Abstract
A mesoderme da faringe dos embriões em desenvolvimento contribui para amplas regiões da cabeça e musculatura cardíaca. Temos desenvolvido um novo método para estudar cabeça e coração progenitor desenvolvimento de células com arcos faríngeos (também conhecido como arcos branquiais) ex vivo. Usando este método, que descrevemos recentemente que o segundo arco faríngeo contém auto-renovação progenitores cardíacos e serve como um microambiente para a expansão das células progenitoras durante o desenvolvimento do coração de rato. As células progenitoras permanecem indiferenciadas e expansivo dentro do arco, mas rapidamente se tornou cardiomiócitos funcionais à medida que migram para fora do arco. Nós também informou que primeiro arco faríngeo contém progenitores musculares que dão origem a myotubes depois de deixar o arco. Aqui, nós demonstramos o procedimento de dissecção e ex vivo cultura de primeiro e segundo arcos faríngeos de desenvolvimento de embriões de camundongos. O método permite o estudo a cabeça eo coração progenitor / dev muscularolvimento, incluindo cardiomiócitos e miotubo formação em detalhe ex vivo.
Introduction
Mesoderme células da faringe dar origem a partes do coração e os músculos da faringe. Durante o desenvolvimento embrionário, as células progenitoras cardíacas multipotentes do segundo campo coração migrar a partir da mesoderme faríngea e preencher a via de saída do ventrículo direito cardíaco e, e seu desenvolvimento anormal está intimamente associada com doença cardíaca congênita-a principal causa de defeitos de nascimento e defect- nascimento mortes relacionadas nos seres humanos 1-3. Estudos recentes têm demonstrado que faríngea mesoderme contribui para dirigir músculos, para além do coração, tornando a mesoderme uma parte crítica do desenvolvimento cardio-craniofacial 4. Assim, os processos de desenvolvimento, incluindo a indução, proliferação e diferenciação de progenitores de cabeça e do coração na mesoderme da faringe estão sob investigação activa 5-7.
Até recentemente, ele permaneceu desconhecido se as células progenitoras cardíacas submetidos a witho expansãout diferenciação, em parte devido à falta de informação sobre o seu ambiente celular. Nosso estudo recente sugere que arcos faríngeos servir como um microambiente para a renovação de progenitores cardíacos e musculares e podem ser cultivadas ex vivo ao longo de várias semanas 8. Este método de explante oferece uma oportunidade nova e única para estudar o desenvolvimento de células progenitoras cardio-craniofacial ex vivo.
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Protocol
Todos os ratos foram mantidos a uma associação americana para o Credenciamento de Laboratório Animal Care (AAALAC) -accredited biotério da Universidade Johns Hopkins e alojados em conformidade com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) aprovou todos os protocolos experimentais.
1. Experimental Preparação
- Revestimento de 12 poços com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) em solução tamponada de fosfato (PBS) durante 60 min.
- Remover solução de revestimento e adicionar 200 mL de meio de soro-free (SFM). Girar em placa para se certificar de que um filme de meios abrange toda a área de superfície.
2. Procedimentos Cirúrgicos
- Euthanize camundongos grávidas usando o protocolo aprovado pelo comitê de cuidados com os animais da instituição seguido por deslocamento cervical para garantir a eutanásia completa.
- Spray e limpar região da barriga do mouse com 70%etanol. Manter rigorosas técnicas estéreis para evitar a contaminação.
- Use uma pinça e tesouras para fazer um 0,5 centímetros 2 incisão na região do umbigo.
- Use os dedos para apertar / agarrar a pele acima e abaixo da incisão e puxe a pele em sentidos opostos (cabeça e cauda).
- Use fórceps e tesouras para fazer uma incisão inicial na membrana na região do umbigo. Suavemente cortar a membrana em forma de V a partir do umbigo até os ovários em ambos os lados (2 x 1,5 cm2), revelando assim o útero.
- Use uma pinça para beliscar o oviduto de ligar o útero ao ovário e uma tesoura para beliscar a tuba uterina do lado ovário, libertando assim o útero do ovário.
- Puxe cuidadosamente o útero pelo oviduto com a pinça e cortar o útero livre da região de bexiga com uma tesoura.
- Puxar o útero mais acima pelo oviduto com as pinças, e cortar o oviduto com tesouras por outro lado, libertando assim o útero do mouse.
- Transferir o útero para um tubo de 50 ml e adicionar 20 ml de PBS estéril frio com Ca 2+ e Mg 2+. PBS deve conter Ca 2+ e Mg 2+ durante a dissecação de embriões.
- Agite suavemente o tubo para 10 segundos para lavar o útero de sangue.
- Transferir o útero do tubo com uma pinça e colocá-lo em um prato de 10 ml e adicionam-se 5 ml de PBS frio na parte superior do útero.
- Coloque o prato com o útero sob microscópio estereoscópico.
Nota: Os passos 2,13-2,19 requer um microscópio estereoscópico. - Usar dois pares de pinças para abrir suavemente o útero e dissecar sacos amniótico com embriões a partir do útero, um por um.
- Usar dois pares de pinças para abrir cuidadosamente o saco amniótico que envolve o embrião, comprimir o saco com uma pinça e removê-lo suavemente a partir do embrião, utilizar as outras pinças de cortar e libertar o saco amniótico do embrião. Se um genótipo específico necessário, manter saco amniótico para genotipagem.
- Coloque o embrião do lado e utilize uma pinça para cortar o 1 º e 2 º arco posteriormente ao coração entre o arco ea bolsa faríngea (Figura 1A '').
- Gentilmente virar o embrião para o outro lado e utilize uma pinça para cortar o 1º e 2º arco posteriormente ao coração entre o arco ea bolsa faríngea.
- Use uma pinça para cortar a via de saída cardíaca que ainda está se conectando o 1º e 2º da faringe arcos para o embrião. Remover os arcos, os quais ainda estão ligados em conjunto na forma de uma borboleta (Figura 1B), a partir do embrião.
- Use uma pinça para apertar e soltar os arcos um st de faringe da endoderme via de saída cardíaca e foregut remanescente (Figura 1B '' indicado com linha tracejada e *).
- Use uma pinça para apertar e soltar os arcos 2º da faringe do restante da via de saída cardíacae foregut endoderme (Figura 1B '' indicado com linha tracejada e **).
- Transferir cada par de arcos separadamente utilizando uma pinça e colocar ambos os arcos no meio de um assim designado. Placa 1 º e 2 º da faringe arcos em poços separados. Certifique-se de que os arcos estão em contacto com a película de meios adicionados no passo 1.2. É crucial que os arcos não são cobertos por meio de, como eles precisam fazer contato com a superfície do poço para fixação durante este período.
3. Incubação e Imagem
- Incubar arcos plaqueadas na placa de 12 poços em 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 horas para arcos para anexar a área de superfície do poço.
- Adicionar cuidadosamente 200 ul de 37 ° C SFM para baixo do lado do poço. Certifique-se de que arcos permanecer solidários e incubar O / N.
- No dia seguinte, verificar visualmente que arcos faríngeos estão ligados e adicione delicadamente 200 mL de 37 ° C SFM para o lado dabem. Se arcos permanecer solto e flutuante, remover suavemente com uma pipeta de mídia sem remover arcos até que apenas um filme de mídia for deixado. Use ponta da pipeta para colocar os arcos no meio do poço e repetir o passo 3.1.
- Monitorar diariamente; adicionar ~ 100-200 mL de mídia a cada segundo dia para substituir qualquer evaporado mídia.
Nota: 24-48 h após a migração de células aparecem ao redor do arco e vão proliferar e migrar do arco ao longo dos próximos 5-8 dias. Depois 36-72 h formação de cardiomiócitos batendo pode ser observado a partir do 2º faríngea arco (Figura 2B). Formação miotubo pode ser observado a partir de 1º arco faríngeo 3-7 dias depois de anexo (Figura 2A).
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Representative Results
Durante o desenvolvimento, músculo e coração progenitores faciais podem ser rastreados como elas proliferam e migram do 1 º e 2 º da faringe arco, para se tornar cabeça e musculatura cardíaca, respectivamente (Figura 1A, A 'e A' '). Cultura arcos faríngeos oferece uma maneira única de estudar coração e músculo desenvolvimento em detalhe ex vivo. Após a dissecção e fixação dos arcos faríngeos, migrando células de arcos anexados podem ser observados dentro de 24-48 horas de cultura. Dentro de 3 dias de formação miotubo cultura pode ser observado a partir de 1º arcos faríngeos e formação de cardiomiócitos dos arcos faríngeos 2º (Figura 2A e 2B). Formação dos cardiomiócitos pode ser visualmente confirmada por contracção espontânea de aglomerados de células e / ou análise de marcadores específicos de cardiomiócitos que migram (por exemplo, troponina T cardíaca). Myotuser a formação / músculo facial pode ser observado visualmente por longo alongado (até 500 mm de comprimento), as células e / ou da análise de marcadores específicos do músculo (por exemplo, miogenina) contraindo-se espontaneamente. Ao utilizar o sistema cre-lox em camundongos, mesoderme progênie pode ser rastreada por repórteres fluorescentes em cima cre-expressão durante ex vivo cultura (Figura 2A 'e 2B). De igual modo, com este método, é possível estudar o destino da descendência, em que um determinado gene de interesse condicionalmente é eliminado ou sobre-expresso, o que de outro modo resultaria em letalidade embrionária precoce como anteriormente descrito 8.
Figura 1: Rato embrião (Mesp1 cre, Ai9) 9,5 dias após a fertilização (E.9.5 >). (A) Lado esquerdo do embrião. (PA: Pharyngeal Arch, OT: via de saída, LV:.. Do ventrículo esquerdo (A ') Mesp1 linage-trace; RFP marca células Mesp1 + e seus descendentes seta indica RFP + Mesp1-progênie em PA2 que é contínuo com o OT. (A '') A linha tracejada indicar onde cortar PA1 e PA2 posterior ao coração (B) PA1 borboleta-como direita e esquerda e PA2 após a dissecação do embrião FE:.. endoderme Foregut (B. ') marcas RFP Mesp1 progênie . PA1 e PA2 em (B '') * e ** juntamente com as linhas tracejadas indica onde cortar e solte PA1 e PA2 da OT e FE Escala:.. 500 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2:. Arcos faríngeos cultivadas (A) PA1 Cultivadas (3 dias de cultura). (A ') RFP marca Mesp1 progênie em PA1. Setas e * indicam formação miotubo cedo. (A '') Sobreposição de expressão RFP em PA1. (B) PA2 Cultivadas (8 dias de cultura). (B ') marcas RFP Mesp1 progênie em PA2. Setas e ** indicam a área de cardiomiócitos (modificado de Shenje et al. 8) batendo. (B '') Sobreposição de expressão RFP em PA2. Barra de escala:. 250 um favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste vídeo, demonstramos como isolar e cultura primeira e segunda faringe arcos de 9,5 dias antigos embriões de camundongos. Arcos faríngeos são transitórios, segmentado protuberâncias que aparecem no lado craniolateral de embriões em desenvolvimento 9, que contêm multi-potentes blocos cardíaca progenitoras de células-construção para fazer o coração durante a embriogênese 10,11 -em segundo arcos e progenitores musculares cabeça na primeira arcos 8 .
Dissecção de arcos faríngeos exige habilidades avançadas de dissecação de embrião de ratinho. Uma vez que os arcos foram dissecados com sucesso utilizando este protocolo de passo a passo e transferidos para poços pré-revestidas, é fundamental que os arcos anexar à área de fundo. Neste protocolo, poços de revestimento com 10% de FBS, seguido por cultura em SFM resultando em fixação e crescimento de> 75% dos arcos, no entanto, outros materiais de revestimento podem ser usados (matrigel, gelatina, fibronectina, etc.), bem como de soro de Containing mídia.
Os arcos da faringe serve como primórdio para uma multiplicidade de estruturas durante o desenvolvimento. Após a formação inicial dos arcos faríngeos (8 dias após a fertilização, em ratos), CPCs expandir no PA2 e migrar para a via de saída cardíaco onde se diferenciam em células cardíacas, servindo assim como uma fonte renovável de CPCs que abastece as células necessárias para sustentar coração crescimento. Como os arcos faríngeos são estruturas temporais de desenvolvimento (E8-11.5) e migração dos CPCs na via de saída ocorre de aproximadamente E8-E10), este traz certas limitações para a técnica. Para os estudos de CPC, recomendamos a utilização de arcos faríngeos dissecados entre E9-10, nesta fase cada PA2 contêm aproximadamente 5-800 RFP + células (Mesp1 traço linage).
Com marcação fluorescente, esta cultura ex vivo nos permite monitorar progenitores em desenvolvimento e sua diferenciação em cardiomiócitos batendo ou myotubes in em tempo real. Além disso, este sistema de cultura ex vivo pode ser usada para estudar os papéis de factores de células-autónomos e microambientais que afectam a proliferação cardíaca / progenitoras de células do músculo, migração, e diferenciação utilizando linhas Cre / loxP existentes. Como tal, espera-se este sistema para facilitar estudos cardíacos progenitoras-nichos / musculares, o que pode conduzir a uma melhor compreensão da formação do coração e doença / músculo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
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