Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

O objetivo geral deste procedimento é induzir a ablação de hepatócitos em peixe-zebra para a análise da regeneração hepática conduzida pelas vias biliares. Isso é feito expondo primeiro as larvas transgênicas que expressam nitro redutase em seus hepatócitos a metrona ou MTZ. Na segunda etapa, o nível de ablação de hepatócitos é avaliado com base no tamanho relativo do fígado.

Após o tratamento com MTZ na etapa final, as larvas abladas com um fígado minúsculo são coletadas, em última análise, o tamanho do fígado e a expressão dos marcadores hepáticos no fígado em regeneração são medidos por epifluorescência e microscopia confocal, respectivamente. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como modelos de ativação de células ovais de roedores, é que, com esta técnica, os hepatócitos regenerativos são derivados principalmente de células epiteliais biliares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regeneração hepática, como a forma como as células progenadoras biliares ou hepáticas contribuem para a regeneração do fígado Geralmente, o indivíduo para o novo neste método terá dificuldades porque o tamanho do fígado no laboratório de chumbo e degeneração é variável.

Para realizar acasalamentos cronometrados, configure peixes hemizigotos ou homozigotos machos e fêmeas adultos durante a noite com uma divisória entre eles. Remova a divisória na manhã seguinte, quando o acasalamento for desejado, usando uma peneira de malha de plástico fina para colher os embriões, vire a peneira de cabeça para baixo e use uma garrafa de aperto para enxaguar a superfície da malha com um jato fino de água de ovo. Em seguida, transfira até 100 embriões para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 25 mililitros de água de ovo e coloque a placa a 28 graus Celsius para inibir a pigmentação.

Adicione PTU à cultura por até 10 horas. Pós-fertilização em 80 horas. Após a personalização, anestesiar as larvas com trica e usar um microscópio de epifluorescência para coletar as larvas positivas para CFP, mantendo apenas os animais com fígados de tamanho semelhante.

Em seguida, substitua a água do ovo trica por água fresca suplementada com PTU e retorne as larvas de peixe-zebra positivas para CFP para a incubadora de 28 graus Celsius. Para tratar as larvas de peixe-zebra com MTZ primeiro, divida o número apropriado de larvas em dois recipientes de cultura diferentes. Manter o grupo de larvas experimentais numa solução de MTZ recém-preparada e o grupo de controlo em água de ovo.

Suplementado com DMSO. Cubra o grupo experimental com papel alumínio para evitar a fotoinativação da MTZ e incube ambos os grupos de larvas de peixe-zebra a 28 graus Celsius no final do período de ablação. Remova a solução MTZ das placas e lave as larvas tratadas com MTZ duas a três vezes com 25 mililitros de água de ovo e agitando descartando a água do ovo após cada lavagem.

Após a última lavagem, imobilizar as larvas com metade da concentração de trica usada anteriormente para evitar edema cardíaco e morte nas larvas tratadas com MTZ. Em seguida, use o filtro CFP em um microscópio de epifluorescência para avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado das larvas tratadas com MTZ. Considere o peixe-zebra com fígados grandes representando zero a 5% das larvas como não ablação.

Aqueles com fígados de tamanho médio representando 10 a 20% das larvas a serem parcialmente ablacionadas e aqueles com fígados muito pequenos representando 80 a 90% das larvas a serem totalmente ablacionadas. Depois de classificar todos os animais, descubra as larvas com fígados não ablacionados ou parcialmente ablacionados, mantendo apenas o peixe-zebra com fígados minúsculos indicando uma ablação grave de hepatócitos para análise hepática. No ponto de tempo de zero hora de regeneração, transfira as larvas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Imediatamente após a lavagem da MTZ e o fornecimento de CFP, substitua a água do ovo por tampão MPEM de formaldeído a 3% para uma fixação noturna em um rotor de quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua a solução de fixação por um mililitro de P-B-S-D-T e gire as larvas por mais cinco minutos. Em seguida, todas as larvas fixadas em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo P-B-S-D-T fresco sob um microscópio de dissecação e use uma pinça para remover manualmente a gema e as barbatanas peitorais quando todas as larvas tiverem sido cortadas.

Transfira até 20 animais para um tubo de 1,5 mililitro e substitua o P-B-S-D-T por um mililitro de solução de bloqueio. Após duas horas no rotador à temperatura ambiente, substitua a solução de bloqueio por 100 microlitros do coquetel de anticorpos primários para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Com o balanço no dia seguinte, remova a solução de anticorpos primários e lave o peixe-zebra com P-B-S-D-T por cinco lavagens de 10 minutos.

Após a última lavagem, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário para uma incubação de duas horas em temperatura ambiente com balanço. Finalmente, lave as larvas cinco vezes em P-B-S-D-T como acabamos de demonstrar. Oriente as larvas lateralmente em uma lâmina de microscópio e adicione uma gota de mídia de montagem.

Em seguida, cubra cuidadosamente cada peixe-zebra com uma lamínula e sele a lamínula com esmalte. O tratamento com MTZ por 36 horas de 3,5 a cinco dias após a fertilização reduz drasticamente o tamanho do fígado. Após a lavagem da MTZ, uma forte expressão de CFP e vermelho reaparece dentro de 30 horas, de fato, conforme avaliado pela expressão de LCAM na membrana das células epiteliais biliares.

A rede biliar intra-hepática inicialmente entra em colapso, mas é restabelecida 54 horas após o washout, indicando uma rápida regeneração e recuperação do fígado. Nessas imagens, hepatócitos regeneradores transgênicos para uma proteína fluorescente vermelha nuclear expressa exclusivamente nas células epiteliais biliares do fígado são mostradas, a maioria dessas células positivas de cereja H duas BM no fígado em regeneração expressa HNF quatro alfa na hora de regeneração zero na hora de regeneração quatro C oito. Os hepatócitos positivos para CFP tratados com MTZ ainda mantêm sua expressão de cereja H two BM, indicando a conversão das células epiteliais biliares em hepatócitos após perda grave de hepatócitos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar a ablação completa após o tratamento com MTT para a regeneração hepática subsequente em lise após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regeneração hepática explorarem os mecanismos subjacentes ao progenitor do fígado, a regeneração hepática acionada por células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar este modelo de operação específica de citos geográficos para estudos de degeneração hepática impulsionados por bilio.