvimento e as funções de CTECs e células mTEC Atualmente lacrei. Esta falta de modelos experimentais adequados, por exemplo, tem dificultado a análise da expressão do gene promíscuo, que ainda está mal compreendida no nível celular e molecular. Nós adaptamos um modelo de co-cultura 3D organotípico à cultura ex vivo células mTEC isoladas. Este modelo foi inicialmente criado para cultivar queratinócitos, de modo a gerar um equivalente de pele in vitro. O modelo 3D preservou as características funcionais do MTEC biologia: (i) a proliferação e diferenciação terminal de CD80 ^lo, Aire-negativo em CD80 ^oi, Aire-positivo células mTEC, (ii) capacidade de resposta a RANKL, e (iii) a expressão sustentada de Foxn1, Aire e genes restrita de tecidos em células mTEC CD80 ^hi.

Introdução

Timócitos desenvolvimento perfazem cerca de 98% do timo, enquanto que os restantes 2% é composto por uma variedade de células que compõem colectivamente o estroma tímico (isto é, células epiteliais, células dendríticas, macrófagos, células B, f ibroblastos, células endoteliais). As células epiteliais cortical exterior (CTECs) adquirir imigração de células pro-T a partir de medula óssea, t indução linhagem celular em células pré-T multipotentes e selecção positivo de auto-MHC restrita timócitos imaturos. As células interiores medulares do timo epiteliais (células mTEC) estão envolvidas na indução de tolerância desses timócitos com um TCR de elevada afinidade para complexos de auto-péptido / CPH por indução ou selecção negativa ou seu desvio para a linhagem de células T reguladora. No contexto da indução de tolerância central, células mTEC são únicos na medida em que expressam uma ampla gama de auto-antigénios restrita a um tecido (TRAs) espelhamento assim a auto periférica. Este fenômeno é chamado de expressão gênica promíscua (PGE)^1,2.

A maioria dos estudos actuais sobre este tipo de célula fascinante dependem ex vivo células isoladas, como vários sistemas de cultura de curto prazo 2D invariavelmente resultou na perda de moléculas de PGE e como regulador chave do MHC de classe II, e Foxn1 Aire dentro dos primeiros 2 dias ^06/03 . Ele permaneceu no entanto claro, que determinados componentes e características da malha 3D intacta do timo estavam faltando em modelos 2D. A cultura de órgão tímico re-agregação (RTOC) tem sido até agora o único sistema 3D, que permite o estudo do desenvolvimento de células T, por um lado, e da biologia celular de estroma, por outro lado, em um micro-ambiente do timo ⁷ intacto. No entanto, RTOCs tem certas limitações, isto é, que já contêm uma mistura complexa de células, requerem a utilização de células estromais fetais e suportar um período de cultura máxima de 5 a 10 dias.

A falta de redutora em sistemas de cultura in vitro tem dificultado o estudo dovários aspectos do desenvolvimento de células T do timo e organogênese não menos importante a regulação molecular da PGE e sua relação com a biologia do desenvolvimento de células mTEC.

Devido à estreita-relação da organização estruturada das células epiteliais da pele e do timo, optamos por um sistema 3D cultura organotípicas (OTC), que tinha sido desenvolvido originalmente para emular a diferenciação de queratinócitos in vitro e, assim, criar um equivalente dérmico. O sistema OTC consiste em uma matriz de andaime inerte coberto com fibroblastos dérmicos que estão presos em um gel de fibrina, na qual os queratinócitos são semeados ^8,9. Aqui, nós substituímos queratinócitos com células mTEC purificados. Mantendo as características básicas deste modelo, nós otimizamos determinados parâmetros.

No modelo adotado OTC células mTEC proliferaram, foram submetidos a diferenciação terminal e mantido identidade MTEC e PGE, assim estreitamente imitando in vivo células mTEC desenvolvimento ^{10. Esta nota técnica proporciona um protocolo detalhado permitindo que o passo a passo set-up de OTCs timo.}

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Regierungspräsidium Karlsruhe. Todos os animais foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos no centro de pesquisa alemão do cancro (DKFZ). Para todas as experiências de cultura de filhotes de rato que variam de 1 a 7 dias de idade foram usados.

1. Isolamento de células mTEC de Thymus

NOTA: As etapas seguintes de digestão foram realizadas conforme descrito anteriormente ¹ sob condições estéreis, com algumas modificações como se segue.

1. Decapitar os filhotes de rato e remover o timo. Coloque a timos em gelo em uma placa de Petri contendo meio RPMI 1640 (contendo FCS a 5%).
2. Corte o thymi em finos, pequenos pedaços e coloque em um tubo de fundo redondo com ~ 5-30 ml de meio RPMI e misture delicadamente usando um ímã para 10 min a RT.
3. Depois disso, decantar o sobrenadante contendo principalmente timócitos e digerir o tecido restante sequencialmente com uma rodada de collagenaSE tipo IV (0,2 mg / ml e 57 U / ml de concentartion final) durante 15 minutos cada, a 37 ° C, seguido de colagenase / dispase (0,2 mg / ml e a concentração final de 1,2 U / ml) durante 25 min cada a 37 ° C em um banho de água com agitação magnética até a timos são completamente digerido. Use 1 ml de enzima por 2-3 thymi.
4. Agita-se o tecido uma vez a cada 7-10 min com uma pipeta de Pasteur. Reunir as fracções de colagenase / dispase e filtrar através de uma gaze 70 mm.
5. Enriqueça as células mTEC por célula magnética triagem (MACS). Realizar a purificação de células mTEC por célula magnética triagem como descrito anteriormente ^11, e mostrado na Figura 1.
   NOTA: Para triagem magnética de células mTEC foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-CD80-PE (16-10A1, use a diluição 1: 100) e anti-EpCAM-bio (G8.8, uso a diluição 1: 100) ^12. Células mTEC imaturos e maduros usando MACS foram definidos como: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- e CD45 ^- CD80 ⁺ respectivEly.
6. Após purificação MACS (pureza de células mTEC imaturos = 83,1 ± 6,3% e células mTEC maduros = 79,23 ± 3,42%), semear as células mTEC para as culturas organotípicas conforme descrito abaixo (Seção 2.3).
7. Alternativamente, células mTEC ordenar por FACS (utilizando 100 bocal mm) após a depleção de CD45 MACS utilizando os seguintes anticorpos: anti-CD45-PerCP (30-F11, em utilização diluição 1: 100), anti-FITC-Ly51 (6C3, usar a 1 : 100 de diluição), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, a utilização de 1: 500 de diluição) e utilização de anti-CD80-PE (16-10A1, a diluição 1: 100). Excluir células mortas, utilizando iodeto de propídio (1: 5000) (Dia 4). Células mTEC imaturos e maduros usando FACS foram definidos como: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- e PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, respectivamente.

2. organot�icas 3D Co-culturas (OTCs)

NOTA: As construções em 3D-dérmica para o cultivo de organotípico keratinocytes foram preparados como descrito anteriormente ^9,13. Em todos os passos células foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO _2. Os OTC utilizando células mTEC foram preparadas com pequenas modificações como se segue.

1. Preparação de fibroblastos humanos
   NOTA: Os fibroblastos dérmicos humanos foram obtidos a partir de culturas de explantes de derme epidermised-de ^9, como descrito anteriormente.
   1. Em breve, cortar tiras de pele humana (aproximadamente 5 cm de comprimento) e trata-se com termolisina (0,5 mg / ml em solução salina com 10 mM de Hepes pH 7,4) O / N a 4 ° C.
   2. Em seguida, separar a epiderme da derme utilizando pinças.
   3. Finamente cortada a derme em pedaços pequenos, coloque em uma placa de 10 centímetros de Petri e deixar secar durante 1-2 horas sob um fluxo de ar estéril. Suplemento os explantes regularmente com DMEM contendo 20% de FBS.
   4. Divida os fibroblastos em crescimento fora quando confluentes (geralmente em torno de 3 semanas), utilizando 0,1% de tripsina certificando-se que os explantes continuar a aderir à placa para obter mais conrounds consecutivos de crescimento.
   5. Expandir os fibroblastos a partir de explantes para os mesmos até 3 vezes em DMEM com FBS a 10% e crio-conservação ^14. Utilizar o mesmo lote de fibroblastos para cada série experimental.
      NOTA: Os fibroblastos não foram irradiadas para o set-up dos equivalentes dérmicos.
2. Preparação do andaime
   1. Corte as 0,4-0,6 mm de espessura de viscose, material fibroso não tecido (detalhes do produto no apoio folha de excel) em círculos bem demarcadas usando uma afiada 11 mm de diâmetro de metal perfurador para caber exatamente em 12 inserções bem-filtro. Em seguida, coloque-o na 12- elemento filtrante bem (poliéster poros da membrana capilar, 3 mm de tamanho de poro) como um andaime. Coloque a configuração completa em um filtro estéril de 12 poços.
   2. Prepara-se o gel de fibrina utilizando uma cola de fibrina kit para a cirurgia que consiste de uma combinação de f ibrinogénio e trombina. Pré-diluir a fibrinogen-, bem como o componente de trombina do kit para 8 mg / ml e 10unidades / ml, respectivamente. Para um único poço de uma placa de 12 poços proceder da seguinte forma.
      1. Dilui-se 100 ul de fibrinogénio (8 mg / ml) com 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS) sem Ca ^₂₊ e Mg ^_2+, pH 7,0. Dilui-se 100 ul de trombina (10 unidades / ml) com 100 ul de FCS contendo 270.000 fibroblastos.
      2. Dispensar 200 ul de trombina a fibroblastos de células contendo-o para misturar andaime, a qual Adicionar 200 ul de fibrinogénio (mistura 1: 1), resultando numa concentração final de fibrinogénio de 2 mg / ml de trombina e de 2,5 unidades / ml. Misturar bem e distribua uniformemente sobre toda a área do andaime por pipetagem suave (Dia 1).
         NOTA: Depois de 30 min a 37 ° C de um coágulo que encerra os fibroblastos se ter formado, enchendo completamente os espaços internos do andaime e formar uma superfície superior lisa.
3. Co-cultura com células mTEC
   1. Para pré-cultura, mergulhe as culturas de órgãos emDMEM com FBS a 10%, 50 ug / ml de ácido L-ascórbico e de 1 ng / ml de TGF-β1 com uma mudança de meio todos os outros dias durante 4-5 dias.
   2. No dia da sementeira MTEC, substituir o meio por meio RFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) com 10% de FBS, 10 ^-10 M a toxina da cólera, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 50 ng / ml de ácido L-ascórbico, ligando RANK (0,1 ug / ml) e 500 unidades / ml de aprotinina, evitando assim a fibrinólise precoce por serina-proteases secretadas pelos fibroblastos.
   3. 7-8 horas mais tarde, as set-up co-culturas, semeando 250.000 células mTEC (quer células mTEC completos, ou CD80 ^lo e subconjuntos CD80 ^hi), num volume de 100 ul por poço em cima do andaime de fibroblastos. Contar as células usando uma câmara de Neubauer (dia 4).
      NOTA: Em todas as vezes as culturas organotípicas 3D timo estão submersos em meio ao contrário OTCs pele que são levantadas ao ar.
   4. Após 24 horas de incubação, fornecer as culturas com meio (câmbio médio total) como mencionado acima (passo 2.3.2) agora containing reduziram quantidades de aprotinina, 250 unidades / ml (dia 5).
   5. A fim de avaliar a actividade proliferativa de células mTEC, adicionar EdU (6,7 uM / ml, ou seja, 10 pM / poço) para OTC durante 4 horas antes da terminação das culturas. Realizar a coloração de OTC crio-secções, como descrito no kit de EdU de imagem conjugados com co-coloração de queratina 14. Determinar os índices proliferativas de células mTEC, tanto por contagem de células K14 ⁺ edu ⁺ de duas secções de cada espécime de cultura ou por fluxo citometria (EdU citometria de fluxo, Secção 1.7, mas em vez de utilizar Ly51-FITC CDR1 ^PB-15 a uma diluição de 1: 100 e 2.3.6.4).
   6. Na sequência de 4-7 dias de co-cultura, encerrar os OTCs e processo para isolamento do RNA, crio-seccionamento ou análise FACS (dia 11/08).
      1. Terminar as culturas usando uma pinça, que separa o andaime / equivalente dérmico do filtro do poço de inserção.
      2. Para crio-seccionamento, incorporar toda a OTC em composto outubro e congelar na livapor de nitrogênio quid antes de crio-seccionamento. Prepare 5-7 uM secções espessas OTC utilizando um criostato e armazenar a -20 ° C até à sua utilização. Para imuno-histoquímica de OTC crio-seccionado usar anti-queratina 14 (AF64, a utilização de 1: 1000 de diluição), e anti-vimentina (gp53, utilização em diluição 1: 100) de anticorpos. Realizar a coloração imuno-histoquímica indireta usando anticorpos secundários respectivos.
      3. Para o isolamento do RNA, adicionar 1 ml de solução (contendo fenol e tiocianato de guanidina) em uma tampa de rosca de um 2 ml RNase livre tubo de desnaturação. Cortar toda a OTC em pedaços com um bisturi e adicionar para dentro do tubo contendo solução de desnaturação. Mecanicamente triturar os OTC com instrumento FastPrep duas vezes durante 30 segundos a uma velocidade de 6,0, em colocar entre em gelo durante 2 minutos (a amostra pode ser armazenada a -80 ° C após este ponto). Se congeladas a -80 ° C, descongelar em gelo. Centrifugar os tubos a 11,500-13,000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco, incubar durante 5 min à temperatura ambiente e fprotocolos de isolamento de ARN Realize as utilizando ácido extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, tal como descrito pelo fabricante.
      4. Para a análise FACS, remover o andaime e separar a membrana da fibrina / fibroblastos / gel MTEC. Finamente cortada do gel com um bisturi e digeri-la num tubo de FACS durante ~ 20 min, ou até estarem completamente digeridas com 2 ml de colagenase / dispase a 37 ° C num banho de água com agitação magnética. Agita-se a solução de enzima com uma pipeta de Pasteur, uma vez a cada 5 minutos. Após a digestão completa, filtra-se a suspensão de células através de um filtro de 70 um; manchar a suspensão de célula única usando os anticorpos, tal como descrito em 1.7 e análise por citometria de fluxo.

Resultados

Adotamos um modelo 3D organotípico co-cultura (3D OTC) que tinha sido originalmente desenvolvido para o cultivo in vitro de longa duração dos queratinócitos ^9. Células mTEC MACS enriquecidos (ver esquema de enriquecimento MACS Figura 1) foram semeadas em um andaime que compreende de um gel de fibrina e fibroblastos aprisionadas. Os fibroblastos proporcionar a matriz extracelular essencial (ECM) que suporta células mTEC in vitro. Células mTEC foram cultivadas em OTCs...

Discussão

Ao lado RTOCs, o OTCs 3D têm sido, de longe, superior em termos de diferenciação do TCE e PGE manutenção / indução (Tabela 1) em comparação com outros (i) 'culturas 3D simplificadas' usando - fibroblastos sozinho, sem o cadafalso; (Ii) sistemas 2D utilizando - células fibroblastos / alimentador de co-cultivadas com TEC ^10, (iii) células 3T3-J2 em que os clones TEC desenvolver, mas é perdida PGE, (iv) Matrigel ou (v) de componentes da matriz extracelular (dados não publicados). PGE foi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos C57BL/6 prenhes	Charles River WIGA
LS colunas	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS colunas	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microesferas, rato	Miltenyi Biotec	130-052-301
Microesferas Anti-PE	Miltenyi Biotec	130-048-801
Microesferas de estreptavidina	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 e -biotina)	Ref. 12
CD80-PE anticorpo	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC anticorpo	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific	Blue Ref. 15
Queratina 14 anticorpo	Covance	PRB-155P
Vimentin anticorpo	Progen	GP58
Cy3-conjugado AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugado AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-cobaia IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra, Sondas moleculares conjugadas Alexa Fluor 488	(Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagem	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de ensaio de citometria de fluxo	Invitrogen	C10425
Inserções de filtro de 12 poços (thincerts)	Greiner bio-one
Placa de 12 poços	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Itália
Fibrinogênio TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Trombina TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinina (Trasylol)	Bayer	4032037
Toxina da cólera	Biomol	G117
Hidrocortisona	Seromed (Biochrom)	K3520
Ácido L-ascórbico	Sigma	A4034
TGF-ß 1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R& D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Composto	TissueTek	4583
Trizol (aka. Solução desnaturante - Extração ácida de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Tipo IV	CellSystems	LS004189	0,2 mg / ml e 57U / ml conc final.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0,2 mg / ml e 1,2U / ml conc final.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µ g/ml de concentração final.

657631