Name: Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a induzir ablação específica de hepatócitos em Danio rerio usando metronidazol em larvas transgênicas. Este método permite analisar a regeneração hepática mediada por células biliares em tempo real.

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Os autores agradecem aos Drs. Hukriede e Tsang pelas discussões. M.K. foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NIH (T32EB001026). Este trabalho foi apoiado em parte por doações da American Liver Foundation, da March of Dimes Foundation (5-FY12-39) e do NIH (DK101426) para DS

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com o procedimento padrão; experimentos foram aprovados pela Universidade de Pittsburgh Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1. Preparação de Embriões / larvas <ol><li> Para realizar cruzamentos programados, configurar adulto do sexo masculino e feminino Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 peixes hemizigóticas ou homozigotos O / N e colocar um divisor entre eles. Remover este divisor na manhã seguinte quando o acasalamento é desejado. Coletar embriões esticando a água usando um filtro fino malha de plástico. </li><li> Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar a superfície da malha com um bom fluxo de água ovo dispensada de uma garrafa squeeze. Transferir 100 embriões em uma placa de 100 mm de petri com 25 ml de água ovo. Mantenha há mais de 100 embriões por placa de petri e criá-los a 28 ° C. </li><li> Para inibir a pigmentação, adicionar feniltioureia (PTU) para as placas de petri antes de 10 horas pós-fertilização (HPF), e levantar embryos / larvas até 80 hpf. A concentração final do PTU é de 0,2 mm. CUIDADO: PTU é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Anestesiar as larvas por adição de 3-amino benzóico éster etílico do ácido (tricaina), a uma concentração final de 0,016%, em placas de petri. Em seguida, utilizando um microscópio de epifluorescência, larvas tipo PCP-positiva. Use larvas com um tamanho semelhante fígado e descartar aqueles com uma menor ou maior do fígado. NOTA: qualquer larvas PCP-positivo, independentemente de intensidade, pode ser utilizado porque não há nenhuma diferença na extensão da ablação de hepatócitos entre as larvas hemizigótico e homozigoto. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Retire a água ovo contendo tricaina e adicione água ovo suplementado com 0,2 mM PTU. Manter a embriões / larvas a 28 ° C. </li></ol> 2. Tratamento Mtz <ol><li> Prepare fresco solução a 10 mM Mtz dissolvendo 0,171 g de pó em 1 Mtz00 ml de água de ovo suplementado com 0,2% de DMSO e 0,2 mM de UTP. Para dissolver completamente o Mtz, misturar a solução à temperatura ambiente com agitação rápida durante 20-30 minutos. Para ajudar a solubilizar Mtz Mtz e para melhorar a permeação para as larvas, adicione DMSO ao preparar Mtz. CUIDADO: A exposição prolongada ou aumento da concentração de Mtz é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Separe as larvas em grupos controle e experimentais, transferindo número desejado de larvas em duas diferente 100 mm prato de petri ou multi-bem placa. Para o grupo experimental, manter as larvas em solução Mtz 10 mM; para o grupo controle, mantê-los em água ovo contendo 0,2% de DMSO. </li><li> Cobrir as placas ou pratos de petri contendo a solução Mtz com folha de alumínio para evitar o foto-inactivação da MTZ, e incuba-se a 28 ° C. A duração do tratamento depende da Mtz fase larval e a linha transgénica. </li><li> Para observar a ablação de hepatócitos grave semelhante no <em&gt; Tg (fabp10a: NTR-PCP) linha, tratar as larvas com a solução de Mtz ou 3,5 dias pós-fertilização (dpf) (para uma duração de 36 h) ou a partir de 5 dpf (para uma duração de 24 horas). </li></ol> 3. Análise da regeneração hepática biliar-driven <ol><li> No final do período de ablação, remover a solução Mtz das placas. Lavar as larvas tratadas com Mtz por adição de 25 ml de água ovo. Agitar a placa de 2-3 vezes para lavar as larvas antes de descartar a água do ovo. Repetir três vezes e, em seguida, mergulhar as larvas mais uma vez em água de ovo. Para evitar o edema do coração e a morte larval em larvas tratadas com Mtz, adicionar uma concentração mais baixa de tricaina, a uma concentração final de 0,008%, para imobilizar as larvas. </li><li> Para a análise do fígado, fígado examinar o tamanho das larvas tratadas com Mtz sob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP. Avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado: grande (não-ablação; 0-10% de larvas), forma (parcialmente ablação; 10-20%), e muito pequena (totalmente ablação; 80-90%). </li><li> Retirar as larvas com fígados não ablacionadas ou parcialmente extirpadas. Apenas manter larvas com uma pequena fígado, o que é indicativo de ablação hepatócitos grave. Para a análise de fígado na regeneração 0 ponto de tempo hr (R0h), colher as larvas após Mtz washout e PCP classificação. Caso contrário, mantenha as larvas classificadas em água ovo suplementado com PTU 0,2 mM até que esteja pronto para a colheita. </li><li> Transferir larvas recolhidas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e substituir a água de ovo com a solução de fixação de formaldeído a 3% em tampão PEM. Incubar o tubo num rotor O / N a 4 ° C. </li><li> Substituir a solução de fixação com 1 ml de PBSDT e rodar o tubo contendo as larvas no rotor durante 5 min. </li><li> Transferir as larvas fixo numa placa de Petri contendo 100 milímetros PBSDT usando uma pinça e, remover manualmente gema e barbatanas peitorais sob um microscópio de dissecação. Transfira até tp 20 larvas dissecado em um tubo de 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Substitua PBSDT solução com 1 ml de solução de bloqueio e balançar o tubo num agitador rotativo à temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Substituir solução de bloqueio com 100 ul de solução contendo os anticorpos primários de bloqueio. Lentamente balançar o tubo num rotor O / N a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário e lava-se com PBSDT 5 vezes durante 10 min de cada vez. Em seguida, adiciona-se 100 ul de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários e rocha que num rotor a TA durante 2 h. </li><li> Lavar cinco vezes com PBSDT durante 10 min de cada vez, à TA por balanço num rotor. </li><li> Orientar as larvas lateralmente sobre uma lâmina de microscópio e adicionar uma gota de meio de montagem. Cobri-los cuidadosamente com uma tampa de vidro e selar a tampa de vidro com um esmalte de unha. Agora, ele está pronto para a microscopia confocal. </li></ol>

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<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Grave, mas não leve, ablação de hepatócitos provoca a regeneração do fígado-driven biliar. Por conseguinte, após o tratamento de lavagem e Mtz, é importante para examinar o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz, que pode ser avaliada pela fluorescência intrínseca do PCP fabp10a: NTR-PCP transgene. Uma vez que uma pequena percentagem das larvas tratadas com Mtz exibirá não excisada (0-5%) ou parcialmente ablação (10-20%) os fígados, é essencial para resolver e apenas analisar as larvas com uma muito pequ...

O fígado é um órgão altamente regenerativa. Durante a regeneração do fígado, regenerar hepatócitos, as células do parênquima do fígado, são derivados de hepatócitos pré-existentes (regeneração hepática-driven hepatócitos) ou BEC (regeneração hepática-driven biliar) 1,2. A lesão hepática geralmente provoca a proliferação de hepatócitos pré-existentes; no entanto, quando a proliferação de hepatócitos é comprometida, CEBs pode contribuir para hepatócitos 2-4. Estes dois modos de regeneração do fígado são clinicamente significativa. Após a remoção cirúrgica de uma porção do fígado humano (por exemplo, devido a tumores do fígado ou dadores vivos de fígado), hepatócitos no fígado proliferam restante para recuperar a massa do fígado perdida. Em contraste, em doentes com doenças hepáticas graves, a proliferação dos hepatócitos é grandemente comprometida, de modo a que as CEBs ou células progenitoras do fígado (LPCs) parecem contribuir para a regeneração de hepatócitos 5,6. O modelo de roedor 2/3 hepatectomia parcial, em quehepatócitos proliferam para recuperar a massa hepática perdido, tem contribuído significativamente para a compreensão atual de-driven hepatócito regeneração hepática 7,8. No entanto, não existe um modelo roedor válido no qual os hepatócitos em regeneração são derivados principalmente de CEBs. Embora vários modelos de toxina de roedor fígado levou à identificação de-driven biliar regeneração hepática 2-4, estudos recentes em rastreio de linhagem ratos indicam uma contribuição mínima de CEBs para regenerar hepatócitos nestes modelos 9,10. Alguns dos modelos de lesão de fígado de roedores, incluindo hepatectomia parcial 11-13 e induzida por acetaminofeno danos no fígado 14,15, ter sido aplicada a peixes-zebra e levou à identificação de novos genes ou vias envolvidas na regeneração do fígado. No entanto, hepatócito-driven, mas não BEC-driven, a regeneração do fígado ocorre nesses modelos de lesão do fígado de peixe-zebra. Portanto, um modelo de fígado romance em que BECs contribuir amplamente para se regeneraing hepatócitos é necessária para uma melhor compreensão da regeneração hepática BEC-driven. Os objetivos gerais do modelo de ablação de hepatócitos descritos aqui são (1) para gerar um modelo de fígado em que BECs contribuir amplamente para os hepatócitos em regeneração, e (2) elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes regeneração hepática BEC-driven. Nossa hipótese é que a gravidade da lesão determina o modo de regeneração do fígado; Assim, previmos que a regeneração hepática-driven biliar iniciaria após lesão hepática grave. Para testar esta hipótese, desenvolvemos um modelo de fígado de peixe-zebra, gerando uma linhagem transgênica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, que é altamente expressa nitrorredutase bacteriana (NTR) fundido com a proteína fluorescente ciano (PCP), sob a fabp10a específicas do hepatócito promotor. Desde NTR converte a pró-droga não tóxica, metronidazol (Mtz), em um fármaco citotóxico, ele destina-se somente a ablates NTR-células que expressam 16-18, neste caso, os hepatócitos. Ao manipular a duração do tratamento Mtz, a extensão da ablação de hepatócitos pode ser controlada. Usando esse modelo, que recentemente informou que após a perda de hepatócitos grave, BECs extensivamente dar origem a regeneração hepatócitos 19, que foi ainda confirmada por outros dois estudos independentes 20,21. Portanto, em comparação com o acima mencionado roedor e modelos de lesão de fígado de peixe-zebra, o nosso modelo de ablação dos hepatócitos é mais vantajoso para estudar a regeneração hepática BEC-dirigido. Este protocolo descreve o procedimento para a realização de experimentos de regeneração hepática utilizando o modelo de ablação de hepatócitos peixe-zebra. Este modelo será adequado para determinar os mecanismos subjacentes a regeneração hepática-driven biliar e para telas químicas para identificar pequenas moléculas que pode reprimir ou aumentam a regeneração do fígado.

<table><tbody><tr><td>Éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (tricaína) em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Faça estoque de tricaína a 0,4% (15 mM): Leve 0,4 g de tricaína a 100 mL com água de ovo. Ajuste para pH 7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm placa de Petri&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>Esmalte transparente M5300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>pinça fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>lâmina de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A e 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (camundongo anti-Alcam)</td> <td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 diluição</td></tr><tr><td>cabra anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td> <td>diluição 1:50</td></tr><tr><td>rato anti-RFP</td><td>alelo Biotecnologia</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 diluição</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Cy3 burro anti-rato IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1:500 microscópio</td></tr><tr><td>de dissecação de diluição</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de epifluorescência</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>água</td><td></td><td></td><td>de ovo 0,3 g/L de sais marinhos ' Oceano instantâneo' e CaSO4 0,5 mM em água destilada. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&middot; 7H2O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 2 g de KH2PO4.&nbsp; Leve a 1 L com água destilada.&nbsp; Ajuste o pH 7.&nbsp; Autoclave por 20 min a 121 graus Celsius.</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO em 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> PEM <td>30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&nbsp; Leve a 1 L com água destilada.&nbsp; Ajuste o pH 7.</td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de bloqueio <td>Misture 1 ml de soro de cavalo inativado pelo calor com 9 ml de PBSDT 1X.</td></tr></tbody></table>

ablação específicas do hepatócito em zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

O fígado tem uma grande capacidade para se regenerar. Os hepatócitos, as células parenquimatosas do fígado, pode regenerar em uma de duas maneiras: a regeneração hepática hepatocyte- ou accionada por biliar. Na regeneração hepática-driven hepatócitos, os hepatócitos em regeneração são derivados de hepatócitos pré-existentes, ao passo que, na regeneração-driven biliar, hepatócitos em regeneração são derivadas de células epiteliais das vias biliares (CEBs). Para a regeneração hepática-driven hepatócito, existem modelos de roedores excelentes que têm contribuído significativamente para a compreensão atual da regeneração hepática. No entanto, não existe tal modelo de roedor existe para regeneração hepática-driven biliar. Nós recentemente relatado em um modelo de fígado de peixe-zebra em que BECs extensivamente dar origem a hepatócitos após a perda de hepatócitos grave. Neste modelo, os hepatócitos são especificamente ablação por um meio de farmacogenética. Aqui nós apresentamos em detalhes os métodos para retirar hepatócitos e analisar o processo de regeneração hepática BEC-driven.Este modelo de ablação específica do hepatócito pode ser ainda usado para descobrir os mecanismos moleculares e celulares subjacentes da regeneração hepática-driven biliar. Além disso, estes métodos podem ser aplicados para telas químicas para identificar moléculas pequenas que aumentam ou suprimem a regeneração do fígado.

MTZ tratamento durante 36 h (A36h, A representa ablação) 3,5-5 dpf reduzida drasticamente o tamanho do fígado (Figura 1B). Depois Mtz washout, considerado como o início de regeneração hepática (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: expressão dsRed reapareceu no prazo de 30 horas (Figura 1B). A rede biliar intra-hepático, tal como avaliado por expressão de Alcam que está presente na membrana de CEBs 22, mas inicialmente recolhido foi restabelecida em 54 horas...

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol. Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a ablação de hepatócitos em peixe-zebra para a análise da regeneração hepática mediada pelo sistema biliar. Isso é realizado primeiramente expondo larvas transgênicas que expressam nitroredutase em seus hepatócitos ao metronidazol ou MTZ. Na segunda etapa, o grau de ablação de hepatócitos é avaliado com base no tamanho relativo do fígado.Após o tratamento com MTZ na etapa final, larvas com ablação de bulbo e fígado diminuto são coletadas e, em última instância, o tamanho do fígado e a expressão de marcadores hepáticos no fígado em regeneração são medidos por microscopia de fluorescência epi e microscopia confocal, respectivamente. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como modelos de ativação de células ovais em roedores, é que, com esta técnica, os hepatócitos regenerativos são derivados principalmente de células epiteliais biliares. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da regeneração hepática, tais como como as células progenitoras biliares ou hepáticas contribuem para a regeneração do fígado. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque o tamanho do fígado em larvas com ablação e degeneração é variável.Para realizar cruzamentos programados, monte casais de peixes hemizigotos ou homozigotos adultos com um divisor entre o macho e a fêmea na véspera. Na manhã seguinte, quando desejar acasalar, remova o divisor e use um escumador de malha plástica fina para coletar os embriões; vire o escumador de cabeça para baixo e utilize um frasco com bico de pressão para lavar a superfície da malha com um jato fino de água para ovos. Em seguida, transfira até 100 embriões para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 25 mililitros de água para ovos e coloque a placa a 28 graus Celsius para inibir a pigmentação.Adicione PTU ao cultivo até 10 horas. Após a fertilização, em 80 horas. Após a personalização, anestesie as larvas com trica e use um microscópio de fluorescência epifluorescente para coletar as larvas positivas para CFP, mantendo apenas os animais com fígados de tamanho semelhante.Em seguida, substitua a água dos ovos trica por água de ovos fresca suplementada com PTU e retorne as larvas de peixe-zebra positivas para CFP ao incubador a 28 graus Celsius. Para tratar as larvas de peixe-zebra com MTZ primeiro, divida o número apropriado de larvas em dois recipientes de cultura diferentes. Mantenha o grupo experimental de larvas em uma solução de MTZ recém-preparada e o grupo controle em água de ovos.Suplementado com DMSO. Cubra o grupo experimental com papel alumínio para evitar a inativação fotossensível do MTZ e incube ambos os grupos de larvas de peixe-zebra a 28 graus Celsius ao final do período de ablação. Remova a solução de MTZ das placas e lave as larvas tratadas com MTZ duas a três vezes com 25 mililitros de água de ovo, agitando e descartando a água de ovo após cada lavagem.Após a última lavagem, imobilize as larvas com metade da concentração de trica previamente utilizada para evitar edema cardíaco e morte nas larvas tratadas com MTZ. Em seguida, utilize o filtro CFP em um microscópio de fluorescência epifluorescente para avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado das larvas tratadas com MTZ. Considere os peixes-zebra com fígados grandes, representando de zero a 5% das larvas, como não ablatados.Aqueles com fígados de tamanho médio, representando de 10 a 20% das larvas, terão ablação parcial, e aqueles com fígados muito pequenos, representando de 80 a 90% das larvas, terão ablação completa. Após classificar todos os animais, identifique as larvas com fígados não ablatados ou parcialmente ablatados, mantendo apenas os peixes-zebra com fígados minúsculos, indicando uma ablação severa de hepatócitos, para análise hepática. No ponto temporal de tempo zero de regeneração, transfira as larvas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Imediatamente após a lavagem do MTZ e a obtenção do CFP, substitua a água dos ovos por tampão MPEM com 3% de formaldeído para uma fixação noturna em um rotor a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua a solução de fixação por um mililitro de P-B-S-D-T e agite as larvas por mais cinco minutos. Em seguida, transfira todas as larvas fixadas para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo P-B-S-D-T fresco sob um microscópio estereoscópico e use pinças para remover manualmente a gema e as nadadeiras peitorais assim que todas as larvas tiverem sido separadas.Transfira até 20 animais para um tubo de 1,5 mililitro e substitua o P-B-S-D-T por um mililitro de solução bloqueadora. Após duas horas em rotação à temperatura ambiente, substitua a solução bloqueadora por 100 microlitros do coquetel de anticorpo primário para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. No dia seguinte, com agitação suave, remova a solução de anticorpo primário e lave os peixes-zebra com P-B-S-D-T em cinco lavagens de 10 minutos cada.Após a última lavagem, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente com agitação. Por fim, lave as larvas cinco vezes em P-B-S-D-T conforme demonstrado anteriormente. Oriente as larvas lateralmente em uma lâmina de microscópio e adicione uma gota de meio de montagem.Em seguida, cubra cuidadosamente cada peixe-zebra com uma lamínula e selar a lamínula com esmalte de unha. O tratamento com MTZ por 36 horas, de 3,5 a cinco dias após a fertilização, reduz drasticamente o tamanho do fígado. Após a lavagem do MTZ, uma forte expressão de CFP e vermelha reaparece dentro de 30 horas, conforme avaliado pela expressão de LCAM na membrana das células epiteliais biliares.A rede biliar intra-hepática inicialmente colapsa, mas é então restabelecida 54 horas após a lavagem, indicando uma rápida regeneração e recuperação hepática. Nessas imagens, hepatócitos em regeneração transgênicos para uma proteína fluorescente vermelha nuclear expressa exclusivamente nas células epiteliais biliares do fígado são mostrados; a maioria dessas células positivas para H dois BM cherry no fígado regenerando expressa HNF quatro alfa na hora zero de regeneração, na hora quatro de regeneração C oito. Os hepatócitos positivos para CFP tratados com MTZ ainda retêm sua expressão de H dois BM cherry, indicando a conversão das células epiteliais biliares em hepatócitos após perda severa de hepatócitos.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de selecionar completamente ablatado após o tratamento com MTT para a subsequente regeneração hepática na ação de lise após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de regeneração hepática explorarem os mecanismos subjacentes à regeneração hepática impulsionada por células progenitoras do fígado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este modelo de operação específico para células geográficas em estudos de degeneração hepática bilioimpulsionada.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O artigo descreve a ablação hepática direcionada, um método para induzir a morte de hepatócitos com metronidazol em larvas transgênicas de peixe-zebra. O protocolo de amostra descreve o processo de geração, manipulação e avaliação da ablação hepática direcionada em peixe-zebra.

Ablação hepática direcionada: induzindo a morte de hepatócitos com metronidazol em larvas de peixe-zebra transgênico

A fibrose sustentada com deposição de proteínas excessivas da matriz extracelular leva à cirrose. O abuso de álcool é uma das principais causas de doença hepática grave. Estabelecemos um modelo de fígado fibrótico de peixe-zebra induzido por etanol para estudar os mecanismos e estratégias de promoção da regeneração de hepatócitos após lesão induzida por álcool.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Este protocolo descreve análises histológicas dos fígados de larvas de peixe-zebra que foram tratadas com etanol a 2% durante 24 h. Tal tratamento com etanol agudo resulta em esteatose hepática e inchaço da vasculatura hepática.

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Aqui apresentamos um método confiável para estudar a regeneração renal adulta induzindo lesão renal aguda por injeção de gentamicina. Mostramos que a lesão depende da dosagem de gentamicina e da temperatura ambiente usando hibridização in situ para rotular lhx1a+ em desenvolvimento de novos néfrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

Este protocolo mostra como para excisar consistentemente olhos planarian (copos óptica), sem perturbar os tecidos circundantes. Utilizando uma agulha de seringa de insulina e, de um ou ambos os olhos pode ser cauterizado para facilitar investigações sobre os mecanismos que regulam a regeneração do olho, a evolução de regeneração visual, e a base neural de comportamento induzida pela luz.

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

Aprenda a induzir ablação específica de hepatócitos em Danio rerio usando metronidazol em larvas transgênicas. Este método permite analisar a regeneração hepática mediada por células biliares em tempo real.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

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