Abstract
De keelholte mesoderm ontwikkelen van embryo's draagt bij aan een brede regio van hoofd en hart spiermassa. We hebben een nieuwe werkwijze voor hoofd en hart progenitor cel ontwikkeling met pharynxbogen (ook bekend als kieuwbogen) ex vivo kunnen onderzoeken. Met behulp van deze methode, hebben we onlangs beschreven dat de tweede faryngeale boog bevat zelfvernieuwende hart voorlopers en dient als een micro-omgeving voor uitbreiding van de voorouders tijdens muis ontwikkeling van het hart. De voorlopercellen blijven ongedifferentieerde en uitgestrekte in de boog, maar al snel uitgegroeid tot functionele cardiomyocyten als ze migreren van de boog. We hebben ook gemeld dat de eerste keelholte boog bevat spier voorouders die aanleiding geven tot myotubes na het verlaten van de boog. Hier tonen we de procedure voor de dissectie en ex vivo cultuur van de eerste en tweede pharynxbogen uit ontwikkelingslanden muis embryo's. De methode maakt het mogelijk om hoofd en hart voorlopercellen / spier dev studerenelopment, waaronder cardiomyocyt en myotube vorming in detail ex vivo.
Introduction
Faryngeale mesodermcellen leiden tot delen van het hart en de faryngeale spieren. Tijdens de embryonale ontwikkeling, multipotent cardiale stamcellen uit het tweede hart veld migreren van de keelholte mesoderm en bevolken de cardiale uitstroombaan en rechter ventrikel, en hun abnormale ontwikkeling is nauw verbonden met een aangeboren hartaandoening-de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijkingen en geboorte defect- gerelateerde sterfgevallen bij de mens 1-3. Recente studies hebben aangetoond dat pharynx mesoderm bijdraagt aan hoofdspieren naast het hart, waardoor het mesoderm een kritisch onderdeel van de cardio-craniofaciale ontwikkeling 4. Zo is de ontwikkelingsprocessen inclusief inductie, proliferatie en differentiatie van hoofd en hart voorlopers in de keelholte mesoderm zijn actief onderzocht 5-7.
Tot voor kort bleef het onbekend of cardiale voorlopercellen uitbreiding witho ondergaanut differentiatie, deels te wijten aan het gebrek aan informatie over hun cellulaire omgeving. Onze recente studie suggereert dat pharynxbogen dienen als een micro-omgeving voor de vernieuwing van het hart en de spieren voorouders en kan gekweekt ex vivo worden over enkele weken 8. Dit explantaat werkwijze biedt een nieuwe en unieke gelegenheid om de ontwikkeling van hart- en craniofaciale progenitoren ex vivo te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gehandhaafd op een Amerikaanse Vereniging voor de Accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited dier faciliteit aan de Johns Hopkins University en is gehuisvest in overeenstemming met de in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren procedures. De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd alle experimentele protocollen.
1. Experimentele Voorbereiding
- Coat 12-well plaat met 10% foetaal runderserum (FBS) in fosfaat gebufferde oplossing (PBS) gedurende 60 min.
- Verwijder coating-oplossing en voeg 200 ul van Serum-vrije media (SFM). Twirl plaat om ervoor te zorgen dat een film van media bestrijkt het hele oppervlak.
2. Chirurgische ingrepen
- Euthanaseren zwangere muizen met de verzorging van dieren-commissie goedgekeurde protocol van de instelling, gevolgd door cervicale dislocatie om volledige euthanasie te garanderen.
- Spray en reinig de buik regio van de muis met 70%ethanol. Handhaaf strikte steriele technieken om besmetting te voorkomen.
- Gebruik een tang en schaar om een 0,5 cm 2 incisie in de navel regio.
- Gebruik de vingers te knijpen / grijpen de huid boven en onder de incisie en trek de huid in tegenovergestelde richtingen (kop en staart).
- Tang en schaar een eerste insnijding in het membraan bij het navel gebied. Voorzichtig stuurde de membraan in V-vorm van de navel naar de eierstokken aan weerszijden (2 x 1,5 cm 2), waardoor de baarmoeder onthullen.
- Gebruik een tang om de eileider aansluiten van de baarmoeder naar de eierstok en schaar knijpen om de eileider knijpen op de eierstok kant, waardoor het vrijmaken van de baarmoeder uit de eierstok.
- Trek de baarmoeder door de eileider met de tang en snijd de baarmoeder vrij van de blaas regio met een schaar.
- Trek de baarmoeder verder door de eileider met de tang en snijd de eileider met een schaar aan de andere kant, waardoor de baarmoeder wordt ontheven van de mouse.
- Breng de uterus een 50 ml buis en voeg 20 ml koude steriele PBS met Ca2 + en Mg2 +. PBS moet Ca 2+ en Mg 2+ bevatten tijdens embryo dissectie.
- Schud de buis gedurende 10 seconden naar de baarmoeder te wassen voor het bloed.
- Breng de uterus van de buis met een tang en plaats deze in een 10 ml schaal en voeg 5 ml koude PBS bovenop de uterus.
- Plaats de schaal met de baarmoeder onder een stereomicroscoop.
Opmerking: Stappen 2,13-2,19 vereist een stereomicroscoop. - Gebruik twee paar tang om voorzichtig openen de baarmoeder en ontleden uit vruchtwater zakken met embryo's uit de baarmoeder op een rijtje.
- Gebruik twee paar tang zorgvuldig te openen de vruchtzak dat het embryo omgeeft, knijp de zak met een tang en verwijder voorzichtig uit het embryo, gebruik de andere tang te knippen en laat de vruchtzak van de embryo. Als een bepaald genotype nodig, houden vruchtzak voor genotypering.
- Plaats het embryo aan de zijkant en een tang om de 1 e en 2e dorsaal boog naar het hart tussen de boog en de keelholte zak (figuur 1A '') afgesneden.
- Voorzichtig flip het embryo naar de andere kant en een tang om de 1e en 2e boog gesneden posteriorly naar het hart tussen de boog en de keelholte zakje.
- Gebruik een tang om de cardiale uitstroombaan dat is nog steeds het verbinden van de 1 e en 2 e pharynxbogen om het embryo te snijden. Verwijder de bogen, die nog steeds samen zijn gevoegd in de vorm van een vlinder (figuur 1B), het embryo.
- Gebruik een tang om knijpen en laat de 1 ste pharynxbogen van de resterende cardiale uitstroombaan en voordarm endoderm (Figuur 1B '' aangeduid met onderbroken lijn en *).
- Gebruik een tang om knijpen en laat de 2 e pharynxbogen van de resterende cardiale uitstroombaanen voordarm endoderm (Figuur 1B '' aangeduid met onderbroken lijn en **).
- Overdracht elk paar bogen afzonderlijk gebruikmakend pincet en plaats beide bogen in het midden van een goed aangewezen. Plaat 1 e en 2 e pharynxbogen in afzonderlijke putten. Controleer of de bogen in contact met de film van medium toegevoegd in stap 1.2. Het is cruciaal dat de bogen niet onder medium, aangezien ze moeten contact met het oppervlak van de put voor bevestiging maken tijdens deze periode.
3. Incubation en Imaging
- Incubeer bogen uitgeplaat in 12-well plaat in 37 ° C / 5% CO2 gedurende 2 uur om bogen te hechten aan het oppervlak putruimte.
- Add voorzichtig 200 ul van 37 ° C SFM langs de zijkant van de put. Zorg ervoor dat de bogen verbonden blijven en incubeer O / N.
- De volgende dag, visueel te controleren dat pharynxbogen verbonden zijn en voorzichtig voeg 200 ul van 37 ° C SFM langs de zijkant van degoed. Indien bogen losse en drijvende blijven voorzichtig verwijderen media met een pipet zonder het verwijderen bogen totdat er slechts een film van de media wordt gelaten. Gebruik pipet tip om bogen te plaatsen in het midden van de put en herhaal stap 3.1.
- Dagelijkse Monitor; add ~ 100-200 ul van media elke 2e dag te vervangen elke verdampt media.
Let op: 24-48 uur na migrerende cellen verschijnen rond de boog en zal vermenigvuldigen en migreren van boog over de komende 5-8 dagen. Na 36-72 uur vorming van het verslaan van hartspiercellen kunnen worden waargenomen uit de 2 e keelholte boog (figuur 2B). Myotube formatie kan worden waargenomen vanaf 1 keelholte boog 3-7 dagen na de bevestiging (Figuur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens de ontwikkeling, kan het gezicht spieren en hart voorlopers worden getraceerd als ze zich vermenigvuldigen en migreren van de 1 e en 2 e keelholte boog, aan het hoofd en het hart spieren, respectievelijk (figuur 1A, A 'en A' ') geworden. Kweken pharynxbogen biedt een unieke manier om het hart en de spierontwikkeling in detail bestuderen ex vivo. Na dissectie en bevestiging van pharynxbogen, kunnen migrerende cellen van aangesloten bogen worden waargenomen binnen 24-48 uur van de cultuur. Binnen 3 dagen kweken myotube vorming waarneembaar vanaf 1 pharynxbogen en cardiomyocyten vorming van de 2 e pharynxbogen (figuur 2A en 2B). Cardiomyocyte formatie kan visueel worden bevestigd door spontaan samentrekkende clusters migrerende cellen en / of analyse van specifieke cardiomyocyt markers (bijv cardiale troponine T). Myotuzijn / gezicht spiervorming kan visueel worden waargenomen met lange langwerpige (tot 500 micrometer lang) spontaan trillen cellen en / of analyse van specifieke spier markers (bijv myogenin). Via de cre-lox systeem muizen kunnen mesoderm nakomelingen worden opgespoord door fluorescente reporters upon cre-expressie in ex vivo kweken (figuur 2A en 2B). Ook met deze methode is het mogelijk om het lot nakomelingen onderzoeken waarbij een bepaald gen van belang wordt voorwaardelijk uitgeschakeld of overexpressie, welke anders zou leiden tot vroege embryonale letaliteit zoals we eerder beschreven 8.
Figuur 1: Mouse embryo (Mesp1 cre, Ai9) 9,5 dagen na de bevruchting (E.9.5 >). (A) Linker kant van de embryo. (PA: Pharyngeal Arch, OT: Uitstroom darmkanaal, LV:.. Linker ventrikel (A ') Mesp1 linage-trace; RFP markeert Mesp1 + cellen en hun nageslacht pijl geeft RFP + Mesp1-nageslacht in PA2 dat continu met het OT. (A '') Binnen de lijn aan te geven waar te PA1 en PA2 posterior naar het hart te snijden (B) Butterfly-achtige rechts en links PA1 en PA2 na dissectie van de embryo FE:.. Voordarm endoderm (B. ") RFP merken Mesp1 nageslacht . in PA1 en PA2 (B '') * en **, samen met de stippellijnen aangegeven waar te snijden en laat PA1 en PA2 van het OT en FE Schaal bar:.. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
upload / 52.876 / 52876fig2.jpg "/>
Figuur 2:. Gekweekte pharynxbogen (A) gecultiveerde PA1 (3 dagen van de cultuur). (A ') RFP markeert Mesp1 nageslacht in PA1. Pijlen en * aangeven vroege vorming myotube. (A '') Overlay van RFP expressie in PA1. (B) Gekweekte PA2 (8 dagen van de cultuur). (B ') RFP merken Mesp1 nageslacht in PA2. Pijlen en ** aangeven slaan gebied van hartspiercellen (gemodificeerd uit Shenje et al. 8). (B '') Overlay van RFP expressie in PA2. Schaal bar:. 250 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video laten we zien hoe te isoleren en cultuur eerste en tweede pharynxbogen van 9,5 dagen oude muis embryo's. Pharynxbogen zijn van voorbijgaande aard, gesegmenteerd uitstulpingen die op het craniolateral kant van het ontwikkelen van embryo's 9, die multi-potente cardiale voorlopercellen-bouwstenen bevatten om het hart te maken tijdens de embryogenese 10,11 -in tweede bogen en hoofd spieren voorlopers in de eerste bogen 8 verschijnen .
Dissectie van pharynxbogen vereist geavanceerde muis embryo dissectie vaardigheden. Zodra bogen met succes ontleed met behulp van deze stapsgewijze protocol en overgebracht naar vooraf beklede putjes, is het essentieel dat bogen hechten aan het onderste gedeelte. In dit protocol, we laag wells met 10% FBS, gevolgd door kweken in SFM resulteert in aanhechting en groei van> 75% van bogen, maar andere bekledingsmaterialen worden gebruikt (Matrigel, gelatine, fibronectine etc.) alsmede serum containing media.
De pharynxbogen dient als primordia voor een veelheid van structuren tijdens de ontwikkeling. Na de initiële vorming van de pharynxbogen (8 dagen na de bevruchting in muizen), CPC's uit te breiden in de PA2 en migreren naar de cardiale uitstroombaan waar ze differentiëren in hartcellen, waardoor die als een hernieuwbare bron van CPC's dat cellen die nodig zijn om het hart te ondersteunen levert groei. Omdat de pharynxbogen zijn temporale ontwikkelings structuren (E8-11.5) en migratie van CPC's in de uitstroom plaatsvindt van ongeveer E8-E10) dit brengt bepaalde beperkingen aan de techniek. Voor CPC studies, raden we het gebruik pharynxbogen ontleed tussen E9-10, in dit stadium elke PA2 bevatten ongeveer 5-800 RFP + cellen (Mesp1 linage trace).
Met fluorescerende labeling, deze ex vivo cultuur stelt ons in staat om de ontwikkeling van voorouders en hun differentiatie te controleren in het verslaan van hartspiercellen of myotubes in real-time. Bovendien kan deze ex vivo kweeksysteem worden om rollen van cel-autonome micromilieu factoren op cardiale / spier progenitor proliferatie, migratie en differentiatie Huidig Cre / loxP lijnen bestuderen. Als zodanig is dit systeem verwacht hart- / spier voorlopercellen-niche studies, wat kan leiden tot een beter begrip van hart / spier-vorming en ziekten bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
