Abstract
El hígado tiene una gran capacidad de regeneración. Los hepatocitos, las células parenquimatosas del hígado, se puede regenerar en una de dos maneras: la regeneración del hígado hepatocyte- o biliar impulsada. En la regeneración de los hepatocitos del hígado impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de hepatocitos preexistentes, mientras que, en la regeneración biliar impulsada, los hepatocitos en regeneración se derivan de las células epiteliales biliares (BEC). Para la regeneración del hígado hepatocitos impulsada, hay excelentes modelos de roedores que han contribuido de manera significativa a la comprensión actual de la regeneración del hígado. Sin embargo, no existe tal modelo de roedores para la regeneración hepática biliar impulsada. Recientemente hemos informado en un modelo de lesión hepática pez cebra en el que las BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en caso de pérdida de hepatocitos grave. En este modelo, los hepatocitos se ablación específicamente por un medio de farmacogenéticos. Aquí presentamos en detalle los métodos para la ablación de los hepatocitos y analizar el proceso de regeneración del hígado impulsado por la BEC.Este modelo de ablación específico de hepatocitos se puede utilizar más para descubrir los mecanismos moleculares y celulares subyacentes de la regeneración hepática biliar impulsada. Además, estos métodos pueden ser aplicados a las pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que aumentan o inhiben la regeneración del hígado.
Introduction
El hígado es un órgano altamente regenerativa. Durante la regeneración del hígado, la regeneración de los hepatocitos, las células del parénquima del hígado, se derivan de los hepatocitos preexistentes (regeneración hepática hepatocitos impulsada) o BEC (regeneración hepática biliar impulsada) 1,2. La lesión hepática por lo general provoca la proliferación de los hepatocitos preexistentes; sin embargo, cuando se ve comprometida la proliferación de hepatocitos, las BEC puede contribuir a los hepatocitos 2-4. Estos dos modos de regeneración del hígado son clínicamente significativos. Tras la eliminación quirúrgica de una porción del hígado humano (por ejemplo, a causa de tumores en el hígado o donantes de hígado vivos), los hepatocitos en el hígado restante proliferan para recuperar la masa hepática perdido. Por el contrario, en pacientes con enfermedades hepáticas graves, la proliferación de hepatocitos se ve comprometida en gran medida, de modo que las BEC o células progenitoras del hígado (LPC) parecen contribuir a la regeneración de los hepatocitos 5,6. El modelo de roedor 2/3 hepatectomía parcial, en la quehepatocitos proliferan para recuperar la masa hepática perdido, ha contribuido de manera significativa a la comprensión actual de hepatocitos impulsada por la regeneración del hígado 7,8. Sin embargo, no existe un modelo de roedores válida en la que los hepatocitos en regeneración se derivan principalmente de las BEC. Aunque varios modelos de roedores de la toxina del hígado condujeron a la identificación de biliar impulsada por la regeneración del hígado 2-4, los estudios de linaje rastreo recientes en ratones indican una contribución mínima de las BEC a la regeneración de los hepatocitos en estos modelos 9,10. Algunos de los modelos de lesión del hígado de roedores, incluyendo la hepatectomía parcial 11-13 y daño hepático inducido por acetaminofeno-14,15, se han aplicado a pez cebra y llevado a la identificación de nuevos genes o vías implicadas en la regeneración del hígado. Sin embargo, impulsado hepatocitos, pero no conducido-BEC, la regeneración del hígado se produce en estos modelos de lesión de hígado de pez cebra. Por lo tanto, un modelo de lesión hepática novela en la que BEC contribuyen ampliamente a regenerating hepatocitos es necesario para una mejor comprensión de la regeneración del hígado impulsado por la BEC.
Los objetivos generales del modelo de ablación hepatocitos describen aquí son (1) para generar un modelo de lesión hepática en la que BEC contribuyen ampliamente a los hepatocitos en regeneración, y (2) a dilucidar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración del hígado impulsado por la BEC. La hipótesis de que la gravedad de la lesión determina el modo de regeneración del hígado; por lo tanto, predijo que la regeneración hepática biliar impulsada iniciaría tras la lesión del hepatocito severo. Para probar esta hipótesis, hemos desarrollado un modelo de lesión hepática pez cebra mediante la generación de una línea transgénica, Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931, que expresa altamente nitrorreductasa bacteriana (NTR) fusionada con la proteína fluorescente cian (PPC) en el marco del fabp10a específico de hepatocitos promotor. Desde NTR convierte el profármaco no tóxico, metronidazol (Mtz), en un fármaco citotóxico, se extirpa sólo el destinado NTR-las células que expresan 16-18, en este caso, los hepatocitos. Mediante la manipulación de la duración del tratamiento Mtz, la extensión de la ablación de los hepatocitos puede ser controlada. El uso de este modelo, se informó recientemente que en caso de pérdida de hepatocitos grave, BEC ampliamente dan lugar a hepatocitos en regeneración 19, lo que fue confirmado por otros dos estudios independientes 20,21. Por lo tanto, en comparación con el roedor antes mencionado y modelos de lesión de hígado de pez cebra, nuestro modelo de ablación de hepatocitos es más ventajoso para el estudio de la regeneración del hígado impulsado por la BEC.
Este protocolo se describe el procedimiento para llevar a cabo experimentos de regeneración hepática mediante el modelo de ablación hepatocitos pez cebra. Este modelo será apropiado para determinar los mecanismos subyacentes a la regeneración hepática biliar impulsada y para pantallas químicos para identificar pequeñas moléculas que pueden reprimir o aumentar la regeneración del hígado.
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Protocol
El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con el procedimiento estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Preparación de embriones / larvas
- Para llevar a cabo apareamientos cronometrados, creado varón adulto y hembra Tg (fabp10a: PPC-NTR) S931 peces hemizygous o homocigotos S / N y colocar un divisor entre ellos. Eliminar este divisor a la mañana siguiente cuando se desea apareamiento. Recoger los embriones por el esfuerzo del agua usando un colador de malla fina de plástico.
- Gire el filtro al revés y enjuagar la superficie de malla con una fina corriente de agua de huevo dispensado desde un frasco. Transferir 100 embriones en un 100 mm placa de Petri con 25 ml de agua huevo. Mantenga no más de 100 embriones por placa de Petri y criarlos a 28 ° C.
- Para inhibir la pigmentación, añada feniltiourea (PTU) en las placas de Petri antes de 10 horas después de la fecundación (HPF), y elevar embryos / larvas hasta 80 HPF. La concentración final de PTU es 0,2 mM. PRECAUCIÓN: La PTU es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas.
- Anestesiar las larvas mediante la adición de 3-amino éster etílico del ácido benzoico (tricaína), a una concentración final de 0,016%, en las placas de Petri. Luego, utilizando un microscopio de epifluorescencia, larvas de tipo PPC-positivo. Utilice las larvas con un tamaño de hígado similar y descartar aquellos con un hígado más pequeño o más grande.
NOTA: cualquier larvas CFP-positiva, independientemente de la intensidad, se puede utilizar porque no hay diferencia en la extensión de la ablación de hepatocitos entre las larvas hemicigotos y homocigotos. PRECAUCIÓN: tricaína es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas. - Eliminar el agua de huevo contiene tricaína y añadir agua huevo suplementado con 0,2 mM PTU. Mantenga el embriones / larvas a 28 ° C.
2. Tratamiento Mtz
- Preparar fresca solución mM Mtz 10 disolviendo 0,171 g de polvo Mtz en 1Agua de huevo 00 ml complementado con 0,2% mM PTU DMSO y 0,2. Para disolver completamente el Mtz, mezclar la solución a TA con agitación rápida durante 20-30 minutos. Para ayudar a solubilizar Mtz y para mejorar Mtz permeabilidad en las larvas, añada DMSO al preparar Mtz. PRECAUCIÓN: La exposición prolongada o aumento de la concentración de Mtz es tóxico. Use de acuerdo con las directrices de manejo apropiadas.
- Separar las larvas en los grupos de control y experimentales mediante la transferencia de número deseado de larvas en dos diferentes 100 mm plato de Petri o placa de múltiples pocillos. Para el grupo experimental, mantener las larvas en 10 mM solución Mtz; para el grupo control, mantenerlos en agua huevo que contiene 0,2% de DMSO.
- Cubrir las placas o platos de petri que contiene la solución Mtz con papel de aluminio para evitar la foto-inactivación de Mtz, y se incuba a 28 ° C. La duración del tratamiento Mtz depende de la etapa larval y la línea transgénica.
- Observar la ablación hepatocitos severa similar en el
3. Análisis de la impulsada por biliar regeneración hepática
- Al final del periodo de ablación, eliminar la solución Mtz de las placas. Lavar las larvas tratadas-Mtz mediante la adición de 25 ml de agua huevo. Agitar la placa de 2-3 veces para lavar las larvas antes de desechar el agua de huevo. Repetir tres veces y luego sumergir las larvas una vez más en agua de huevo. Para evitar edema corazón y la muerte de las larvas en las larvas tratadas-Mtz, añadir una menor concentración de tricaína, a una concentración final de 0,008%, para inmovilizar las larvas.
- Para el análisis de hígado, examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas con Mtz bajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro de la PPC. Evaluar los niveles de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado: grande (no ablación; 0-10% larvas), medio (parcialmente ablación; 10-20%), y muy pequeña (totalmente ablación; 80-90%).
- Retire las larvas con hígados no ablación parcial o ablación. Sólo mantener las larvas con una pequeña hígado, que es indicativa de la ablación de hepatocitos grave. Para el análisis de hígado en la regeneración 0 punto temporal hr (R0h), la cosecha de las larvas después de Mtz lavado y PPC clasificación. De lo contrario, mantenga las larvas ordenados en agua huevo suplementado con 0,2 mM PTU hasta el momento de la cosecha.
- Traslado larvas recolectadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y reemplazar el agua de huevo con la solución de fijación de 3% de formaldehído en tampón PEM. Incubar el tubo en un rotador O / N a 4 ° C.
- Reemplazar la solución de fijación con 1 ml de PBSDT y girar el tubo que contiene las larvas en el rotador durante 5 min.
- Transfiera las larvas fijo en una placa de Petri de 100 mm que contiene PBSDT y el uso de fórceps, quitar manualmente yema y aletas pectorales bajo un microscopio de disección. Traslado hasta TP 20 larvas diseccionado en un tubo de 1,5 ml. <li> Sustituir solución PBSDT con 1 ml de solución de bloqueo y el rock el tubo en un rotador a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Reemplazar solución de bloqueo con 100 l de solución de bloqueo que contiene anticuerpos primarios. Poco a poco el rock el tubo en un rotador O / N a 4 ° C.
- Retirar la solución de anticuerpo primario y lavar con PBSDT 5 veces durante 10 min cada vez. A continuación, añadir 100 ul de solución de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios y el rock en un rotador a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Lavar 5 veces con PBSDT de 10 min cada vez a RT oscilando en un rotador.
- Orientar las larvas lateralmente sobre un portaobjetos de microscopio y añadir una gota de medio de montaje. Cubrir con cuidado con una cubierta de vidrio y sellar la cubierta de vidrio con un pulidor de uñas. Ahora, está listo para la microscopía confocal.
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Representative Results
Tratamiento Mtz para 36 hr (A36h, A significa ablación) 3,5 a 5 dpf reducido drásticamente el tamaño del hígado (Figura 1B). Después Mtz lavado, considerado como el comienzo de la regeneración del hígado (R), fuerte fabp10a: PPC-NTR y fabp10a: Expresión dsRed reapareció dentro de 30 horas (Figura 1B). La red biliar intrahepático, como se evaluó por la expresión de Alcam que está presente en la membrana de las BEC 22, colapsado inicialmente pero fue restablecida en 54 hr post-lavado (R54h) (Figura 1C). Estos datos indican que la regeneración del hígado y la recuperación se producen rápidamente en nuestro modelo de lesión hepática.
La Figura 2 muestra que los hepatocitos en regeneración se derivan de las BEC. La Tg (Tp1: H2B-mCherry) línea s939 expresa una proteína fluorescente de color rojo nuclear bajo el control de un elemento que contiene 12 RBP-Jĸ sitios de unión 23. Esta respo Notchelemento nsive aparece para conducir la expresión génica exclusivamente en las BEC en el hígado 24; Sin embargo, es posible que dirige la expresión génica en LPC porque la señalización de Notch está estrechamente relacionado con los LPC 25. Por lo tanto, esta línea transgénica permite la fácil detección de BEC, y probablemente LPC, núcleos. Por otra parte, la estabilidad extendida del H2B-mCherry permisos de proteína de fusión a corto plazo trazado linaje. Mayoría de las células H2B-mCherry + en el hígado en regeneración R0h expresaron Hnf4α (Figura 2A), que se expresa en hepatocitos, pero no en las BEC, en el hígado control. Hepatocitos, según la evaluación de fabp10a: Expresión PPC-NTR, en R48h aún conservaban Tp1: Expresión H2B-mCherry (Figura 2 B, flechas). Estos datos indican la conversión BEC de hepatocitos sobre la pérdida severa de hepatocitos, que fue confirmado por el linaje de rastreo permanente 19.
Figura 1. Un modelo de lesión hepática pez cebra. (A) Esquema que ilustra los períodos de tratamiento Mtz y la regeneración del hígado. (B) 36 horas de tratamiento Mtz reducen considerablemente el tamaño del hígado y fabp10a: PPC y fabp10a: dsRed fluorescencia a R0h; Sin embargo, la fuerte PPC y dsRed fluorescencia reaparecieron en R30h. Las flechas apuntan hacia el hígado (li). puntos de vista (C) Confocal de proyección de todo el hígado inmunotinción con anticuerpos anti-Alcam que etiquetan las BEC. La red biliar intrahepática se derrumbó en R0h pero rápidamente restablecerse en R54h. Regiones de puntos describen el hígado. Las barras de escala:. 100 (B), 20 (C) micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. BEC dan lugar a hepatocitos sobre la pérdida severa de hepatocitos (A) Confocal vistas proyección del hígado que muestran Hnf4α (verde) y Tp1:.-MCherry H2B (rojo) expresión en R0h. (B) sección de imágenes de una sola óptica confocal muestran fabp10a: PPC-NTR (gris) y Tp1:-mCherry H2B (rojo) expresión en el hígado. expresión mCherry fue revelado por anti-mCherry inmunotinción. Tenga en cuenta la débil expresión mCherry en los núcleos de la PPC + hepatocitos (flechas). Células mCherry + Strong son BEC. Las barras de escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Severa, pero no leve, la ablación de hepatocitos provoca la regeneración hepática biliar impulsada. Por lo tanto, después del tratamiento Mtz y de lavado, es importante para examinar el tamaño del hígado de las larvas tratadas-Mtz, que puede ser evaluada por fluorescencia intrínseca de la PPC fabp10a: CFP-NTR transgén. Desde un pequeño porcentaje de las larvas tratadas-Mtz mostrará no separada por ablación (0-5%) o parcialmente ablación (10-20%) hígados, es esencial para ordenar y sólo analizar las larvas con un muy pequeño hígado, que es indicativo de la ablación de hepatocitos grave.
Aunque en nuestro protocolo, se trataron larvas de pez cebra con Mtz 3,5-5 dpf (un período de tratamiento de 36 h), las etapas y la duración del tratamiento Mtz alternativos también son posibles. Por ejemplo, las larvas tratadas de 5 a 6 dpf (un período de tratamiento de 24 hr) ablación de hepatocitos grave también exhibido, similar a la del período de tratamiento 36 hr antes mencionado. Dos grupos adicionales generados independientementefabp10a similar: líneas transgénicas NTR y también informaron sobre el proceso de regeneración hepática biliar impulsada después de la ablación específico de hepatocitos. Mientras que un grupo tratado con larvas Mtz 6-7 dpf 21, otro lo hicieron 3,5 a 4,5 dpf, llegando a conclusiones similares 20. Dado que cada fabp10a: línea transgénica NTR puede exhibir un nivel diferente de expresión de NTR, la duración y la dosis del tratamiento Mtz deben determinarse por separado para cada uno de la línea transgénica utilizada. También puede resultar útil para generar una línea transgénica con una versión mejorada del gen NTR, en el que la introducción de tres mutaciones puntuales conduce a un aumento de su actividad enzimática 26. Este mutante NTR resultará en un evento de ablación más rápido que el de tipo salvaje NTR 26. Esto es especialmente ventajoso cuando de tipo salvaje cinética NTR pueden limitar la posibilidad de ablación celular completa en una etapa deseada.
Desde cientos de larvaspuede someterse simultáneamente la ablación de hepatocitos, este modelo de lesión de hígado de pez cebra se puede aplicar a las pantallas químicos para identificar moléculas pequeñas que pueden suprimir o aumentar la regeneración hepática biliar impulsada. Por ejemplo, el uso de este modelo, el grupo Shin en Georgia Tech realizó una pantalla químicos y encontró varios agonistas y antagonistas de Wnt Notch que facilitaron la regeneración del hígado 20. También se realizó una pantalla químicas a pequeña escala y se identificaron varios compuestos que pueden suprimir la regeneración del hígado (SK, TYC, JS, y DS, en preparación).
Marcador analiza en humanos sugieren que las BEC puede contribuir a hepatocitos regeneradas en el hígado enfermo 5,6. El grupo del Dr. Wanless 'informó recientemente de que un gran porcentaje de parénquima en la cirrosis retrocedido parece derivarse de LPC / BEC en humanos 27, lo que implica la importancia de la regeneración hepática impulsado por BEC en la regresión cirrosis. Teniendo en cuenta el hecho de que las BEC principalmentecontribuyen a la regeneración de los hepatocitos en el modelo de lesión hepática pez cebra se describe aquí, este modelo será una herramienta invaluable para la determinación de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la regeneración del hígado impulsado por BEC. La comprensión de estos mecanismos proporcionará una mejor aproximación a la manera de aumentar la regeneración del hígado innata en pacientes con enfermedades hepáticas graves. Además, en combinación con pantallas químicas, este modelo de pez cebra puede ser útil en la identificación de un fármaco potencial que puede facilitar la regeneración del hígado innata en pacientes humanos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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