Abstract
המזודרם בלוע של עוברים מתפתחים תורם לאזורים רחבים של ראש ושרירי לב. פיתחנו שיטה חדשה ללימוד פיתוח ראש ואב לב תא עם קשתות בלוע (הידוע גם בקשתות branchial) vivo לשעבר. באמצעות שיטה זו, שתארנו לאחרונה כי קשת בלוע השנייה מכילה אבות לב חידוש עצמיים ומשמשת כמייקרו-סביבה להרחבת האבות במהלך התפתחות לב עכבר. התאים שלא עברו התמיינות להישאר ורחב בתוך הקשת, אבל מהר מאוד הפכו cardiomyocytes הפונקציונלי כפי שהם נודדים מהקשת. אנחנו גם דיווחו כי קשת בלוע ראשונה מכילה אבות שריר והוליד myotubes לאחר שעזב את הקשת. הנה, אנחנו מדגימים את ההליך לנתיחה והתרבות לשעבר vivo של קשתות בלוע הראשונות ושנייה מפיתוח עוברי עכבר. השיטה מאפשרת לאדם ללמוד מוליד ראש והלב / dev שרירelopment, כולל cardiomyocyte והיווצרות myotube בפירוט vivo לשעבר.
Introduction
תאי המזודרם בלוע להצמיח חלקים של הלב ושרירי בלוע. במהלך התפתחות עוברית, תאי לב multipotent משדה הלב השני להגר מהמזודרם בלוע ולאכלס את דרכי יצוא לב וחדר ממני, וההתפתחות לא תקינה שלהם קשורה קשר הדוק עם מחלת לב מולדת-הגורם המוביל למומים מולדים ופגם לידה מקרי מוות הקשורים בבני האדם 1-3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המזודרם בלוע תורם לראש שרירים, בנוסף ללב, מה שהופך את המזודרם חלק קריטי בפיתוח סיבולת הלב-craniofacial 4. לפיכך, התהליכים התפתחותיים כוללים אינדוקציה, שגשוג, והבחנה של אבות ראש ולב בהמזודרם בלוע נמצאים תחת החקירה פעילה 5-7.
עד לאחרונה, הוא נשאר לא ידוע אם ותאי לב עוברים ללא ציפוי הרחבהבידול ut, נובע בחלקו חוסר המידע על הסביבה הסלולרית שלהם. המחקר שנערך לאחרונה שלנו מצביע על כך שקשתות בלוע לשמש כמייקרו-סביבה לחידוש של אבות לב ושרירים ויכולות להיות מתורבת לשעבר vivo על פני כמה שבועות 8. שיטת explant זה מציעה הזדמנות ייחודית וחדשנית ללימוד הפיתוח של אבות לב וcraniofacial vivo לשעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים נשמרו באגודה אמריקנית להסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC) -accredited מתקן בעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ושוכנו בבהתאם לנהלים המפורטים במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי החיים המוסדית (IACUC) אישרה את כל פרוטוקולי הניסוי.
1. ניסיוני הכנה
- צלחת 12 גם מעיל עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) בפוספט שנאגרו פתרון (PBS) במשך 60 דקות.
- הסר פתרון ציפוי ולהוסיף 200 μl של מדיה סרום חינם (SFM). לסובב צלחת לוודא כי סרט של תקשורת מכסה את פני השטח כולו.
2. ניתוחים
- להרדים עכברים בהריון באמצעות הפרוטוקול שאושר על-הוועדה של מוסד טיפול בבעלי החיים ואחריו נקע בצוואר הרחם על מנת להבטיח המתת חסד מוחלטת.
- ריסוס ולנקות את אזור הבטן של העכבר עם 70%אתנול. לשמור על טכניקות סטרילי קפדניות, כדי למנוע זיהום.
- מלקחיים שימוש ומספריים לעשות חתך 0.5 סנטימטר 2 באזור הטבור.
- השתמש באצבעות לצבוט / לתפוס את העור מעל ומתחת לחתך ומשוך בעדינות את העור בכיוונים מנוגדים (ראש וזנב).
- שימוש במלקחיים ומספריים כדי להפוך את חתך ראשוני בקרום באזור הטבור. בעדינות לחתוך את הקרום בצורת V-מהטבור לשחלות בכל צד (2 x 1.5 סנטימטר 2), ובכך חושף את הרחם.
- שימוש במלקחיים כדי לצבוט את oviduct חיבור הרחם לשחלה והמספריים לצבוט oviduct בצד השחלה, ובכך לשחרר את הרחם מהשחלה.
- משוך בעדינות את הרחם על ידי oviduct עם המלקחיים ולחתוך את הרחם חופשי מאזור שלפוחית השתן במספריים.
- משוך את הרחם נוסף על ידי oviduct עם המלקחיים, וחתכתי את צינור השחלה עם מספריים בצד השני, ובכך לשחרר את הרחם ממ 'ouse.
- העבר את הרחם לצינור 50 מ"ל ולהוסיף 20 מיליליטר של PBS הקר סטרילי עם Ca 2 + וMg 2 +. PBS חייב לכלול Ca 2 + וMg 2 + במהלך נתיחת עובר.
- נער בעדינות את הצינור במשך 10 שניות לשטוף את הרחם לדם.
- העבר את הרחם מהצינור עם מלקחיים ומניח אותו בצלחת 10 מיליליטר ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS הקר על גבי הרחם.
- מניחים את הצלחת עם הרחם תחת סטראו.
הערה: שלבי 2.13-2.19 דורש סטראו. - השתמש בשני זוגות מלקחיים בעדינות כדי לפתוח את הרחם ולנתח את שקים מי שפיר עם עוברים מהרחם אחד אחד.
- השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לפתוח את השק מי השפיר המקיף את העובר בזהירות, לצבוט את השק עם מלקחיים ובעדינות מסיר אותו מהעובר, להשתמש במלקחיים האחרים לחתוך ולשחרר את השק מי השפיר מהעובר. אם גנוטיפ ספציפי דרוש, לשמור על שק מי שפיר לgenotyping.
- מניחים את העובר בצד ולהשתמש במלקחיים כדי לחתוך את רח '1 ו -2 nd קשת בדיעבד ללב בין הקשת ונרתיק בלוע (איור 1 א' ').
- בעדינות להעיף את העובר לצד השני ולהשתמש במלקחיים כדי לחתוך את 1 ו 2 קשת בדיעבד ללב בין הקשת ונרתיק בלוע.
- שימוש במלקחיים כדי לחתוך את דרכי יצוא לב שעדיין מחברים את רח '1 ו -2 nd בלוע קשתות לעובר. הסר את הקשתות, שעדיין מחוברים יחד בצורת פרפר (איור 1), מן העובר.
- שימוש במלקחיים לצבוט ולשחרר את קשתות בלוע -1 מהאנדודרם דרכי יצוא לב ומעי קדמי שנותר (איור 1 ב '' הצביע עם קו מקווקו ו*).
- שימוש במלקחיים לצבוט ולשחרר את קשתות בלוע 2 nd ממערכת יצוא לב שנותרהוהאנדודרם המעי הקדמי (איור 1 ב '' הצביע עם קו מקווקו ו**).
- העבר כל זוג קשתות בנפרד באמצעות מלקחיים ומניח את שני הקשתות באמצע מיועד גם. קשתות צלחת 1 st ו- 2 nd בלוע בבארות נפרדות. ודא שהקשתות נמצאות בקשר עם הסרט של תקשורת הוסיפה בשלב 1.2. זה חיוני כי קשתות לא מכוסות על ידי בינוני, כפי שהם צריכים ליצור קשר עם פני השטח של גם לקובץ מצורף בתקופה זו.
3. דגירה והדמיה
- דגירה קשתות מצופות בצלחת 12 גם ב 37 ° C / 5% CO 2 לשעה 2 לקשתות לצרף את פני שטח היטב.
- בעדינות להוסיף 200 μl של 37 מעלות צלזיוס SFM למטה בצד של הבאר. ודא שקשתות תישארנה מחוברים ודגירת O / N.
- למחרת, חזותי לבדוק שקשתות בלוע מצורפות ועדינות להוסיף 200 μl של 37 מעלות צלזיוס SFM למטה בצד שלכן. אם הקשתות יישארו פנויות וצף, להסיר בעדינות תקשורת עם טפטפת מבלי להסיר קשתות עד שרק סרט של תקשורת נשאר. השתמש קצה פיפטה למקם קשתות באמצע הצעד טוב וחזור על 3.1.
- צג יומי; להוסיף ~ 100-200 μl של תקשורת בכל יום 2 להחליף כל התאדו תקשורת.
הערה: 24-48 שעות לאחר העברת תאים להופיע סביב הקשת ולהתרבות ולהעביר מקשת מעל 5-8 הימים הקרובים. אחרי 36-72 היווצרות שעות של שריר לב פועם ניתן לצפות מקשת בלוע 2 nd (איור 2). היווצרות Myotube ניתן לצפות מ3-7 ימי 1 קשת בלוע רח לאחר מצורף (איור 2 א).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך פיתוח, ניתן לייחס אבות שריר לב ופנים כפי שהם להתרבות ולהעביר מ-1 ו -2 קשת בלוע ND, להיות ראש ושרירי לב, בהתאמה (איור 1 א, 'ו''). Culturing קשתות בלוע מציע דרך ייחודית ללמוד לב ושרירים פיתוח בפירוט vivo לשעבר. לאחר נתיחה והתקשרות של קשתות בלוע, תאים נודדים מקשתות המצורפות ניתן לראות בתוך 24-48 שעות של התרבות. תוך 3 ימים של היווצרות myotube תרבות ניתן לצפות מיום 1 בקשתות רח בלוע והיווצרות cardiomyocyte מקשתות בלוע 2 nd (איור 2 א ו -2 ב). היווצרות Cardiomyocyte ניתן לאשר באופן חזותי על ידי באופן ספונטני קבלנות אשכולות של תאים ו / או ניתוח של סמני cardiomyocyte ספציפיים נודדים (למשל, הלב Troponin T). Myotuלהיות בניית שריר פנים / ניתן לצפות מבחינה ויזואלית על ידי ארוך מוארך (עד 500 מיקרומטר באורך) תאים ו / או ניתוח של סמנים ספציפיים שרירים (למשל, Myogenin) באופן ספונטני מתעוות. על ידי שימוש במערכת Cre-לקס בעכברים, צאצאי המזודרם ניתן לייחס על ידי כתבי ניאון על cre-ביטוי במהלך vivo התרבות לשעבר (איור 2 א 'ו -2 ב'). כמו כן, בשיטה זו ניתן ללמוד על גורלם של צאצאים שבי גן ספציפי של עניין הוא דפק את התנאים או ביטוי יתר, שאחרת לגרום קטלני עוברי המוקדם כפי שתארנו בעבר 8.
איור 1: עובר עכבר (cre Mesp1, Ai9) 9.5 ימים לאחר הפריה (E.9.5 >). (א) בצד שמאל של עובר. (הרשות הפלסטינית: בלוע הקשת, OT: מערכת יצוא, LV:.. חדר שמאלי (') Mesp1 linage עקבות; RFP מסמן Mesp1 תאים + וצאצאיהם חץ מצביע RFP + Mesp1-צאצאים בPA2 שהוא רציף עם השטחים. ('') קו מקווקו מציין היכן לקצץ PA1 ואחורי PA2 ללב PA1 (ב) נכון כמו פרפר-ועזב וPA2 לאחר נתיחה מן העובר FE:.. האנדודרם מעי קדמי (ב '). סימני RFP Mesp1 צאצאים . בPA1 וPA2 (ב '') * ו** יחד עם הקווים מקווקווים מציין היכן לחתוך ולשחרר PA1 וPA2 מהשטחים וFE בר סולם:.. 500 מיקרומטר אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
להעלות / 52,876 / 52876fig2.jpg "/>
איור 2:. קשתות בלוע מתורבתות () PA1 מתורבת (3 ימים של תרבות). (א ') RFP מסמן צאצאי Mesp1 בPA1. חיצים ו* מציינים היווצרות myotube מוקדמת. כיסוי ביטוי RFP בPA1 (''). (ב) PA2 מתורבת (8 ימים של תרבות). (ב ') סימני RFP Mesp1 צאצאים בPA2. חיצים ו** מצביעים להכות אזור של שריר לב (שונה מShenje et al. 8). כיסוי ביטוי RFP בPA2 (ב ''). בר סולם:. 250 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים איך לבודד וקשתות התרבות הראשונה ובלוע השני של עוברי עכברים ישנים 9.5 ימים. קשתות בלוע הם חולפות, מפולחים בליטות המופיעות בצד craniolateral של עוברים מתפתחים 9, המכילים בלוקים אב תאים-בניין לב רב עוצמה כדי להפוך את הלב במהלך העובר 10,11 -in קשתות השניה ואבות שריר הראש בקשתות הראשונות 8 .
נתיחה של קשתות בלוע דורשת מיומנויות נתיחת עובר עכבר מתקדמות. ברגע שקשתות כבר גזור בהצלחה תוך שימוש בפרוטוקול זה בשלבים והועברו בארות מראש מצופות, זה קריטי, כי קשתות לצרף לאזור התחתון. בפרוטוקול זה, אנחנו בארות מעיל עם 10% FBS ואחריו התרבות בSFM כתוצאה מהתקשרות והצמיחה של> 75% של קשתות, ניתן להשתמש בחומרי ציפוי אחרים זאת (matrigel, ג'לטין, פיברונקטין וכו '), כמו גם conta סרוםתקשורת ining.
קשתות בלוע משמשת כprimordia עבור מספר רב של מבנים בפיתוח. לאחר היווצרות ראשונית של קשתות בלוע (8 ימים לאחר הפריה בעכברים), עלות לכל קליק להרחיב בPA2 ולהעביר למערכת יצוא הלב שבו הם להתמיין לתאי לב, ובכך משמשים כמקור מתחדשת של עלות לכל קליק שמספק תאים דרושים כדי לקיים לב צמיחה. זה כמו קשתות בלוע הן מבנים זמניים התפתחותיים (E8-11.5) והגירה של המחירים לקליק למערכת יצוא מתרחש מכ E8-E10) מביא מגבלות מסוימות לטכניקה. ללימודים לקליק, אנו ממליצים להשתמש בקשתות בלוע גזור בין E9-10, בשלב זה כל PA2 מכילים כ 5-800 RFP + תאים (זכר linage Mesp1).
עם תיוג פלורסנט, תרבות זה vivo לשעבר מאפשרת לנו לעקוב אחר אבות פיתוח ובידולם למכות cardiomyocytes או myotubes אניבזמן אמת n. בנוסף, מערכת התרבות לשעבר vivo זה יכול לשמש כדי לחקור תפקידים של גורמי תאים אוטונומיים וmicroenvironmental משפיעים התפשטות לב / אב שריר תא, הגירה, והבחנה באמצעות קווי Cre / loxP קיימים. ככזה, מערכת זו צפויה להקל על מחקרי לב / שרירים אב-נישה, דבר שעלול להוביל להבנה טובה יותר של לב / בניית שריר ומחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
