Abstract
Die Rachen Mesoderm der sich entwickelnden Embryonen trägt zur breiten Regionen von Kopf und Herzmuskulatur. Wir haben ein neues Verfahren, um Kopf und Herz-Vorläuferzellentwicklung mit Schlundbögen (auch als Kiemenbögen bekannt) ex vivo zu studieren entwickelt. Mit dieser Methode haben wir kürzlich beschrieben, dass die zweite Schlundbogen enthält selbst erneuernden Herzvorläuferzellen und dient als Mikroumgebung für die Expansion der Vorläuferzellen der Maus während der Herzentwicklung. Die Vorläuferzellen bleiben undifferenziert und expansive innerhalb des Bogens, aber schnell funktionelle Kardiomyozyten, als sie aus dem Bogen zu migrieren. Wir haben auch berichtet, dass erste Schlundbogen enthält Muskelvorläuferzellen, die zu Myotuben nach dem Verlassen des arch. Hier zeigen wir, das Verfahren für die Präparation und ex vivo Kultur der ersten und zweiten Schlundbögen aus Entwicklungs Maus-Embryonen. Das Verfahren ermöglicht es, Kopf und Herz-Vorläufer / Muskel dev studierenelopment, einschließlich Kardiomyozyten und Myotuben Bildung im Detail ex vivo.
Introduction
Rachen Mesodermzellen Anlass zu Teilen des Herzens und der Rachenmuskeln. Während der embryonalen Entwicklung, multiHerzVorläuferZellen aus dem zweiten Herzfeld wandern aus dem Rachen Mesoderm und bevölkern die Herzausflusstrakt und rechten Herzkammer und ihre abnorme Entwicklung ist eng mit angeborenem Herzfehler-die häufigste Ursache von Geburtsschäden und Geburtsdefekt zugeordnet bedingten Todesfälle beim Menschen 1-3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Rachen-Mesoderm trägt zur Muskulatur Kopf, zusätzlich zu Herzen, was die Mesoderm ein kritischer Teil der Herz-Kreislauf-kraniofazialen Entwicklung 4. So sind die Entwicklungsprozesse einschließlich Induktion, Proliferation und Differenzierung von Kopf und Herz-Vorläufern in der Rachen Mesoderm aktiv untersucht 5-7.
Bis vor kurzem blieb es unbekannt, ob Herzvorläuferzellen Expansion witho unterziehenut Differenzierung, was teilweise auf das Fehlen von Informationen über ihre zellulären Umgebung. Unsere aktuelle Studie legt nahe, dass Schlundbögen dienen als Mikroumgebung für die Erneuerung der Herz- und Muskelvorläuferzellen und kann über mehrere Wochen 8 ex vivo kultiviert werden. Das Explantat Verfahren bietet eine neue und einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung von Herz-Kreislauf-kraniofaziale Vorläuferzellen ex vivo zu studieren.
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Protocol
Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) gehalten -accredited Tierhaltung an der Johns Hopkins University und in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Verfahren untergebracht. Das Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) stimmten allen Versuchsprotokolle.
1. Versuchsvorbereitung
- Mantel 12-Well-Platte mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) für 60 min.
- Entfernen Beschichtungslösung und mit 200 & mgr; l serumfreien Medien (SFM). Wirbeln Platte, um sicherzustellen, dass ein Film von Medien deckt die gesamte Fläche.
2. Chirurgische Verfahren
- Euthanize schwangeren Mäusen mit Tierpflegeausschuss genehmigten Protokoll der Institution durch Genickbruch folgte, um eine vollständige Euthanasie zu gewährleisten.
- Spray und reinigen Sie die Bauchregion des Maus mit 70%Ethanol. Strikte sterile Techniken, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Verwenden einer Pinzette und Schere, ein 0,5 cm 2 Schnitt am Nabel Region zu machen.
- Benutzen Sie die Finger zu klemmen / greifen die Haut über und unter dem Einschnitt und ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen (Kopf und Schwanz).
- Verwenden einer Pinzette und Schere, um eine anfängliche Einschnitt in der Membran an der Nabelregion zu machen. Schneiden Sie vorsichtig die Membran in V-Form vom Nabel bis der Eierstöcke auf jeder Seite (2 x 1,5 cm 2), wodurch die Gebärmutter enthüllt.
- Verwenden einer Pinzette, um die Eileiter Anschluss der Gebärmutter auf die Eierstöcke und Scheren kneifen, um die Eileiter auf dem Eierstock Seite kneifen, so befreien die Gebärmutter aus dem Eierstock.
- Ziehen Sie vorsichtig die Gebärmutter durch die Eileiter mit der Pinzette und schneiden die Gebärmutter kostenlos von der Blase Region mit einer Schere.
- Ziehen die Gebärmutter weiter durch den Eileiter mit der Zange, und schneiden den Eileiter mit einer Schere an der anderen Seite, wodurch der Uterus Freigabe von der mOuse.
- Übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 20 ml kaltem sterilem PBS mit Ca 2+ und Mg 2+. PBS muss Ca 2+ und Mg 2+ bei Embryo Dissektion enthalten.
- Schütteln Sie das Röhrchen für 10 Sekunden, um die Gebärmutter für die Blutwäsche.
- Übertragen Sie die Gebärmutter aus dem Rohr mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem 10 ml Schale und mit 5 ml kaltem PBS auf der Oberseite der Gebärmutter.
- Die Schale mit der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop.
Hinweis: Die Schritte 2,13-2,19 erfordert ein Stereomikroskop. - Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Gebärmutter und sezieren Fruchtblasen mit Embryonen aus der Gebärmutter einer nach dem anderen.
- Verwenden Sie zwei Paar Pinzette vorsichtig öffnen Sie die Fruchtblase, die den Embryo umgibt, kneifen den Sack mit einer Pinzette und entfernen Sie sie aus dem Embryo, verwenden Sie die andere Zange zu schneiden und lassen Sie die Fruchtblase aus dem Embryo. Wenn ein bestimmter Genotyp erforderlich, halten Fruchtblase für die Genotypisierung.
- Setzen Sie den Embryo auf der Seite und Verwenden einer Pinzette, um die 1 und 2. nach hinten wölben zum Herzen zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche (1A '') geschnitten.
- Flip sanft den Embryo auf die andere Seite und verwenden Sie Zange um den 1. und 2. Bogen nach hinten, um das Herz zwischen dem Bogen und dem Schlundtasche abgeschnitten.
- Verwenden einer Pinzette, um die Herzausflusstrakt, die immer noch den Anschluss wird die 1. und 2. Schlundbögen für den Embryo zu schneiden. Entfernen der Bögen, die sich noch in der Form eines Schmetterlings (1B) miteinander verbunden sind, aus dem Embryo.
- Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 1. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstrakt und Vorderdarm Endoderm (1B '' mit gestrichelten Linie angedeutet und *).
- Verwenden einer Pinzette zu kneifen und lassen Sie die 2. Schlundbögen von der übrigen Herzausflusstraktund Vorderdarm Endoderm (1B '' mit gestrichelten Linie und ** angegeben).
- Übertragen jedes Paar von Bögen einzeln mit einer Pinzette und legen Sie beide Bögen in der Mitte des ein gut bezeichnet. Platte 1 und 2. Schlundbögen in getrennten Vertiefungen. Sicherzustellen, daß die Bögen in Kontakt mit dem Film von Medien in Schritt 1.2 gegeben. Entscheidend ist, dass Bögen NICHT von Medium bedeckt, wie sie benötigen, um den Kontakt mit der Oberfläche der Bohrung zur Befestigung in dieser Periode zu machen.
3. Inkubation und Imaging
- Bogen in der Platte mit 12 Vertiefungen plattiert Inkubieren in 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden für Bögen zum Brunnen Oberfläche zu befestigen.
- Vorsichtig mit 200 & mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite des Bohrlochs. Stellen Sie sicher, dass Bögen befestigt bleiben und Inkubation O / N.
- Am nächsten Tag, visuell zu überprüfen, dass Schlundbögen befestigt und sanft mit 200 & mgr; l von 37 ° C SFM an der Seite dergut. Wenn Bögen bleiben ungebunden und schwimm, entfernen Medien mit einer Pipette, ohne Bögen, bis nur noch ein Film von Medien überlassen. Verwenden Pipettenspitze auf Bögen in der Mitte der gut und wiederholen Sie Schritt 3.1 zu platzieren.
- Überwachen Sie täglich; fügen ~ 100-200 ul Medium jeden 2. Tag jeder verdampft Medien zu ersetzen.
Hinweis: 24-48 h nach der wandernden Zellen erscheinen rund um den Bogen und sich vermehren und wandern von Bogen in den nächsten 5-8 Tage. Nach 36-72 h Bildung schlagen Kardiomyozyten können aus der 2. Schlundbogen (2B) beobachtet werden. Myotube Bildung können vom 1. Schlundbogen 3-7 Tage nach der Befestigung (2A) zu beachten.
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Representative Results
Während der Entwicklung können Gesichtsmuskel und Herzvorläuferzellen zurückgeführt werden, wie sie sich vermehren und wandern aus dem 1. und 2. Schlundbogen, um Kopf und Herzmuskulatur, bzw. (1A, A 'und A' ') zu werden. Kultivieren Schlundbögen bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Herz und Muskelentwicklung im Detail ex vivo zu studieren. Nach Präparation und Befestigung der Schlundbögen können von wandernden Zellen angebracht Bögen innerhalb von 24-48 Stunden der Kultur zu beobachten. Innerhalb von 3 Tagen Kultur Myotube Bildung kann vom 1. Schlundbögen und Herzmuskelbildung aus der 2. Schlundbögen (2A und 2B) beobachtet werden. Herzmuskelbildung kann visuell durch spontan kontra Cluster von wandernden Zellen und / oder Analyse der spezifischen Kardiomyozyten Marker bestätigt werden (zB Cardiac Troponin T). Myotuwerden / Gesichtsmuskelbildung kann visuell durch lange (bis zu 500 & mgr; m in der Länge) spontan zu zucken Zellen und / oder Analyse der spezifischen Muskelmarkierungen (zB Myogenin) verlängert beachten. Durch die Verwendung des cre-lox-System bei Mäusen, Mesoderm Nachkommen kann durch fluoreszierende Reporter auf cre-Expression während der Ex-vivo-Kultur (2A 'und 2B') zurückgeführt werden. Ebenso ist es mit diesem Verfahren möglich, das Schicksal der Nachkommen zu untersuchen, bei dem eine bestimmte interessierende Gen bedingt ausgeschlagen oder überexprimiert wird, die sonst in der frühen embryonalen Letalität führen, wie wir zuvor beschriebenen 8.
Abbildung 1: Maus-Embryo (Mesp1 cre, Ai9) 9,5 Tage nach der Befruchtung (E.9.5 >). (A) Linke Seite des Embryos. (PA: Schlundbogen, OT: Ausflusstrakt, LV:.. Linke Herzkammer (A ') Mesp1 linage-Spur; RFP markiert Mesp1 + Zellen und deren Nachkommen Pfeil zeigt RFP + Mesp1-Nachkommen in PA2, die kontinuierlich mit der OT ist. (A '') Eine gestrichelte Linie anzuzeigen, wo PA1 und PA2 hinter der durchs Herz (B) Schmetterlings-like rechts und links PA1 und PA2 nach der Sektion aus dem Embryo FE:.. Vorderdarm Endoderm (B. ') RFP Marken Mesp1 Nachkommen . in PA1 und PA2 (B '') * und ** zusammen mit den gestrichelten Linien zeigt an, wo zu schneiden und zu lösen PA1 und PA2 von dem OT und FE Maßstabsbalken:.. 500 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.
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Abb. 2: Cultured Schlundbögen (A) Cultured PA1 (3 Tage der Kultur). (A ') RFP markiert Mesp1 Nachkommen in PA1. Pfeile und * zeigen frühen Myotube Bildung. (A '') Overlay von RFP Ausdruck in PA1. (B) kultivierte PA2 (8 Tagen Kultur). (B ') RFP Marken Mesp1 Nachkommen in PA2. Pfeile und ** deuten schlagen Bereich der Herzmuskelzellen (von Shenje et al. 8 modifiziert). (B '') Overlay von RFP Ausdruck in PA2. Maßstab:. 250 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Video zeigen wir, wie man isolieren und Kultur ersten und zweiten Schlundbögen von 9,5 Tage alten Mausembryos. Schlundbögen sind vergänglich, segmentiert Ausbuchtungen, die auf der Seite des kraniolateral entwickelnden Embryonen 9, die multi-potenten Herzvorläuferzellen-Bausteine enthalten, um das Herz während der Embryogenese 10,11 -in zweiten Bögen und Kopfmuskelvorläuferzellen in der ersten Bögen 8 erscheinen .
Dissektion der Schlundbögen erfordert erweiterte Maus-Embryo Dissektion Fähigkeiten. Sobald Bögen wurden erfolgreich mit diesen schrittweise Protokoll präpariert und übertragen, um vorab beschichteten Vertiefungen, ist es entscheidend, dass Bögen anzubringen, um den Bodenbereich. In diesem Protokoll beschichten wir Wells mit 10% FBS, gefolgt von Kultur in SFM was Anhaftung und das Wachstum von> 75% der Bögen, wobei jedoch auch andere Beschichtungsmaterialien verwendet werden (Matrigel, Gelatine, Fibronektin etc.) sowie Serum containing Medien.
Die Schlundbögen dient als primordia für eine Vielzahl von Strukturen während der Entwicklung. Nach der Grundausbildung der Schlundbögen (8 Tage nach der Befruchtung in Mäusen), CPCs zu erweitern in der PA2 und wandern in das Herzausflusstrakt, wo sie differenzieren sich in Herzzellen und damit als erneuerbare Quelle von CPCs, die Zellen benötigt, um Herz aufrechtzuerhalten liefert dien Wachstum. Da die Schlundbögen sind zeitliche Entwicklungsstrukturen (E8-11.5) und die Migration von CPCs in den Ausflusstrakt erfolgt ab ca. E8-E10) das bringt gewisse Beschränkungen an die Technik. Für CPC Studien empfehlen wir Schlundbögen zwischen E9-10 seziert, in dieser Phase jede PA2 enthalten etwa 5 bis 800 RFP + Zellen (Mesp1 linage trace).
Mit Fluoreszenzmarkierung, können wir diese ex vivo Kultur zu entwickeln Vorläuferzellen und deren Differenzierung in Herzmuskelzellen zu schlagen oder Myotuben i überwachenn Echtzeit. Darüber hinaus kann dieser ex vivo-Kultursystem verwendet werden, um Rollen von zell autonomer Mikroumgebungsfaktoren Herz / Muskelvorläuferzellproliferation, Migration und Differenzierung unter Verwendung von existierenden Cre / loxP Linien beeinflussen untersuchen. Als solches ist dieses System erwartet, dass Herz / Muskelvorläufernische Studien, die zu einem besseren Verständnis des Herzens / Muskelbildung und Krankheit führen können, zu erleichtern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
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- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
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