Introduction
De fleste bakterieceller er i stand til at ansætte både planktoniske (fritlevende) og overflade-attached (fastsiddende) former for vækst 1. I overfladen-attached form for vækst, bakterielle celler udskiller og indkapsle sig i store mængder ekstracellulære polymere stoffer (EPS) til dannelse af biofilm. EPS består hovedsageligt af proteiner, exopolysaccharid, ekstracellulært DNA og er afgørende for biofilmdannelse 2. Det tjener som en fysisk stillads, som bakterierne kan bruge til at differentiere rumligt og beskytter bakterierne mod skadelige miljøforhold og værtsresponser. Forskellige komponenter i EPS har forskellige roller i biofilmdannelse 3 og ændringer i ekspressionen af EPS komponenter kan dramatisk remodel biofilm strukturer 4. EPS komponenter kan også fungere som signalmolekyler 5, og de seneste undersøgelser har vist visse EPS komponenter interagerer med mikrobielle celler til at vejlede deres migrations- og biofilm differentiation 6-8.
Forskning i EPS har i høj grad avancerede baseret på morfologiske analyser af biofilm produceret af mutanter defekte i et bestemt element i EPS 9,10. Desuden er det EPS normalt karakteriseret ved makro-skalaen (bulk karakterisering) 11. Morfologiske analyser kan dog mangle kvantitativ detaljer og bulk karakterisering, som returnerer gennemsnitlige værdier, mister detalje, der findes inden for heterogenitet biofilmen. Der er nu en stigende tendens til at udvikle sig til realtid karakterisering af mekaniker egenskaber EPS på mikro-skalaen. Denne protokol viser, hvordan partikel-sporing microrheology er i stand til at bestemme de spatiotemporale virkninger af matrixkomponenter Pel og PSL exopolysaccharider på viskoelasticiteten og effektiv krydsbinding af Pseudomonas aeruginosa biofilm 4.
Passiv microrheology er en enkel og billig rheology metode, der giver den højeste overførselshastighed på rumlige microrheological sampling af et materiale til dato 12,13. Ved passiv microrheology, er sondens kugler anbringes i prøven og deres Brownsk bevægelse, drevet af termiske energi (k B T) efterfølges af video mikroskopi. Flere partikler kan spores på samme tid, og de tidsafhængige koordinater for partiklerne følger en traditionel random walk. Derfor, i gennemsnit forbliver partiklerne i den samme position. Men standardafvigelsen af forskydningerne eller gennemsnitlige kvadrerede forskydning (MSD) af partiklerne, ikke er nul. Da viskose fluider strømmer, partiklen MSD i en viskøs væske vokser lineært som tiden skrider frem. I modsætning hertil den polymere tværbinding findes i viskoelastiske eller elastiske stoffer hjælpe dem til at modstå strømning, og partiklerne bliver begrænset i deres deplacement, hvilket fører til plateauer i MSD kurve (figur 1A). Denne observation følger relationen MSDαt
Størrelse, tæthed og overfladekemi af partiklen er afgørende for den korrekte anvendelse af microrheological forsøg og er valgt med hensyn til systemet undersøgt (i dette tilfælde polymererne biofilmen matrix, se figur 1B). For det første partiklen måler rheologien af stoffet med strukturer, der er meget mindre end selve partiklen. Hvis stoffets strukturer er af tilsvarende omfang til partiklen, bevægelse af fodkel forstyrres af formen og orienteringen af de individuelle strukturer. Men hvis strukturer, der omgiver partiklen er meget mindre, denne effekt er lille og gennemsnit ud, præsentere et homogent miljø til partiklen (figur 1B). For det andet bør densiteten af partiklen være magen til mediet (1,05 g ml -1 til vandbaserede medier), således at bundfældning undgås, og inertikræfter er ubetydelige. De fleste partikler med polystyren gitre opfylder ovenstående kriterier. Ideelt set har partiklen ikke interagerer med polymererne ifølge biofilmen matrix som det reologiske fortolkning af partikel MSD er kun gyldig, hvis bevægelse er tilfældigt, drevet af termisk energi og kollision med stof strukturer. Dette kan observeres ved at kontrollere, om proben partiklen har tendens til at binde eller hoppe ud på overfladen af en pre-grown biofilm. På trods af manglen på tiltrækning til biofilmen, skal partiklerne kunne indarbejdes i matrixen.Desuden kan de fysisk-kemiske heterogenitet biofilmen resultere i forskellige partikler er mere egnede som prober i forskellige regioner i biofilmen. Således bør partikler af forskellige størrelser og overfladekemi påføres biofilmen.
Som sådan partiklen MSD er i stand til at give nyttige oplysninger om, hvordan forskellige komponenter bidrager til reologien og spredning af biofilmen. Endvidere er anvendelsen af forskellige prober gør det muligt at udlede information om den rumlige fysisk-kemisk heterogenitet biofilmen. Denne metode kan anvendes til at teste virkningen antimikrobiel behandling på de mekaniske egenskaber af biofilmen eller anvendes på blandede arter biofilm at undersøge, hvordan de mekaniske egenskaber af biofilmen er ændret fra indførelsen af en anden art. Particle muskuloskeletale lidelser kan også være nyttige til karakterisering biofilm spredning. Sådanne studier vil være nyttigt i vores forståelse af biofilm, potentielt forbedre biofilm behandlinger enND manipulation af biofilm til nyttige aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Dyrkning
- Fremstilling af Bakteriestammer
- 1 dag før dyrkning biofilm, fremstilling planktoniske bakteriekulturer ved podning 2 ml passende vækstmedium fra frosset bakteriekultur. Brug Luria-næringsmedium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 gærekstrakt og 10 g L -1 trypton) for mucoid P. aeruginosa og dets Δ PEL og Δ PSL defekte mutanter. Inkuber natten over ved 37 ° C og 200 rpm rystning betingelser. Fortynd overnatskulturer til en OD600 på 0,40 ved anvendelse af et spektrofotometer.
- Saml flowcellen opsætning, som er blevet beskrevet tidligere 14, fortrinsvis på en mobil station eller vogn, der kan bringes i mikroskopet plads til billeddannelse flowcellen uden afmontering.
- Fremstille sterile vækstmedium i 2 L eller 5 liters flasker for hver flowcelle. Brug minimalt medium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH4CI, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO4 og 0,1 mM CaCl2) suppleret med 0,04% glucose (vægt / vol) og 0,2% (vægt / vol) casaminosyrer) for P. aeruginosa biofilm flowcelle.
- Alikvot fluorescerende mikrokugler i mikrocentrifugerør og spin ned i sterilt H2O i 5 min i centrifuge ved 9,391.2 g. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml vækstmedium for at fjerne natriumazid (desinfektionsmiddel) før tilsætning til vækstmediet i 2 L eller 5 L medium flasker.
BEMÆRK: Forskellige størrelser af mikrokugler kommer i forskellige koncentrationer, og skal fortyndes i overensstemmelse hermed til instruktioner. For eksempel dispergere 120 pi 1,0 um mikrosfærer diameter, 15 pi 0,5 um mikrosfærer diameter og 0,96 pi 0,2 um mikrosfærer diameter i 2 L vækstmedium til opnåelse af 2,18 × 10 6 mikrosfærer ml -1 for hver partikelstørrelse. - Vedhæft medium flaske til upstpakke af flow-celle og tillade vækstmedium at flyde gennem hele opsætningen. Stop flow og injicere fortyndet overnatskulturer i flow celle kamre. Tillad bakterier at knytte til dækglasset substrat i 1 time før jævn strøm af vækstmedium ved en strømningshastighed på ca. 5,5 x 10 -3 m sek-1, eller 8 rpm med en peristaltisk pumpe.
BEMÆRK: Biofilm dyrkes sædvanligvis ved stuetemperatur (25 ° C) i 3-7 dage. - Alternativt, for statisk kultur setup, fortyndes overnatskulturer 100 fold i mikrocentrifugerør ved tilsætning af 10 pi overnatskultur til 1 ml vækstmedium med partikler. Øge partikelkoncentrationen i vækstmediet for statisk kultur ved ca. 500 gange sammenlignet med den, der anvendes til flow biofilm (f.eks vaske og resuspender 600 pi 1,0 um kugler diameter i 10 ml vækstmedium) som flowcellen biofilm konstant genopfyldes med partikler, men statiske kulturer er ikke.
- Tilføj 2001 l fortyndet natten kultur med partikler til afdelingerne med 8 såvel dias. Der inkuberes ved 37 ° C under statiske betingelser. Biofilm er normalt dyrkes i 1 dag. Erstat brugt vækstmedium dagligt med frisk vækstmedium med partikler, hvis biofilm dyrkes i mere end 1 dag.
2. Microscopy
- På dag 3 og 5, sluk flow fra peristaltisk pumpe og bringe flowcellen setup ind i mikroskopi rummet. Klemme slange nær indgangen og udgang af flow celle kamre til at forhindre afdrift (en systematisk fejl forårsaget af ændringer i miljøet) fra flow. Anbring flowcellen på mikroskopbordet af en opretstående mikroskop.
BEMÆRK: Brug en omvendt mikroskop til billeddannelse af mikrobrønde. - Brug fluorescerende mikroskopi med 40X målsætning olie til at tage videoer af mikrosfære bevægelse indlejret i biofilmen på forskellige steder (mikrokolonier og flade udifferentierede lag) og i forskellige dage (dag 3 og 5) fortidsmæssige og rumlige undersøgelser. Tag kortere videoer med højere frame rate til at undersøge begivenheder inden for korte tidshorisonter (f.eks 1,5-3 min videoer på billedhastighed på 25-50 billeder i sekundet for hurtige dynamik), og længere videoer med lavere frame rate til at undersøge hændelser over længere tid skalaer (f.eks 15-30 min videoer på frame rate på 2,5-5 billeder / sek for langsommere dynamik).
BEMÆRK: En video indeholder typisk 5-10 partikler, og er typisk af 1,0-2,5 GB i filstørrelse. Større mikrokolonier kan holde flere partikler. Tage 5-10 videoer for hver kategori (f.eks 5-10 videoer af forskellige mikrokolonier og forskellige steder i flade udifferentierede lag). Biofilmen har en heterogen arkitektur, der kan bestå af mikrokolonier, kanaler, tomme rum og flade udifferentierede lag. - Gem videoer i passende format, der kan læses af Fiji / ImageJ (f.eks czi, TIF).
- Tjek videoer for afdrift ved at rulle gennem færdige vidEO og observere, at partiklerne ikke bevæge sig i samme retning på samme tid. Drift kan være forårsaget af z-trins bevægelse, strømme i flowcellen, ubalance af anti-vibration bord, lufttryk eller temperaturændringer. Korrekt mindre drivende hjælp efterbehandling teknikker normalt leveres med mikroskop software. Kassér nogle videoer, hvor afdrift kan ikke rettes. Optag følgende parametre, som er nødvendige i løbet af Particle Tracking Analyse: Opløsning (px / um), antallet af rammer, varighed.
- Fjern flowcellen fra mikroskopbordet og genstart peristaltisk pumpe fortsat dyrkning af biofilm.
3. Particle Tracking Analysis
- Opnå partikel baner ved hjælp af plug-in TrackMate i open source software (ImageJ). Hent Fiji på http://fiji.sc/Fiji. Åbn video med Fiji og under menuen plugins, vælg Sporing og TrackMate.
- Kontroller eller justere indstillingerne i the vindue tyder startindstillinger kalibrering for at matche den video parametre som registreret i trin 2.4.
- Detect partikler i TrackMate hjælp ImageJ.
- Vælg 'Log detektor ", input partikel diameter og tærskelværdien (f.eks 1000). Rul gennem videoen, mens at klikke på 'Forhåndsvisning' for at kontrollere, at de lilla cirkler følger partiklerne i hele videoen. Juster værdier for diameter og tærskel som nødvendigt: øge grænseværdien, hvis lilla cirkler vises i det tomme rum. Reducer tærskelværdien, hvis der registreres ikke nok partikler. Klik på knappen Næste for at færdiggøre afsløring partiklerne.
- Klik på næste knap, når præsenteret med mulighed for at tilføje eller fjerne partikler opdaget i "Initial tærskling ',' Vælg en visning" og "Vælg et filter 'vinduer for at fortsætte uden justering, hvis indledende detektion partikel var tilfredsstillende.
- Vælg 'Simple LAP tracker "i optipå bar af 'Vælg en tracker metode' vinduet som partikler sjældent bevæge sig ud af fokus i biofilmen og er let spores. Brug foreslået eller lav forbinder og hul-lukning max afstandsværdier, og klik næste.
- Kontroller at partikel tracking er tilfredsstillende ved at rulle gennem videoen for at se, at partikler følger sporene tegnet af TrackMate, og at der ikke er uønskede eller manglende spor. Springe de forskellige filtrering trin. Gå til den endelige vinduet 'Vælg en handling «. Vælg 'Eksport spor til XML-fil "fra drop down menuen og klik på' Udfør '. Vælg en mappe til at gemme sporene.
BEMÆRK: Der er forskellige programmer tilgængelige i det offentlige domæne til analyse af partikel baner og brug af microrheology. msdanalyzer og TrackArt er eksempler på partikel sporing analyse programmer, der kører i Matlab miljø.
- Forbered Matlab at importere partikel baner i XML-filer ved at vælge i menuen påMatlab Filer> Indstil sti ... og tilføje scripts mappen tilgængelig med Fiji-pakken.
- At analysere partikel baner med msdanalyzer, hente linket til zip-filen eller tar.gz fil at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- Uddrag afmsdanalyzer mappen 15 og slippe det i en mappe, der hører til Matlab sti (fx C: Documents and Settings <brugernavn> Dokumenter Matlab). Start Matlab og initiere analysatoren ved at skrive:
ma = msdanalyzer (2, "um", "sec")
hvor um og sec er det fysiske rum og tid enheder i videoen.- Importer partikel baner ved at taste:
[spor, MD] = importTrackMateTracks ('FileName.xml', 'clipZ';, 'ScaleT')
ma = ma.addAll (spor);
hvor 'clipZ «fjerner z dimensionen for en 2D-video, og" scaleT «. - Plotte baner onto graf ved hjælp af:
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - Beregn MSDS partiklernes hjælp:
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - Plotte muskel- og skeletbesvær i hver partikel:
figur
ma.plotMSD - Kombiner partikel baner fra andre videoer af samme categery (f.eks partikler indlejret i vildtype mikrokolonier på dag 3) ved at gentage 3.5.1.1 til 3.5.1.4).
- Plot ensemblet middelværdi eller gennemsnittet over alle kurver:
ma.plotMeanMSD
Skift y- og x-aksen fra lineær til logaritmisk skala. Ved lange forsinkelser, de MSD kurverne bliver støjende grundet utilstrækkelige statistikker på længere tidshorisonter. De MSD kurver kan også stige kraftigt som følge af dynamiske fejl. Disse områder af kurven kan fjernes ved hjælp Penselværktøjetat vælge den ende af kurven og vælge 'børstning ">" Fjern unbrushed' i menuen Funktioner.
- Importer partikel baner ved at taste:
- Hent Ezyfit på http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ og føje Ezyfit til en mappe, der hører til Matlab sti (fx C: Documents and Settings <brugernavn> Dokumenter Matlab). Installer-menuen Ezyfit ved at skrive i Matlab arbejdsområde efmenu installere. Genstart MATLAB med Ezyfit menuen i figuren vinduet. Monter MSD kurver til magten loven ved at vælge i Ezyfit menuen 'Vis Fit ">" Power ">" a * x ^ n' var n er den anslåede diffusiv eksponent α.
BEMÆRK: msdanalyzer kræver kurvetilpasning Toolbox i Matlab til montering af MSD kurver. Ezyfit er en alternativ og gratis software, der kan udføre kurvetilpasning. - Klare aktuelle partikel baner og muskel- og skeletbesvær at beregne nye partikel muskel- og skeletbesvær på andre placeringer eller tid:
klar Efter beregning af forskellige gennemsnitlige MSD kurver af partikler i mediet (kontrol) og mikrokolonier og udifferentierede områder af forskellige stammer, kopiere og indsætte kurver i ét diagram til sammenligning. Prøve stivhed og tværbinding stigning med lavere MSD værdier. Flade kurver har lavere α og prøve er mere elastisk end stejlere kurver med højere α. - Vælg kurven og gå til "Funktioner" for at se på statistikken data, såsom median og interval. MSD af perlen er proportional med krybning overholdelse, J (t), i det materiale, hvori vulsten er indlejret ifølge relationen,
hvor J = krybning overholdelse, d = partikeldiameter, k B = Boltzmans konstant, T = temperatur og t = tid.
- Uddrag afmsdanalyzer mappen 15 og slippe det i en mappe, der hører til Matlab sti (fx C: Documents and Settings <brugernavn> Dokumenter Matlab). Start Matlab og initiere analysatoren ved at skrive:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lokale viskoelastiske egenskaber af biofilm i forskellige områder af biofilm, som omfattede hulrummene (medium ovenfor biofilmen), sletter (udifferentieret fladt lag af celler) og mikrokolonier (se etiketter i figur 2A) blev undersøgt. De tidsmæssige ændringer i viskoelastiske egenskaber af biofilm under modning fra dag 3 til 5 blev også bestemt. MSD af partiklerne i hulrummene blev anvendt som en kontrol og sammenlignes med MSD af partikler i ren medium. I modsætning hertil partikler fanges i biofilmen vibreres ved faste positioner, og MSD værdier varierede fra dem typiske for viskoelastiske materialer til stærkt elastiske geler (figur 3).
Mucoid P. aeruginosa vildtype og dens Δ PEL mutantstammer (figur 2A og 2B) udviklede mikrokolonierne spredt på en tynd almindeligt ved dag 3 i deres biofilm. Sletten på dag 3 var for tynd tilundersøgelse af reologiske egenskaber. I begge biofilm dannet af mucoid P. aeruginosa vildtype og Δ PEL stammer, MSD af partikler i dag 3 mikrokolonier var uafhængig af tid for tidsforskydninger på 0,1 sek til 10 sek (α = 0), hvilket indikerer, at mikrokolonier var elastiske (figur 4, tabel 1) . De mediane krybe overholdelse beregnet ud fra de tilsvarende partikel muskel- og skeletbesvær var 4,3 x 10 -2 Pa -1 og 3,6 x 10 -2 Pa -1 hhv. Ved dag 5 af krybning overensstemmelse mellem de mikrokolonier i mucoid P. aeruginosa vildtypestamme steg til 2,5 x 10 -1 Pa -1, hvilket indikerer en reduktion i effektiv tværbinding i matrixen. Dagen 5 mikrokolonier var stadig elastisk med α = 0. Δ pel ikke ændre i reologi fra dage 3 til 5. sletterne i mucoid P. aeruginosa vildtype- og A PEL stammer var Similar i elasticitet (α = 0) og effektiv krydsbinding til dag 3 mikrokolonier, som kunne være reflekterende af deres modenhed (udifferentierede struktur).
Biofilm dannet ved Δ PSL mutant stamme (figur 2C) var mindre differentieret og forsinket i udvikling. Dette resulterede i biofilm med tykke sletter, der udviklede mikrokolonier efter dag 3. MSD-værdier viste, at biofilm var meget mindre effektivt tværbundet end P. aeruginosa vildtype- og A PEL-stammer (figur 4, tabel 1). Sletterne var viskoelastiske, med α = 0,12 og 0,26 på dag 3 og 5. Den mediane krybe overensstemmelse dag 3 og 5 sletterne var 1,0 Pa -1. Når mikrokolonier havde udviklet i dag 5 havde krybning overholdelse faldt til 2,8 x 10 -1 Pa -1, hvilket indikerer, at en tærskelværdi tværbinding er påkrævet for mikrokoloni differentiering. However, at krybe overholdelse var stadig større end krybe overensstemmelse yngre dag 3 mucoid P. aeruginosa vildtype- og Δpel mikrokolonier. Dagen 5 mikrokolonier var viskoelastisk med α = 0,34. Således P. aeruginosa biofilm er elastisk og stærkt tværbundet i fravær af Pel. I mangel af Psl, biofilmen blev viskoelastiske og mindre tværbundet. I de modne biofilm strukturer såsom mikrokolonier, udtryk for både Pel og PSL exopolysaccharider resulterede i distinkte reologiske forskelle over tid. Reduktionen i tværbinding kan skyldes reduktionen af Psl til Pel exopolysaccharider i biofilm matrix under modning.
Figur 1:. Partikel sporing microrheology i en biofilm (A) Grå cirkler afbilder partikel MSD i en viskøs substans, som vokser lineært med tiden ogα = 1. sorte trekanter skildrer partikel MSD af et elastisk stof, som er uafhængig af tid og a = 0. (B) Diagram over probe partikel vibrerer i EPS biofilmen. Partiklen er modelleret som en bakteriecelle og svarer i diameter. De matrixpolymerer, der indhyller partiklen er meget mindre end partiklen.
Figur 2: P erspecti v e og sektionsopdelte vi e w af d en y 5 biofilm (grøn) b y con f ocal microsco p å efter conti n overflødig < strong> f eeding med 1,0 μ m (lilla), 0,5 μ m (rød) og 0,2 μ m (orange) pa R tikler med negativt ladet carboxyleret overflade. Biofilm dannes ud fra (A) mucoid P. aeruginosa og mutanter (B) Δ pel og (C) Δ PSL stammer. Partikler er inkorporeret i alle regioner i biofilmen. Eksempler på mikrokolonier, sletter og hulrum er mærket i (A). Modificeret fra Chew et al., MBio 2014 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
fig3.jpg "/>
Figur 3:. Partikelbaner Sammenligning af et spor af en partikel udfører Brownsk bevægelse i vækstmedium (flerfarvede) sammenlignet med spor af partikler vibrerende i biofilm mikrokolonier (mørkeblå). De segmenterede farver indikerer pauser i sporing på grund af partikel bevæger sig ud af fokus i z-planet.
Figur 4:. Skeletbesvær på 1,0 um partikler i biofilm mucoide P. aeruginosa er elastisk og mikrokolonierne er reduceret i effektiv tværbinding fra dag 3 til 5; Δ pel er elastisk og ændrer ikke i rheologi fra dag 3 til 5; Δ PSL er viskoelastiske og består hovedsageligt af sletter, der ikke ændrer væsentligt i reologi fra dage 3.-5.
| Strain | Dag | Region </ td> | Median Creep Compliance (Pa -1) |
| vild type | 3 dagen | Mikrokoloni | 4.3 x 10 -2 |
| vild type | 5 dage | Mikrokoloni | 2,5 x 10 -1 |
| vild type | 5 dage | Almindeligt | 4.1 x 10 -2 |
| Δpel | 3 dagen | Mikrokoloni | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dage | Mikrokoloni | 3,6 x 10 -2 |
| Δpel | 5 dage | Almindeligt | 3,2 x 10 -2 |
| Δpsl | 3 dagen | Almindeligt | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dage | Almindeligt | 1,0 x 10 0 |
| Δpsl | 5 dage | Mikrokoloni | 2,8 x 10 -1 |
Tabel 1: Median krybe overensstemmelse og skønnede diffusive eksponenter for vildtype og mutant stammer efter biofilm alder og region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microrheology er et nyttigt værktøj for lokale reologiske målinger i heterogene systemer, såsom mikrobielle biofilm. Det er en ikke-destruktiv teknik, der gør det muligt realtidsovervågning af rheologiske ændringer inden for samme biologiske prøve over flere tidspunkter. I denne protokol, blev partikel-sporing microrheology anvendt på Pel og PSL exopolysaccharid- mutanter for at undersøge, hvordan de påvirker elasticitet og effektiv krydsbinding af biofilmen matrix. PSL fremmer udviklingen af elastiske biofilm med høj effektiv tværbinding, mens Pel favoriserer viskoelastiske og løsere biofilm. Når begge exopolysaccharider produceres, bliver de biofilm mikrokolonierne mindre effektivt tværbundet som biofilmen modnes, i overensstemmelse med et fald i Psl i Pel.
Biofilm dannet af forskellige bakteriearter har distinkte EPS sammensætninger. EPS mucoid P. aeruginosa stammer anvendt i denne undersøgelse primært arrangemen m af exopolysaccharider 16. Andre arter kan bruge store ekstracellulære adhæsionsproteiner 17 og DNA 18 som deres vigtigste komponenter i EPS. Den her beskrevne fremgangsmåde kan bruges til at bestemme det rheologiske bidrag fra andre EPS komponenter og deres virkning på vækst. Desuden kan biofilm dyrket i forskellige opsætninger har drastisk forskellige fysiske egenskaber, der påvirker deres rheologi. For eksempel mucoid P. aeruginosa suppleret med glukose danner mere biofilm med yderst differentierede strukturer under flow i forhold til statiske forhold. Undersøgelser har også vist, at biofilm udsat for shear stress, såsom flow gør biofilm mere sammenhængende og elastisk 19,20. Vigtige skridt og faktorer til at overveje for en vellykket biofilm partikel-sporing microrheology undersøgelse er som følger:
Systemet dimensioner for efterforskning eller omfanget af interesse med hensyn til tid og rum
indhold "> Når man overvejer rumlige skalaer, må man overveje størrelsen af de strukturer, der giver anledning til de viskoelastiske egenskaber af systemet (i vores tilfælde, polymererne af biofilm matrix) bør. Polymererne omgiver sonden partikel være meget mindre i struktur end partiklen og præsentere en isotropisk miljø til partiklen. Høj opløsning billeddannelse er forpligtet til at fange små partikler bevægelse eller vibrationer, men vil reducere mængden af areal afbildet for tilsvarende filstørrelse. Når man overvejer tidsmæssige skalaer, elastiske biofilm, der udviser langsom dynamik kræver at tage videoer over længere tidsskalaer (f.eks hr) og bruge lave frame rates (fx min). Kortere videoer kan tages for viskoelastiske biofilm med hurtige dynamik (min), men kræver højere frame rates (sek eller millisekunder). Brug egnede opløsning, frame rate, video varighed for hvert forsøg vil holde filstørrelser lav for medgørlig analyse.Biofilm viskoelasticitet, hanterogeneity og dimensioner
Partikel bevægelse kan være målbart i meget elastiske biofilm (MSD <10 -4). I sådanne tilfælde aktive microrheological teknikker, der gælder kraft til at forskyde partiklen er at foretrække. Rheologisk prøvetagning af forskellige områder af biofilm bør gøres for at sikre den mekaniske heterogenitet biofilmen er fanget. Heterogen morfologi, er imidlertid ikke nødvendigvis en god indikator for mekanisk heterogenitet, som på trods af homogene optrædener biofilmen kan være kompleks i reologi: Δpsl biofilm er mere homogene i morfologi og forsinket i differentiering, men har en kompleks og heterogen rheologisk profil. I modsætning hertil Δpel biofilm har en heterogen udseende med veldifferentierede mikrokolonierne men en konstant rheologi hele biofilmen. For biofilm med store mikrokoloni dimensioner (f.eks> 50 um i diameter og højde), kan det være meningsfulde sgelse reologiske forskelle afhængig højden (top og bund af mikrokolonier), eller afstanden fra mikrokoloni kant.
Udvælgelse af probe partikler
Som beskrevet ovenfor bør størrelsen af partiklerne være større end strukturerne af de materialer, der giver anledning til sine viskoelastiske egenskaber. Desuden kan partikler med forskellig overfladekemi resultere i binding til forskellige områder og EPS komponenter inden biofilmen. Således bør undersøges effekten af partikler med forskellig overflade kemi, så biofilm heterogenitet kan overvejes. Alle probe partikler bør have en høj zeta potentiale til at minimere agglomerering. Partikler, der binder sammen, kan ikke bruges som nøjagtige sonder og bør udelukkes fra analysen.
Minimering af afdrift
Drift kan være forårsaget af temperatur eller luft trykændringer, mikroskop bordbevægelse (normalt i z-retningen), anti-vvibrationerì tabel ubalance og intern strømning i systemet. Driver normalt resultere i superdiffusion af partiklen og α> 1. En α> 1 indikerer, at andre end termisk energi, aktive processer er involveret i bevægelse partikel og passiv microrheology er ikke relevant.
Korrekt biofilm kultur vedligeholdelse
Flow celler skal samles korrekt for at undgå lækager og biofilm skal holdes fri for urenheder. Biofilm kan også dyrkes i andre opstillinger alternativ til flowcellen, såsom dias og mikrobrønde for statiske dyrkningsbetingelser. Et omvendt mikroskop bør anvendes til billeddannelse af mikrobrønde.
Sammenfattende partikel sporing microrheology er en nyttig teknik, der kan anvendes ved hjælp af mikroskoper standard til en biologisk laboratorium. Desuden programmer involveret i beregning og analyse af partikel muskel- og skeletbesvær er let tilgængelige i det offentlige domæne.For eksempel msdanalyzer og TrackArt 21 (http://www2.sbs.ntu.edu.sg/staff/rskraut/index.php/trackart) er programmer, der kører i Matlab miljø. Men fordi teknikken kun er afhængig termisk energi til at bevæge partiklerne, ikke er i stand til at løse mellem prøver af højere elasticitet. Aktive teknikker, såsom magnetiske pincet, påføres en kraft på partiklen til at handle på og bevæge sig inden prøven og ville være i stand til at bestemme viskoelasticitet højelastisk prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskning er støttet af Grundforskningsfonden og Undervisningsministeriet Singapore under dens Research Centre of Excellence program, start-up Tilskud (M4330002.C70) fra Nanyang Technological University, og AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) fra Undervisningsministeriet, Singapore. Forfatterne takker Joey Yam Kuok Hoong for at deltage i demonstrationen af denne protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Needle | Terumo | ||
| 2 L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A.
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
